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1、多聚酶鏈式反應PCR,一、實驗原理：,PCR又稱多聚酶鏈式反應，是一種體外酶促合成特異DNA片段的方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環(huán)構(gòu)成：即在高溫下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72）下，以引物3端為合成的起點，以單核苷酸為原料，Mg2+存在下，沿模板以53方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板
2、，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴增一倍，PCR產(chǎn)物得以指數(shù)形式迅速擴增，經(jīng)過2530個循環(huán)后，理論上可使基因擴增數(shù)百萬倍。,DNA模板：反應中DNA量在50ng200ng左右。且DNA純度較高，以增加反應特異性。dNTP:反應體系中達100M200M。Mg2+：Mg2+是Taq酶的輔基濃度在2.0mM左右，濃度太低Taq酶活力降低；太高反應特異性降低。引物：根據(jù)目的基因兩側(cè)特定序列設計。引物約20堿基左右；G+C含量在4070之間；引物內(nèi)部不能有回該序列；引物端不能互補。Taq酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性聚合酶，在95時30分鐘還有50活力。,說明,PCR過程示意
3、圖,二、實驗所需器材和試劑器材：臺式高速離心機，恒溫水浴鍋，PCR擴增儀，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，Eppendorf離心管，PCR小管,試劑：引物1，引物2，dNTPmix，10XPCRBuffer，TaqDNA聚合酶，EB，上樣緩沖液，marker，瓊脂糖，TBE緩沖液,三、實驗步驟,1：加樣按次序在PCR小管中加入下列試劑（50ul體系）：5ul10XPCRBuffer4uldNTPmix2ul引物12ul引物23ul模板1ulTaqDNApolymerase加水到總體積50ul,注意事項：同時設立對照組（對照組不加模板DNA）,2、按以下參數(shù)進行PCR擴增（對于不同的PCR反應應設置不同的反應條件）944分鐘9430秒5130秒進行30個循環(huán)7230秒725分鐘4,,將實驗組與對照組放入PCR儀，按設定好的條件進行擴增,3、擴增結(jié)束后，取5ul產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳以觀察結(jié)果,PCR結(jié)果示意圖,四、作業(yè),1，圖示實驗結(jié)果2，掌握PCR原理、學會分析實驗結(jié)果,
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