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1、第三章 利用生物合成原理尋找微生物新藥,根據(jù)微生物藥物的生物合成原理發(fā)現(xiàn)微生物新藥的方法和途徑,通過非基因定向改變、基因定向改變，以及組合生物催化的技術(shù)，或是改變原有微生物藥物的生物合成途徑，或是對原有的微生物藥物（或先導(dǎo)化合物和中間體）進行生物催化，以發(fā)現(xiàn)微生物新藥 .,定向與雜交生物合成,化學(xué)修飾,微生物藥物生物合成與微生物新藥發(fā)現(xiàn)的基本途徑,通過非基因定向改變的方法包括：定向生物合成、雜交生物合成、突變生物合成，以及生物轉(zhuǎn)化與組合生物轉(zhuǎn)化； 基因定向改變，即為組合生物合成。,第一節(jié)生物合成途徑的非基因定向改變與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),一、非遺傳操作的定向生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),已有的研究表
2、明，在抗生素等次級代謝產(chǎn)物生物合成中酶底物的特異性足以使結(jié)構(gòu)相關(guān)的代謝產(chǎn)物在其發(fā)酵液中積累； 但由于生物合成酶的底物專一性較低（寬泛性），其野生型菌株或阻斷突變株的發(fā)酵過程中添加一些已知結(jié)構(gòu)類似物作為前體物質(zhì)，可以產(chǎn)生含有與這種已知結(jié)構(gòu)類似的新衍生物； 這種獲得新次級代謝產(chǎn)物的途徑，可以被稱之為非遺傳操作的定向生物合成 (directed biosynthesis)。,前體（precursor）,即在微生物培養(yǎng)過程中，外源添加的某一化學(xué)物質(zhì)，通過微生物的代謝，能夠?qū)⑵湔w地或部分地整合到某一特定的次級代謝產(chǎn)物的分子中去的化合物，如苯乙酸或苯乙酰胺及苯氧乙酸等）。,非遺傳操作的定向生物合成,這種
3、在發(fā)酵過程中通過添加某種特定的前體物質(zhì)，使微生物的生物合成朝著將這些前體物質(zhì)摻入到產(chǎn)物分子的某一特定部位而產(chǎn)生過量的含有這種前體的產(chǎn)物的方法，即為非遺傳操作的定向生物合成。 其基本原理是由于參與這些反應(yīng)的生物合成酶的底物專一性較差，而能使外源添加的某些前體物質(zhì)競爭性地摻入到特定產(chǎn)物的分子中去。,定向生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),次級代謝產(chǎn)物合成酶的特點：是一個由一系列酶參與催化的多酶體系。參與催化反應(yīng)的酶的底物專一性比初級代謝合成酶要差。,應(yīng)用實例,應(yīng)用非遺傳操作定向生物合成的方法能夠制備獲得許多新的抗生素，其中目前已進行工業(yè)化生產(chǎn)的有： 青霉素G和V； 培羅霉素； 四環(huán)素和金霉素等。,青霉素定
4、向生物合成,培羅霉素定向生物合成,.,培羅霉素定向生物合成可結(jié)合進入BLM的末端胺基部分的非天然胺基化合物,.,四環(huán)類抗生素的定向生物合成,微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一些四環(huán)素類抗生素,四環(huán)類抗生素的定向生物合成,在生產(chǎn)金霉素時需添加氯化物作為前體，而當(dāng)生產(chǎn)四環(huán)素時，則必須要在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯離子抑制劑，如溴化物或M-促進劑等，從而抑制金霉素的合成而得到四環(huán)素產(chǎn)物。 另外，用金色鏈霉菌在發(fā)酵的金霉素過程中添加適量的甲基化反應(yīng)抑制劑如磺胺嘧啶鈉，能夠獲得去甲基金霉素。,非基因改變定向生物合成的研究進展,盡管近年來基因改變的定向生物合成發(fā)展很快，但利用非遺傳操作定向生物合成原理尋找新的生理活性物質(zhì)的研究還
5、在不少實驗室繼續(xù)進行，特別是對一些肽類如環(huán)孢菌素A、aureobasidins及糖肽類如替考拉寧產(chǎn)生菌的定向生物合成研究取得了很大的進展。,二、添加外源酶抑制劑的雜交生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),雜交生物合成（hybrid biosynthesis）似乎可以理解為是一種“強化”的非遺傳定向生物合成，如在苦霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵過程中添加聚乙酰途徑中-酮酯?；铣擅敢种苿┚€蘭菌素(cerulenin)，使其失去合成苦霉素大環(huán)內(nèi)酯苷元(picronolide)的能力而只能合成糖基。同時在發(fā)酵過程中添加泰樂菌素大環(huán)內(nèi)酯苷元(protylonolide)，使其與苦霉素生產(chǎn)菌產(chǎn)生的糖基結(jié)合，得到一種被稱之為M43
6、65G1的雜合抗生素(hybrid antibiotic)。,雜交生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),雜交生物合成產(chǎn)物工業(yè)化的可能性,盡管通過雜交生物合成能夠得到一些新的抗生素，但由于所添加的淺藍菌素本身就是一種昂貴的抗生素，再則所添加的苷元的結(jié)構(gòu)受到限制，所以這種方法似乎沒有很大的實際意義。,三、非定向誘變的突變生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),突變生物合成（mutational biosynthesis）： 突變生物合成是指野生型產(chǎn)生菌經(jīng)化學(xué)或物理等因素誘變處理后，喪失合成原來次級代謝產(chǎn)物的能力而成為阻斷突變株，然后在發(fā)酵培養(yǎng)阻斷突變株時添加某種外源物質(zhì)，參與生物合成以獲得新的次級代謝產(chǎn)物的過程。 另外
7、，突變生物合成也包括由于突變而引起產(chǎn)生新的次級代謝產(chǎn)物。,突變生物合成原理阻斷突變株的類型,營養(yǎng)缺陷型突變株： 由于編碼菌體生長之必須的酶的基因發(fā)生了突變，而使菌體不能生長，導(dǎo)致不能合成次級代謝產(chǎn)物。因此，這類突變株也可以稱為初級代謝阻斷突變株。 獨需型突變株： 這種突變株的生長和初級代謝正常，但由于編碼次級代謝產(chǎn)物合成的某一基因發(fā)生突變，而使喪失了合成次級代謝產(chǎn)物的能力。這是突變生物合成所需要的突變株。 雙重阻斷突變株： 即突變既發(fā)生在編碼初級代謝酶的基因上，也發(fā)生在編碼次級代謝酶的基因上。,突變生物合成與微生物新藥發(fā)現(xiàn),.,利用獨需型突變株合成產(chǎn)生新抗生素的基本原理,突變生物合成的基本流程
8、,.,突變生物合成產(chǎn)生的新抗生素,.,紅霉素生物合成途徑,.,突變株產(chǎn)生的新蒽環(huán)類抗生素,.,,突變株產(chǎn)生的一些新的次級代謝產(chǎn)物,.,我國應(yīng)用突變生物合成原理找到的小諾霉素,.,四、原生質(zhì)體融合與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),微生物原生質(zhì)體融合，即是指將雙新株的微生物細胞分別通過酶解脫壁，使之形成原生質(zhì)體，然后在高滲溶液的條件下混合，并加入物理的（如電融合）或化學(xué)的(如聚乙二醇)或生物的（如仙臺病毒）助融條件，使雙親株的原生質(zhì)發(fā)生相互凝集，通過細胞質(zhì)融合，核融合，爾后發(fā)生基因組間的交換，重組，進而可以在適宜的條件下再生出微生物細胞壁，獲得重組子的過程。,利用微生物原生質(zhì)融合尋找新抗生素的基本原理是來源于兩
9、種已知產(chǎn)生不同抗生素的產(chǎn)生菌的融合子，有可能將它們的部分生物合成基因整合在一起而產(chǎn)生新的雜合抗生素；另一個原理是由于抗生素產(chǎn)生菌中存在著沉默基因，當(dāng)這些沉默基因受到外源物質(zhì)刺激后，有可能被激活而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)與親株完全不同的新的抗生素。 應(yīng)用這種方法獲得的第一個新抗生素是吲哚佐霉素（indloizomycin）：其親株為鏈霉素產(chǎn)生菌灰色霉菌和天神霉素（istamycin）產(chǎn)生菌天神鏈霉菌S. tenjimariensis。,第二節(jié)生物合成途徑的基因定向改變與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),組合生物合成Combinatorial biosynthesis,是一種通過對天然產(chǎn)物生物合成途徑中的基因進行中斷、置換及重組
10、等操作，改變原來抗生素產(chǎn)生菌或其他天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌生物合成代謝產(chǎn)物的途徑，產(chǎn)生具有新穎結(jié)構(gòu)的“非天然的天然雜合產(chǎn)物（unnatural natural hybrid compounds）”的技術(shù)或方法。,組合生物合成的潛能 potential,重組、組合、互補、替換 R=可利用的基因 n=基因的等位形式 化合物數(shù)Rn R=4, n=4 Compounds=44=256,組合生物合成的原理,生物合成酶基因的結(jié)構(gòu)和組成 生物合成酶基因的特異性及底物寬容性 生物合成酶基因之間的相互作用 生物合成途徑的研究基礎(chǔ),一、具有聚酮體生物合成途徑的微生物藥物產(chǎn)生菌的組合生物合成,一些具有聚酮體生物合成（pol
11、yketide synthases，PKSs）途徑的“天然產(chǎn)物”，如紅霉素、阿維菌素、泰樂菌素、柔紅霉素、阿克拉霉素、西羅莫司和利福霉素等可采用組合生物合成。,具PKS途徑的抗生素,1、紅霉素產(chǎn)生菌的組合生物合成,通過操作PKS的模塊中單個基因的組合生物合成； 在非天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌中過量表達組合生物合成產(chǎn)物； 通過操作PKS模塊之間連接的組合生物合成 ； 通過操作脫氧糖途徑基因的組合生物合成。,紅霉素產(chǎn)生菌的組合生物合成的可能性,參與紅霉素生物合成的PKSs，或6脫氧紅霉內(nèi)酯合成酶（6-deoxyerythronolide B synthase，DEBS）有6個模塊組成，每個模塊負責(zé)合成聚酮體中
12、的一部分。 由于各模塊之間的協(xié)調(diào)性，以及每個模塊延伸單位的選擇、功能和立體化學(xué)性質(zhì)的催化結(jié)構(gòu)域，因此，就有可能通過對PKSs結(jié)構(gòu)域或模塊的操作獲得具有新穎結(jié)構(gòu)的化合物。 由于具有聚酮體結(jié)構(gòu)的化合物其結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜和具有眾多的立體異構(gòu)體，因而，難以用常規(guī)的化學(xué)方法來獲得。,紅 霉 素 的 生 物 合 成 途 徑,PKS中的每一個模塊的組成,酮基合成酶（ketosynthase，KS） ?；D(zhuǎn)移酶（acyl transferase，AT） ?；d體蛋白（acyl carrier protein，ACP -酮基修飾酶：包括酮基還原酶（ketoreductase，KR）、脫氫酶（dehydrogenas
13、e，DH）和烯酰還原酶（enoylreductase，ER） DEBS含有編碼三個獨立的多肽亞單位的6個模塊 大多數(shù)典型的聚酮體合成途徑的產(chǎn)物包括對PKS產(chǎn)物的修飾，如將脫氧糖或氨基糖進行糖苷化以及通過細胞色素P450進行氧化。圖中所示的LD為裝載域（loading domains），TE為硫酯酶（esterases）。,1）通過操作PKS的模塊中單個基因的組合生物合成,一是用利福霉素PKS模塊2中的DH/ER/KR結(jié)構(gòu)域取代紅霉素PKS模塊2中的KR； 二是將模塊5中的KR缺失； 三是用利福霉素模塊2中的丙二酰特異性AT取代模塊6中的甲基丙二酰特異性的AT），將得到一個發(fā)生三重突變的PKS產(chǎn)
14、物。,2）在非天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌中過量表達組合生物合成產(chǎn)物,將E.coli 開發(fā)成能夠表達PKS產(chǎn)物需要解決的問題主要有三個方面： 一是能夠功能性表達巨大的蛋白（330kDa）； 二是PKS亞單位的ACP結(jié)構(gòu)域的翻譯后磷酸泛酰巰基乙胺?；?； 三是聚酮體途徑中的前體物質(zhì)，特別是（2S）甲基丙二酰CoA在E.coli中不存在。,Pfeifer等的工作包括：,運用來源于枯草芽孢桿菌非核糖體多肽合成酶（NRPS）基因簇的磷酸泛酰巰基乙胺酰轉(zhuǎn)移酶（phosphopantetheinyl transferase）基因sfp，以對PKS亞單位的ACP結(jié)構(gòu)域的翻譯后磷酸泛酰巰基乙胺?；?； 過量表達E.coli中的
15、丙酰CoA合成酶基因prpE，擾亂丙酰CoA代謝途徑，以及過量表達來自S.coelicolar的丙酰CoA羧化酶基因pcc，使丙酰CoA轉(zhuǎn)化為（2S）甲基丙二酰CoA,3）通過操作PKS模塊之間連接的組合生物合成,通過對DEBS模塊在E.coli和體外的表達研究，發(fā)現(xiàn)在PKS裝配過程中那些短的模塊內(nèi)和多肽內(nèi)的“連接件”是至關(guān)重要的成分。研究發(fā)現(xiàn)在相繼非共價連接的模塊中，其氨基和羧基末端存在有多肽內(nèi)連接件，這種連接件與單個多肽內(nèi)的模塊之間的連接件不同。 因此，使用一種合適的連接件就有可能允許雜合的模塊之間進行功能性連接。,a：已經(jīng)鑒定了不同的模塊內(nèi)和多肽內(nèi)的連接件，并由此指導(dǎo)合成模塊之間的聚酮體
16、中間體，這里需要合適的氨基和羧基末端連接配對，以產(chǎn)生功能性連接模塊； b：在構(gòu)建功能性互補體時，可以使用編碼來源于不同微生物多個模塊的全亞基； 如圖所示：來源于苦霉素（picromycin）的PKS（PikAI和PikAII），與來源于竹桃霉素（oleandomycin）的PKS（OleA3）相結(jié)合。,4）通過操作脫氧糖途徑基因的組合生物合成,對已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的由自然界中植物、真菌和細菌產(chǎn)生的很多具有生理活性的糖苷類化合物的分析發(fā)現(xiàn)，連接在苷元上的糖基的結(jié)構(gòu)大多為6-脫氧己糖（6-deoxyhexoses, 6DOHs）。 據(jù)統(tǒng)計，這些具有生理活性的糖苷類化合物的結(jié)構(gòu)上含有70多種不同的6-脫氧己糖
17、。,,,由放線菌產(chǎn)生的具有不同生理活性的糖苷化合物的結(jié)構(gòu)特性,具有單糖殘基的化合物：烏達霉素A、柔紅霉素、urdamycin A和rebeccamycin； 具有雙糖殘基的化合物：光輝霉素（mithramycin）； 具有三糖殘基的化合物：烏達霉素A（urdamycin A）和光輝霉素（前者同時具有單糖和三糖殘基，后者同時具有雙糖和三糖殘基）； 以O(shè)-糖苷鍵連接的化合物：紅霉素A、光輝霉素、柔紅霉素和烏達霉素A； 以C-糖苷鍵連接的化合物：烏達霉素A； 以N-糖苷鍵連接的化合物：rebeccamycin。,,由放線菌產(chǎn)生的具有不同生理活性的糖苷化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu),a）通過將竹桃霉素產(chǎn)生菌S.an
18、tibioticus中齊墩果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在不同的S.erythraea中的表達，得到了3O鼠李糖基紅霉素和6dEB衍生物，以及一個desosaminylated tylactone；b）改造來源于刺孢霉素（calicheamicin）產(chǎn)生菌的基因，可以得到一個新的脫氧氨基糖，并將其附著在S.lividans產(chǎn)生的苷元上；,c）在S.lividans產(chǎn)生菌中構(gòu)建desosamine的途徑，然后導(dǎo)入通過遺傳操作的DEBS，可以得到具有新穎結(jié)構(gòu)的desosaminylated大環(huán)內(nèi)酯類文庫。,將竹桃霉素產(chǎn)生菌抗生鏈霉菌中編碼竹桃霉素oleandrose糖基轉(zhuǎn)移酶的基因oleGII，（該酶負責(zé)將相應(yīng)
19、的糖基轉(zhuǎn)移到8，8a-脫氧竹桃內(nèi)酯（8，8a-deoxyoleandolide）的4位羥基上），整合到紅霉素產(chǎn)生菌eryBV缺失突變株中，eryBV基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶負責(zé)將L-mycarose糖基轉(zhuǎn)移到6-脫氧紅霉內(nèi)酯（6-deoxyerythronolide）甙元的相同位置，并進行表達，結(jié)果得到了將天然糖基L-rhamnose轉(zhuǎn)移到6-脫氧紅霉內(nèi)酯4位的新紅霉素衍生物，其具有抗菌活性，,將泰樂菌素產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌中編碼mycaminose糖基轉(zhuǎn)移酶基因tylM2整合到紅霉素產(chǎn)生菌三缺失突變株SGT2，（分別缺失聚酮體合成酶基因、mycarose和desosamine糖基轉(zhuǎn)移酶基因，但仍然具
20、有合成L-mycarose和D-desosamine的能力），并使之表達，同時在培養(yǎng)過程中外源加入16-元環(huán)的泰樂酮（tylactone），結(jié)果得到一種新的泰樂星衍生物5-O-desosaminyl-tylactone，如圖）所示。說明泰樂菌素產(chǎn)生菌中的轉(zhuǎn)移酶TylM2能夠識別和轉(zhuǎn)移不同的氨基糖。 這兩個例子同時也表明抗生素糖基轉(zhuǎn)移酶具有較寬的底物專一性。,5）通過表達雜合基因方法的組合生物合成,第一個例子是應(yīng)用有些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素3位或糖基4位的羥基?；富颍鼓承┐蟓h(huán)內(nèi)酯類抗生素在相應(yīng)的位置?；?1）異戊酰螺旋霉素（來自碳霉素的4”異戊酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的carE基因 ）； 2）丙酰螺旋霉
21、素（來自麥迪霉素的4”丙?；傅膍pt基因）； 3）乙酰泰樂菌素等（來自碳霉素的3O乙酰轉(zhuǎn)移酶的acyA基因）。,引入外源酶基因產(chǎn)生雜合抗生素丙酰螺旋霉素基因工程菌構(gòu)建圖,必特螺旋霉素的結(jié)構(gòu),R1 H R2 COCH2CH(CH3)2 COCH3 COCH2CH2CH3 COCH2CH3 COCH2CH3 COCH3,2、蒽環(huán)類抗生素產(chǎn)生菌的 組合生物合成（略）,蒽環(huán)類抗生素是一類臨床上非常重要的抗腫瘤抗生素，它們同樣是PKS生物合成途徑，因此，通過以下集中組合生物合成的方法，可以得到一系列“非天然的天然雜合化合物”。,1）通過
22、破壞靶基因的組合生物合成,通過基因框內(nèi)的誘變或缺失，或插入抗生素耐藥基因盒的方法，可以將所選擇的靶基因特異性地鈍化； 盡管靶基因的破壞可以得到新的化合物，但會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果，這是因為一方面由于極性效應(yīng)影響下游基因的表達，另一方面受到由于外源DNA片斷的插入造成的反義RNA合成影響上游基因。,1）通過破壞靶基因的組合生物合成,在光神霉素（mithramycin）產(chǎn)生菌S.argillaceus中，破壞編碼葡萄糖1磷酸胸苷5三磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶的基因mtmD后，獲得了兩個四環(huán)類的光神霉素衍生物：premithramycinone和4脫甲基premithramycinone衍生物； Premithram
23、ycinone的抗腫瘤生物活性與光神霉素相似，且有趣的是其化學(xué)結(jié)構(gòu)與來源于黑曲霉A.niger的神經(jīng)肽受體抑制劑BMS非常相似，如圖所示。,通過基因破壞后得到的兩個光神霉素衍生物和BMS-192548,2）通過表達雜合基因方法的組合生物合成,來源于S.fradiae的urdE基因，編碼一種氧化酶，其可能涉及到將1分子氧引入到烏達霉素結(jié)構(gòu)中； 在控制啟動子ermE的條件下，將其在丁省霉素C產(chǎn)生菌S.glaucescens中表達，產(chǎn)生一種新的雜合化合物，6羥基丁省霉素C，如圖所示。,通過將烏達霉素產(chǎn)生菌的urdE基因在丁省霉素C產(chǎn)生菌 中表達，得到一種雜合產(chǎn)物6羥基丁省霉素C,2）通過表達雜合基因
24、方法 的組合生物合成,另外一個實例是，將柔紅霉素產(chǎn)生菌S.peucetius中編碼11-aklavinone-羥化酶的基因（dnrF），在阿克拉霉素產(chǎn)生菌S.galilaeus中表達，結(jié)果得到了一種新的雜合化合物，11羥基阿克拉霉素A，如圖所示。 這種羥基化的產(chǎn)物，其對白血病細胞和黑色素瘤細胞的生物活性比阿克拉霉素要強。,雜合化合物11羥基阿克拉霉素A的組合生物合成,2）通過表達雜合基因方法 的組合生物合成,通過這種組合生物合成的方法，已經(jīng)獲得了數(shù)個雜合糖苷化的丁省霉素，如用含有一個完整埃羅霉素（elloramycin）基因簇（具有產(chǎn)生8去甲基丁省霉素C的能力）的黏粒轉(zhuǎn)化烏達霉素產(chǎn)生菌
25、或光神霉素產(chǎn)生菌，可以得到四種新的糖苷化合物：齊墩果糖基、鼠李糖基、mycarosyl丁省霉素C和雙齊墩果糖基丁省霉素C，如圖所示。 有趣的是，這些脫氧糖在烏達霉素和光神霉素苷元上的附著位置，與在埃羅霉素的附著位置不同。表明，這些聚酮體的糖基轉(zhuǎn)移酶具有底物寬泛性。,雜合糖苷化丁省霉素的組合生物合成,能夠被ElmGT糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移的一些 糖基和elloramycin甙元的結(jié)構(gòu),,表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建,表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建,通過鈍化dnmV基因，得到一個柔紅霉素和阿霉素產(chǎn)生菌的阻斷突變株，dnmV基因編碼4酮基還原酶，其與合成這類抗生素結(jié)構(gòu)中的脫氧糖，柔毛霉胺的
26、合成有關(guān)。 分別將阿維菌素產(chǎn)生菌中編碼合成齊墩果糖的基因avrE，以及紅霉素產(chǎn)生菌中編碼合成mycarose的基因eryBIV，克隆到dnmV基因阻斷突變株中。 由于重組工程菌中的外源基因表達的4-酮基還原酶的特性與柔紅霉素產(chǎn)生菌中的4-酮基還原酶不同，前者具有非對映立體催化特性而能夠形成L-epidaunosamine（表柔毛霉氨）。而突變株dnmV生物合成甙元的能力和合成糖基轉(zhuǎn)移酶的能力仍然保持，且由于糖基轉(zhuǎn)移酶的底物專一性較差而不影響將表柔毛霉氨連接在原來的蒽環(huán)酮上，從而得到4-表柔紅霉素和4-表阿霉素，如圖所示。,表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建,二、具有非核糖體生物合成肽類途徑的
27、微生物藥物產(chǎn)生菌的組合生物合成,具有非核糖體生物合成途徑（none ribosomal peptide synthases，NRPSs）的環(huán)肽或糖肽類“天然產(chǎn)物”，如萬古霉素、博萊霉素、環(huán)孢菌素A和埃坡霉素等進行了大量的研究工作，并取得了令人注目的成果。,Chloroeremomycin 生物合成,（1）小分子準備 在酶的催化下生成裝配過程中需要的小分子化合物，對于萬古霉素族糖肽類抗生素而言包括：非蛋白氨基酸和TDP-L-b-epivancosamine； （2）裝配 上步準備好的氨基酸通過腺苷化反應(yīng)（adenylation）轉(zhuǎn)換成為腺苷酸，而后與鄰近肽載體蛋白（peptide carrier
28、 protein, PCP）上的巰基形成硫酯（thiolation），PCP之間的縮合功能域（condensation）催化肽鍵形成。經(jīng)過幾個延伸過程，最后TE域?qū)⑼瓿傻碾那邢?。有時過程中還會有差向異構(gòu)作用(epimerisation)。 （3）裝配后修飾 在這步反應(yīng)中通常進行氧化反應(yīng)和糖基化，對于有的化合物還存在N端甲基化反應(yīng)。,萬古霉素的生物合成,另據(jù)研究，天然的萬古霉素生物合成共有35步，其先以五種自由的氨基酸單體合成一線形的七肽，然后芳基側(cè)鏈在交聯(lián)酶的催化下適時地組合、交聯(lián)，形成復(fù)雜的七肽骨架，最后UDP-glucose和UDP-4-epi-vancosamine在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下連
29、接到七肽骨架上。,萬古霉素生物合成的五種起始自由氨基酸單體,萬古霉素生物合成的逆向合成分析圖,在萬古霉素家族中發(fā)現(xiàn)的糖基,GtfE糖基轉(zhuǎn)移酶識別并將UDP-glucose轉(zhuǎn)移至七肽骨架上,GtfD糖基轉(zhuǎn)移酶識別并將4epivancosamine連接至萬古霉素骨架上,2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,糖肽類抗生素的組合生物合成主要有4條途經(jīng): 第一，提供新的氨基酸單體，或者是利用已知生物合成途經(jīng)中的酶來催化生成新的我們所需要的氨基酸單體，使合成新的七肽骨架; 第二，改變七肽NRPS裝配線上的基因，從而達到重新設(shè)計生物合成途經(jīng)的目的; 第三，在七肽裝配之后，干預(yù)修飾酶（tailoring）
30、作用的步驟，包括N甲基化、酪氨酸的羥化等; 第四，利用糖基轉(zhuǎn)移酶將不同結(jié)構(gòu)的糖基與不同苷元連接以及連接不同的個數(shù)，從而產(chǎn)生具有不同生理活性的最終產(chǎn)物。因此糖苷化酶可以作為一種制備各種不同糖苷化合物的催化劑，有可能從中找到具有潛在應(yīng)用價值的新活性物質(zhì)。,2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,Solenberg等從萬古霉素產(chǎn)生菌東方擬無枝酸菌C329.4中克隆到了兩個糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtfE和gtfD，并從chloroeremomycin產(chǎn)生菌中克隆到了3個糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtfA、gtfB和gtfC; 將gtfB和gtfE在大腸埃希氏菌中表達，研究了其體外活性。結(jié)果表明當(dāng)TDP-葡萄糖存在時，從
31、大腸埃希氏菌中表達的糖基轉(zhuǎn)移酶GtfB和GtfE能夠在體外將葡萄糖轉(zhuǎn)移到萬古霉素糖苷上，從而得到中間體DVV（desvancosaminyl vancomycin）; 當(dāng)?shù)孜飺Q為UDP葡萄糖，UDP-D-木糖時，仍然能夠轉(zhuǎn)移到萬古霉素糖苷上; GtfE也能夠?qū)DP/UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到無糖基化的化合物A47934和A41030上，而GtfB不能將化合物A47934糖基化，表明GtfE相對于GtfB底物特異性差。,2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,在Matsushima等建立地?zé)o糖基化合物A47934產(chǎn)生菌豐加鏈霉菌（Streptomyces toyocanesis）基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的基礎(chǔ)
32、上，Solenberg等還成功地將含有糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtfE的質(zhì)粒導(dǎo)入到豐加鏈霉菌中，得到了糖基化的A47934衍生物。,GtfE和GtfB在體內(nèi)進行的糖苷化反應(yīng),2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,Losey等采用化學(xué)和酶法合成了很多NDP-葡萄糖的類似物來研究GtfD和GtfE的催化活性。結(jié)果表明，GtfE不但能用UDP-葡萄糖類似物，TDP-葡萄糖類似物作為糖基供體，同時還可以采用脫氧葡萄糖類似物以及氨基在2、3、4、或6位的TDP/UDP-葡萄糖類似物作為糖基供體; 更值得注意的是，一般來講GtfD將vancosamine連接至萬古霉素的假糖苷的葡萄糖配基上，試驗結(jié)果表明GtfD
33、還可以將4-epi-vancosamine連接至GtfE以不同的糖基供體為底物所催化生成的衍生物上（糖基化位點在2-脫氧的除外）。這樣產(chǎn)生的帶有兩個氨基糖的萬古霉素衍生物就提供了一種新的結(jié)構(gòu)，以便于繼續(xù)進行類似于oritavancin的烷基化從而提高生物活性。,2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,Chen等從chloroeremomycin 的生物合成基因簇中克隆到了L-epivancosamine的合成基因，在大腸埃希氏菌中表達，并成功地在體外重建了從TDP-4-酮基-6-脫氧D-葡萄糖經(jīng)過C-2脫氧合作用(deoxygenation)、C-3胺化(amination)、甲基化(met
34、hylation)、C-4酮基還原、C-5表構(gòu)異化等步驟得到了TDP-L epivancosamine。這個糖基的基因克隆和表達為以后組合生物合成提供了信息。,2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,對萬古霉素等糖肽類抗生素進行的組合生物合成，不單單可以通過外源添加不同的糖基供體，還可以通過將產(chǎn)生菌體內(nèi)原有的糖合成途徑進行破壞或置換、以及對糖基轉(zhuǎn)移酶進行改造等改變糖基化方式產(chǎn)生新的化合物; 另外，對肽骨架裝配時所需的氨基酸生物合成的了解以及相關(guān)基因的分離和表達，也為萬古霉素等糖肽類抗生素的組合生物合成提供了有益的信息。,2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,目前對于研發(fā)新的萬古霉素等糖肽
35、類雜合抗生素主要集中在對糖基化方式的研究和改造，但至今為止絕大多數(shù)的研究是在大腸埃希氏菌中或在S. toyocanesis等鏈霉菌中進行異源表達; 美國Christopher領(lǐng)導(dǎo)的小組以及德國Wohlleben所領(lǐng)導(dǎo)的小組對萬古霉素生物合成途徑中的很多酶進行了體外表達，并對酶學(xué)性質(zhì)，立體結(jié)構(gòu)等進行了詳細的研究，為萬古霉素等糖肽類抗生素的組合生物合成做了充分的準備; 但目前在萬古霉素等糖肽類抗生素產(chǎn)生菌體內(nèi)進行組合生物合成還未見報道，關(guān)鍵可能是缺乏完善的擬無枝酸菌遺傳操作系統(tǒng)。,3、類胡蘿卜素的組合生物合成,作為抗氧化劑，類胡蘿卜素具有很大的藥物應(yīng)用前景，如已經(jīng)顯示這類化合物對心血管疾病和腫瘤具
36、有相當(dāng)?shù)寞熜? 迄今為止，已有600多種類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)被確證，但由于化學(xué)合成的困難，以及從微生物代謝產(chǎn)物和植物組織中分離困難而難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化; 但是，近年來發(fā)展的組合生物合成技術(shù)，有可能通過外源基因在E.coli中的雜合表達，來制備這些稀少的衍生物甚至產(chǎn)生新的類胡蘿卜素化合物。,第三節(jié) 組合生物催化與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),組合生物轉(zhuǎn)化（催化）（combinatorial biocatalysis）,是指利用一種以上的具有特殊轉(zhuǎn)化功能的微生物或酶，對同一個母體化合物進行組合轉(zhuǎn)化，以得到化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，它是從已知化合物中尋找新型衍生物以及從簡單化合物制備復(fù)雜化合物的有效手段; 從某種角度講，它比化學(xué)合成的方法更為簡單和有效; 這是一個新的研究領(lǐng)域。,模擬生物體的生命過程，利用組合生物催化技術(shù)構(gòu)建先導(dǎo)化合物庫,可用于組合合成的生物催化反應(yīng),利用生物催化發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的優(yōu)越性,可能進行反應(yīng)的范圍廣； 能夠定向進行區(qū)域選擇性和立體選擇性； 不需基團保護和脫保護，一步實現(xiàn)所需的反應(yīng)； 在溫和和均一的條件下可容易地實現(xiàn)自動化和一 步反應(yīng)的重現(xiàn)性； 溫和的反應(yīng)條件復(fù)雜易變的分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性； 高的催化活性可以降低催化劑的用量； 酶的固定化可以使催化劑反復(fù)和循環(huán)使用； 生物催化劑在環(huán)境中完全被降解。,生物催化產(chǎn)生的分子庫,矮茶素的組合生物催化,謝謝大家！,
利用生物合成原理尋找微生物新藥.ppt
