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1、CRISPR-Cas 9,目標基因操作技術(shù),術(shù)語解釋,1 crispr:群集regularly interspaced short palindromic repeat sequences群集,規(guī)則間隔的短回文重復2 cc宿主細胞基因組藥物分子有效果目標組織或細胞的定向轉(zhuǎn)移或作用。根據(jù)CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn),1 CRISPR-Cas特別識別入侵許多細菌和大部分古生菌天然免疫系統(tǒng)的病毒和核酸,利用Cas蛋白進行切割,達到自身免疫。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細胞以間隔素決定的外源DNA特異性免疫。在宿主防御噬菌體攻擊中,細菌對自然界龐大的噬菌體群體進化出了CRISPR介導的適應免
2、疫。牙齒免疫功能的發(fā)揮是通過添加或刪除CRISPR間隔序列的動態(tài)變化,即間隔。CRISPR-Cas概述,CRISPR-Cas:一種茄子來源是細菌獲得免疫的RNA引導Cas蛋白,修飾目標基因的技術(shù)。CRISPR-Cas概述,CRISPR-Cas主要由兩部分組成。標識CRISPR位通常為2148 BP長度,重復序列由短而保守的重復序列(以2672 BP間隔序列(spacer)分隔)組成。CRISPR是通過這些間隙序列和目標基因識別的。Cas家族,CRISPR associated(Cas):在CRISPR部位附近的雙鏈DNA核酸酶,在guide RNA的引導下,可以切割靶部位。它類似于滑石粉酶功能
3、,但不需要形成二聚體。(阿爾伯特愛因斯坦、美國電視電視劇(Northern Exposure,Northern Exposure)、Cas分類、Cas基因多樣性非常豐富,因此簡單的分類是動員但功能不相關(guān)的30多個Cas蛋白質(zhì)研究小組考慮了若干茄子因素,包括保守的Cas蛋白質(zhì)之間的進化關(guān)系和Cas基因操作員的組成方式第一級主要是對外。第二個級別主要是識別和分解初級CRISPR RNA成熟和入侵的外源遺傳物質(zhì),可以將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為三種茄子類型:Type、Type和Type。Cas 9,Type系統(tǒng)的主要特征是包含代表性的CAS9蛋白質(zhì)(分子質(zhì)量大的多功能蛋白質(zhì))。Cas9蛋白包含兩個
4、功能域,一個在N端,一個與Ruc核酸酶具有相似的活性,一個在中部具有與HNH核酸酶類似的活性。隱性鏈球菌具有典型的Type CRISPR/Cas系統(tǒng),CRISPR/Cas系統(tǒng)對trans-activating crRNA(tracrRNA)進行編碼,指導RNase和Cas9完成燈泡crRNA的成熟。然后,tracrRNA可以與成熟crRNA的重復序列配對,形成RNA二聚體,與Cas9蛋白結(jié)合成核糖核蛋白復合體,發(fā)揮識別和分解入侵的外源DNA功能36,CRISPR-Cas9原理。牙齒系統(tǒng)的運作方式是crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基對與trans-activating R
5、NA(TRAC RNA)結(jié)合,形成TRAC RNA/crRNA復合物,誘導核酸酶Cas9蛋白以RNA為導向的dsDNA結(jié)合蛋白Cas9效應核酸酶是第一個能夠攻克RNA、DNA、蛋白質(zhì)的統(tǒng)一因子,具有巨大的改造潛力。可以將蛋白質(zhì)與沒有核酸酶的Cas9(Cas9核酶-空)融合,表達適當?shù)膕gRNA,以所有dsDNA序列為目標,sgRNA的末端可以連接到目標DNA,而不會影響Cas9的結(jié)合。因此,Cas9可以從所有dsDNA序列中帶來融合蛋白和RNA,這給生物體的研究和改造帶來了很大的潛力。應用,基因敲除動物模型一直是在活動物上進行基因功能研究,尋找適當藥物作用目標的重要工具。但是傳統(tǒng)的基因敲除方法
6、需要經(jīng)過復雜的目標向量構(gòu)建、ES細胞篩選、嵌合鼠標選育等一系列階段,程序繁瑣,對技術(shù)的要求高,不僅成本高,時間長,成功率也受到多種茄子因素的限制。即使在技術(shù)比較成熟的實驗室,利用傳統(tǒng)技術(shù)構(gòu)建基因敲除、老鼠通常也需要一年以上的時間。2 2013年1月,美國兩個研究所在科學雜志上發(fā)表了基于CRISPR-Cas9技術(shù)的細胞株基因敲除的新方法。與以前的技術(shù)不同,牙齒技術(shù)利用目標特異性RNA將Cas9核酸酶引入基因組的特定目標,切割特定基因部位,使其突變。牙齒技術(shù)迅速應用于基因敲除小鼠和松鼠動物模型的構(gòu)建。通過一系列研究,首先通過RNA注射將CRISPR-Cas系統(tǒng)導入大鼠受精卵,證明在胚胎中發(fā)生點突變
7、比DNA注射更有效。在此基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)牙齒方法沒有老鼠遺傳系統(tǒng)的限制,可以刪除大塊基因組DNA,同時注射不同基因的RNA序列,從而達到在同一老鼠或老鼠上引起多個基因突變的效果。另外,事實證明,利用CRISPR-Cas技術(shù)制作的基因敲除大鼠模型與傳統(tǒng)方法制作的相同基因(肥胖相關(guān)G蛋白結(jié)合受體Mc4R)突變大鼠相比,具有一致的表現(xiàn)形式。用牙齒方法制作的基因突變動物具有比現(xiàn)有方法高得多的生殖系統(tǒng)遷移能力,是建立可靠、高效、快速挖空動物模型的新方法。2 CRISPR-Cas技術(shù)要求鋅脂核酸酶(ZFN)、ES細胞目標、RNA目標序列和基因組序列完全一致,這樣Cas9才能切割DNA。2、可以同時敲目標基因的多個部位。3.實驗周期短,最多只需2個月,可以節(jié)省很多時間和金錢。4.無宗限制缺點:牙齒系統(tǒng)是否有脫果效果需要進一步研究。視頻,crispr cas 9,再見。