熒光定量PCR 法原理匯總

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1、我們前面比較詳細地介紹了熒光染料法做定量PCR的有關技術和產(chǎn)品,顯然， 作為定量PCR的初期階段的熒光染料法還是有局限性的，比如，由于染料不能區(qū) 分特異性PCR產(chǎn)物和引物二聚體等非特異產(chǎn)物，也不能區(qū)分不同探針，所以檢測 的特異性始終不如后來出現(xiàn)的探針法；需要在PCR后進行熔鏈曲線分析；也不能 做多重PCR檢測(Multiplex)。 上個世紀90年代原美國Perkin Elmer( PE)公司開發(fā)出了 Taqman熒光探針 定量技術，將定量PCR帶入了更廣闊的應用空間。Taqman探針法的出現(xiàn)是定量 PCR技術的重要里程碑，之后在此基礎上發(fā)展出了雜交探針法，以及熒光引物法， 是對探針法的不斷

2、改進和簡化。如果希望全面掌握定量PCR技術的研究人員就不 能錯過這些定量檢測技術。 要提到熒光探針或者熒光引物，有一個基礎概念需要首先明確，那就是熒光 共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 一對合適的 熒光物質(zhì)可以構成一個能量供體 (donor) 和能量受體 (acceptor) 對, 其中供 體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊，當它們在空間上相互接近到一定距離 (1—10 nm)時，激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光能量正好被附近的受體吸收，使得供體發(fā) 射的熒光強度衰減，受體熒光分子的熒光強度增強。能量傳遞的效率和供體的發(fā) 射光譜與受體的

3、吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對取向、供體 與受體之間的距離等有關。定量PCR所涉及的熒光探針和熒光引物的檢測都這個 FRET原理相關。 實時熒光PCR中另一個很重要的概念，即Ct值.C代表循環(huán)(Cycle)，T代表 閾值(Threshold).Ct值是指每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷 的循環(huán)數(shù)?。一般取PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光 閾值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。研究表明，每個模 板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值 越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可做出標準曲線?因此，

4、只要獲得未知樣品 的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 一：水解探針法 TaqMan 技術 原理：除了一對特異性引物，TaqMan探針法增加一條和模版互補的基因 特異性探針（通常20—30bp）,探針上5'端和3'端分別標記了一個報告熒 光基團（供體）和一個淬滅熒光基團（受體），在反應初始（探針完整） 時系統(tǒng)激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光信號被臨近的淬滅基團吸收，所以此時檢測 不到供體熒光信號；而當PCR過程中Taq DNA聚合酶擴增到探針結合模 版的位點時，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探針5' 端的報告基團——游離的報告基團遠離淬滅基團，打破能量的傳遞，激

5、發(fā) 報告基團產(chǎn)生的熒光信號就可以被熒光檢測系統(tǒng)檢測到。這樣每擴增一條 DNA鏈，就對應有一個游離的熒光分子（報告基團）形成，保證了熒光信 號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步，因此對熒光信號進行檢測就可以實 時監(jiān)控PCR的過程，準確定量PCR的起始拷貝數(shù)。但是實際上探針較長 使得兩端基團距離較遠，會導致熒光淬滅不徹底，而且淬滅基團也會產(chǎn)生 不同波長的熒光，都會使得本底偏高. MGB原理：針對Taqman探針熒光淬滅不徹底的問題，2000年美國ABI公司 技術 推出了一種新 TaqMa n探針 MGB探針（mi nor groove bin der oligodeoxynucleotide

6、conjugate, MGB-ODN）， 3'端采用了非熒光性 的淬滅基因——淬滅基團吸收報告基團的能量后并不發(fā)光，大大降低了本 底信號的干擾。此外， MGB 探針的3'端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉- 三肽（dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3）可以大大穩(wěn)定探針 與模板的雜交, 升高探針 Tm 值, 使較短的探針同樣能達到較高的 Tm 值——而短探針的熒光報告基團和淬滅基團的距離更近, 淬滅效果更好， 熒光背景更低，使得信噪比更高：一個15bp的MGB探針的信噪比大于 6,優(yōu)于理想狀態(tài)下的25bp的普通Taqman探針（信噪比約為1.5）。允許 采用

7、更短的探針也簡化了探針的設計和成本。有實驗證明 MGB 探針對于 等位基因的區(qū)分比較理想，甚至可以檢測單堿基突變（因為堿基錯配對較短 探針的雜交穩(wěn)定性影響更大） 水解探針之所以稱之為水解，主要是因為它利用的是Taq酶的水解作用，使得 探針上的熒光報告基團遠離淬滅基團而發(fā)光信號，游離的報告基團數(shù)目對應 PCR 新擴增產(chǎn)物，此方法檢測的是積累熒光。 優(yōu)點： 靈敏，特異性高：具有模版序列特異的Taqman探針在引物特異的基礎上進一步 提高的定量PCR的專一性；每擴增一個特異產(chǎn)物只釋放一個分子的熒光染料，儀 器檢測的是特異擴增的結果，非特異產(chǎn)物對檢測信號沒有影響，有效提高檢測的 專一性。 有多

8、種不同波長的熒光基團對可供選擇，使得Taqman探針法可以實現(xiàn)在同一管 內(nèi)檢測多重PCR，降低成本也提高效率和準確性 避免了熒光染料對PCR反應的影響 缺點：探針設計有一定難度，需要驗證效果，探針的合成和雙熒光標記成本高 此外，也有人認為，Taqman法利用了 Taq酶的外切活性，而由于各家公司 出產(chǎn)的Taq酶對于其外切酶活性并沒有做出嚴格的活性標定，定量PCR的效率有 可能受酶外切活性的影響，酶活性差異也給定量帶來了不確定性。至少，生物通 定量PCR技術系列前面介紹的Stratagene 2100萬美元專利之爭的Fullvelocity DNA聚合酶由于去掉外切酶活性，就不能用于Taqma

9、n探針法了！ 應用：Taqman技術廣泛應用在人類傳染病診斷和病原定量上，在動物疾病病原 體基因的檢測、畜禽產(chǎn)品的檢驗檢疫、生物制品的鑒定以及在疫苗效力測定上等 方面都有成功的許多例子。 注意：1）探針長度應在15-45bp （最佳20-30bp）左右，以保證結合的特異性。2） GC堿基含量在40%-60%，避免單核苷酸序列的重復。3）避免與引物發(fā)生雜交或 重疊。4）探針與模板結合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結合的穩(wěn)定程度,因此探 針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5°C。另外，探針的濃度，探針與模板序列 的同源性，探針與引物的距離都對實驗結果有影響。另外，在儀器的選擇上也要 注意，盡量選擇

10、具有4色或以上的熒光檢測通道的儀器，已保證你的機器的適用 性和試劑選擇的靈活性。畢竟技術是在快速發(fā)展的。 二：雜交探針法 FRE原理：羅氏專利的FRET探針又稱為雙雜交探針，或者LightCycle探針。 FRET技術 探針由兩條和模版互補、且相鄰的特異探針組成（距離1—5bp）,上游探 針的3'端標記供體熒光基團，相鄰下游探針的5'端標記Red 640受體熒 光基團。當復性時，兩探針同時結合在模板上，供體基團和Red640受體 基團緊密相鄰（距離1—5bp）,激發(fā)供體產(chǎn)生的熒光能量被Red640基團 吸收，使得檢測探頭可以檢測到Red640發(fā)出波長為640的熒光。當變性 時，兩探針游

11、離，兩基團距離遠，不能檢測至640波長的熒光。FRET探針 檢測的信號是退火時的實時信號，每次檢測信號始終嚴格對應模版的數(shù)量， 非累積信號，可以用于做Tm曲線和SNP檢測。常用的受體熒光基團除了 LC-Red640還有LC-Red705。兩個單標記探針的長短不影響信號的傳 遞，而探針間的距離通常為1-5bp （雖然越短越好，還是要留點空間避免 相互之間的反應）。 我們前面提到，Taqman水解探針法中，一但報告基團水解離開淬滅基團，就 一直游離于反應體系中可被檢測，所以檢測的是累積熒光，是不可逆的。雜 交探針不同，是復性時兩條特異探針雜交到模板上，相互靠近而產(chǎn)生檢測信 號，到升溫變性探針遠離

12、模版就沒有信號，所以檢測的是實時信號，是可逆 的，所以可以進行熔解曲線的分析，還可以用于進行突變分析，SNP基因分 型以及產(chǎn)物鑒別。比如一旦探針位置上出現(xiàn)有點突變，通過熔解曲線就可以 很快分析出來，這也是Taqman法無法做到的。另外，由于采用2條模版特異 的探針，雜交探針法的專一性無疑更高于其他方法，不受非特異產(chǎn)物的影響。 Fret探針法由于需要合成2條探針，探針的末端要封閉以避免反應，所以合 成的成本會比較高，也比較麻煩。但實 際 上，F(xiàn)ret探針的設計其實比Taqman 探針容易，因為Taqman探針要求一定的長度以保證探針的特異性和結合模版的 能力，但是長度會導致兩末端的熒光基團距離

13、遠而使得熒光共振能量傳遞的效率 降低，淬滅不徹底。Fret探針就不受這個限制。不管怎么說，多數(shù)人還是習慣 認為單探針比合成2條探針要簡單。 在水解和雜交探針技術之間產(chǎn)生另外一種技術：分子信標（分子信標產(chǎn)生時 間是1996年） 分子信標技術 原理：分子信標（Molecular beacon，MB）是一種呈發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標 記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標記在一端的熒光基團與標 記在另一端的淬滅基團緊緊靠近。熒光基團被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬 滅，由熒光基團產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。 分子信標的莖環(huán)結構中，環(huán)一般為15-30bp （有人認為18-20個bp

14、較好）長, 并與目標序列互補，莖一般5-7bp長（GC含量較高），相互配對形成莖的結 構。熒光基團標記在探針的一端，而淬滅劑則標記在另一端。在復性溫度下， 因為模板不存在時形成莖環(huán)結構，當加熱變性會互補配對的莖環(huán)雙鏈解開，如 果有模板存在環(huán)序列將與模板配對。與模板配對后，分子信標將成鏈狀而非發(fā) 夾狀，使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發(fā)時，淬滅作用被解除， 發(fā)出激發(fā)光子。 應用：應用于基因定量分析和突變體識別、疾病基因檢測與診斷、單核苷酸多 態(tài)性（ single nucleotide polymorphism , SNP） 分析等生物醫(yī)學基礎和臨 床研究中。 優(yōu)點：本底低，特異靈敏

15、 缺點：①雜交時探針不能完全與模板結合，因此穩(wěn)定性較差。 ② 探針合成時標記較復雜 延伸技術：建立在分子信標技術基礎上的探針技術有Amplifluor、Sunrise、 Amplisensor、 Scorpion 等，其中 Sun rise技術，這一方法的特點是所有的擴增產(chǎn)物均能標記上熒光分子，因此 熒光信號響應快，但無法區(qū)分特異和非特異擴增是其致命的不足。 Amplisensor 技術是一種復合探針技術，一個探針上連接一種熒光物，另一 探針連接一淬滅物。兩探針長度不同，其中淬滅物標記探針5'端多出7個堿 基（GCGTCCC）。PCR擴增前需將熒光物標記探針與一個半套式PCR引物 連接

16、， PCR 引物的5'末端應有一段與長探針互補的序列，以便連接酶將該引 物與短探針連接。擴增時該探針－引物復合物作為半套式引物摻入到模板，從 而釋放出淬滅探針部分，破壞了 FRET，而產(chǎn)生熒光。 Scorpion 技術（蝎形引物）則是通過在分子信標的3'端設計連接臂連接一 段引物，使 PCR 延伸反應時不能夠延伸至分子信標，這樣非特異擴增產(chǎn)物便 無熒光信號。包含發(fā)夾結構的PCR產(chǎn)物在退火時形成分子內(nèi)雜交，發(fā)夾結構 被破壞，兩個基團之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從而發(fā)出熒光。這種方法可以 解決非特異的問題，同時靈敏度高，反應快，已應用于k-ras及BRAC2基因 的突變分析了，但這種方法不能保證雜

17、交時探針與模板完全匹配，而且合成復 雜。 這種技術雖然也是積累熒光（因為結合上模板以后不會掉下來），但是不同于 Taqman 水解探針，分子信標可以進行溶解曲線分析，這也就是說分子信標可以 進行包括突變檢測，SNP檢測等在內(nèi)的定量PCR延伸應用。但是這種技術正如上 面提到的探針設計復雜，穩(wěn)定性差——而這一點對于溶解曲線的影響頗大，因此 在應用上也需要審慎考慮。 第三代：熒光引物 Ampl原理：激發(fā)的熒光進行分子能量轉(zhuǎn)移到受體成分導致熒光發(fā)射的淬滅。目 ifluor標特異性Amplifluor引物包含一個5'內(nèi)部互補序列，標記有熒光發(fā)色 技術 團（fluorescerin）和一個能量受體：

18、4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。 發(fā)夾結構的3'端序列是目標特異性引物區(qū)。未結合的Amplifluor引物 由于內(nèi)部熒光發(fā)色團和淬滅分子的緊密接近，只有低的熒光信號。 在第一個循環(huán)中，Amplifluor引物1與特異CDNA的第一條鏈退火并被 Taq酶延伸。在第二個循環(huán)中Amplifluor引物1延伸產(chǎn)物作為引物2 （反 義鏈引物）的模板。一旦引物2被Taq酶延伸，Amplifluor發(fā)夾引物解 折疊并產(chǎn)生熒光信號。隨后的擴增循環(huán)中產(chǎn)生的熒光信號的增強與擴增產(chǎn) 物量的增加成比例。 LUX 原理：LUM（light upon extention）引物技術是 Invitrogen

19、公司的一 技術 項專利，是利用熒光標記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術。使用類似分子信 標的發(fā)夾結構設計引物，使引物同時起到熒光探針的作用。引物對中的一 個引物3'端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自 身配對，形成發(fā)夾結構，使熒光淬滅。在模板存在的情況下，引物與模板 配對，發(fā)夾結構打開，產(chǎn)生熒光信號。使用LUX引物，不需要專門設計 探針，即省了成本又給實驗設計提供了寬松的條件。由于沒有探針控制特異性，因此他的特異性要弱于探針技術，但非特異性擴增或引物二聚體沒 有影響，所以其特異性要強于 SYBR GREEN。 SYBR GREEN FRET 探 針 Taqma n

20、分子信標 LUX引物 性質(zhì) 可逆熒光 積累熒光 熔點 分析 能 不能 特異 性 引物（非 特異性 擴增或 引物二 聚體有 影響） 引物+2 探針 引物+探 針 引物+探 針 引物（非特異 性擴增或引物 二聚體無影 響） 探針 不需要 需要 需要 需要 不需要 通用 性 通用 專用 專用 專用 專用 看完這些方法，相信新近接觸定量 PCR 的人就已經(jīng)覺得眼花繚亂了，其實雖然以 上這些檢測技術有許多，但是實際上在商品成熟應用上并不是有這么多豐富的選 擇，具體的優(yōu)良產(chǎn)品篩選請見： 定量PCR經(jīng)典之選——Taqman探針 定量檢測精靈——熒光引物 中國的PCR——達安