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1、《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段》教學(xué)設(shè)計
教學(xué)目標(biāo)
（一）知識與技能
1、了解PCR技術(shù)的基本操作
2、理解PCR的原理
3、討論PCR的應(yīng)用
（二）過程與方法
在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段的實驗過程中，應(yīng)避免外源DNA污染，嚴(yán)格控制溫度等反應(yīng)條件
（三）情感、態(tài)度與價值觀
通過對PCR實驗的操作及結(jié)果分析，培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和實事求是的科研精神
教學(xué)重難點
教 學(xué)重點：
PC R的原理和PCR的基本操作
教學(xué)難點：
PCR的原理
教學(xué)工具
多媒體
教學(xué)過程
（一）引入新課
在現(xiàn)代生物技術(shù)中，DNA技術(shù)可謂是尖端技術(shù)。人類基因組計劃、基因工程、基因診
2、斷、基因檢測、古生物鑒定等都離不開對DNA分子堿基序列的分析。而分析DNA堿基序列，就需要一定量的DNA片段。怎樣迅速獲得足夠量的DNA片段呢？今天我們來研究學(xué)習(xí)DNA分子的擴(kuò)增技術(shù)――PCR技術(shù)。
（二）進(jìn)行新課
1．基礎(chǔ)知識
PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的過程，與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程類似：
1．1細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析：
1．2細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程
（1）DNA的反向平行結(jié)構(gòu)：（結(jié)合投影圖）
核苷酸分子的結(jié)構(gòu)與方向性：（分子結(jié)構(gòu)模式圖）
由核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長鏈：（模式圖，體現(xiàn)方向性）。
DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的反向平行結(jié)構(gòu)：
（2）DNA的復(fù)制過程:
3、
解 旋：解旋酶、ATP，DNA兩條鏈打開，，形成兩條DNA單鏈。
引物結(jié)合：在DNA單鏈3’端與DNA反向配對結(jié)合，確保引物3’端與DNA單鏈準(zhǔn)確配對。
DNA聚合酶結(jié)合：
子鏈合成：DNA聚合酶從引物3’端開始，將配對的脫氧核苷酸連接起來。
后續(xù)加工：DNA聚合酶I將引物切去，并合成空缺處的DNA單鏈，再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來（半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈，滯后鏈）
子鏈合成特點：不能從頭合成；合成方向為“5’→3’合成”。
感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成，還具有校對功能。它在每引入一個核苷酸后都要復(fù)查一次，只有堿基配對無誤后才能繼續(xù)
4、往下聚合，它不能從頭合成。RNA聚合酶沒有校對功能，因此RNA的合成不需要引物，而是從頭合成的，它的錯配可能性較大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I刪去，代之以高保真的DNA鏈。
［思考］DNA分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些？
DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供模板；堿基互補配對；DNA聚合酶的復(fù)查功能。
［思考］細(xì)胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的？RNA合成、蛋白質(zhì)合成。
1．3DNA分子復(fù)制的人工控制
解開螺旋：在80～100℃時，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性。
恢復(fù)螺旋：在50℃左右時，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)性。
復(fù)制條件：緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷
5、酸,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,兩種引物。
反應(yīng)場所：PCR儀（自動溫度周期性調(diào)節(jié)）。
［思考］緩沖液相當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的什么成分？（核基質(zhì)）1．4PCR的反應(yīng)過程
變性：在95℃時DNA解旋
復(fù)性：在50℃時引物與DNA單鏈結(jié)合
延伸：在72℃時合成DNA子鏈（兩個引物間的序列）2．實驗操作
2．1 PCR反應(yīng)體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物，水
2．2 實驗操作步驟
2．3 按照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液；
（2）將PCR反應(yīng)體系50μL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5mL）中；
（3）將微量離心管放到PCR儀中；
（4）設(shè)
6、置PCR儀的工作參數(shù)。
（5）DNA在PCR儀中大量擴(kuò)增。
2．4 水浴法：將微型離心管依次在95℃、55℃、72℃的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應(yīng)時間。
3．實驗注意事項
3．1避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。
3．2緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存。
3．3每添加一種反應(yīng)成分，更換一個移液器的槍頭。
3．4混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。
4．結(jié)果分析與評價
4．1反應(yīng)液稀釋：取2uLPCR反應(yīng)液，添加98uL蒸餾水；2．分光光度計調(diào)零：將100uL蒸餾水添加到比色杯中，在260nm處將分光光度計調(diào)整讀數(shù)為零。
4．2將100uL
7、反應(yīng)稀釋液倒入比色杯中，測定在260nm處的光吸收值。
4．3計算：DNA含量＝50×光吸收值×稀釋倍數(shù)
課后小結(jié)
課后習(xí)題
1．DNA分子復(fù)制時，解旋的兩條鏈中（ ）
A僅一條作為復(fù)制模板
B兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個不同的DNA分子
C兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個相同的DNA分子
D兩條鏈作為模板，各自合成一條子鏈，然后兩條母鏈重新結(jié)合為原來的雙螺旋分子，兩條新鏈結(jié)合成一個全新的DNA分子
2.下列關(guān)于DNA復(fù)制過程的正確順序是（ ）
①互補堿基對之間氫鍵斷裂②互補堿基對之間形成氫鍵③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母鏈為模板進(jìn)行堿基互補配對⑤子鏈與
8、母鏈盤旋成雙螺旋狀結(jié)構(gòu)
A①③④②⑤ B①④②⑤③ C①③⑤④② D③①④②⑤
3.下列各項過程中，遵循“堿基互補配對原則”的有（ ）
①DNA復(fù)制②RNA復(fù)制③轉(zhuǎn)錄④翻譯⑤逆轉(zhuǎn)錄
A①②③④⑤ B①②③④ C①②③⑤ D①③④⑤
4.實驗室內(nèi)模擬生物體DNA的復(fù)制必需的一組條件是（ ）
①酶②游離的脫氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦適宜的溫度⑧適宜的酸堿度
A①②③④⑤⑥ B②③④⑤⑥⑦ C②③④⑤⑦⑧ D①②③④⑦⑧
5.利用PCR技術(shù)，把一個雙鏈DNA分子當(dāng)作第一代，經(jīng)過3次循環(huán)，在第四代DNA分子中，有幾條第一代脫氧核苷酸的長鏈？（ ）
A 2 B 4 C 8 D 16，
答案： CDADA
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 教案
