SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量.ppt

上傳人:san****019 文檔編號:15675327 上傳時間:2020-08-29 格式:PPT 頁數(shù):20 大?。?18.60KB
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1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,生化社團 呂炎,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量,一、實驗?zāi)康?二、實驗原理 三、實驗步驟 四、結(jié)果分析 五、注意事項,一、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的原理。 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)。,二、實驗原理,SDS的性質(zhì)與作用 聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì),SDS的性質(zhì)與作用,十二烷基磺酸鈉(SDS) Sodium dodecyl sulphate CH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+,,Protein Strand,SDS Molecules,,Denature,SDS的性質(zhì)與作用,蛋白質(zhì)變性 0.1-1% S

2、DS 0.1 M 2-巰基乙醇 蛋白質(zhì)變與SDS分子按比例結(jié)合 1 :1.4,SDS,,,SDS的性質(zhì)與作用,聚丙烯酰胺凝膠性質(zhì),聚丙烯酰胺凝膠(PAG)是由丙烯酰胺(Acr)和甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑的作用下,聚合交聯(lián)而成的。,聚丙烯酰胺凝膠(PAG)具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),能起分子篩作用。用它作電泳支持物,對樣品的分離取決于各組分所帶電荷的多少及分子大小。 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)還具有濃縮效應(yīng),即在電泳開始階段,由于不連續(xù)pH梯度作用,將樣品壓縮成一條狹窄區(qū)帶,從而提高了分離效果。,聚丙烯酰胺凝膠性質(zhì),,,,,,X,Y,Z,+ SDS,PAGE,SDS-PAGE,-,+,,,,,

3、,,,,-,結(jié)果受分子量大小和電荷的影響,結(jié)果只與分子量大小有關(guān),-,+,PAGE和SDS-PAGE的比較,三、實驗步驟,制備分離膠 制備濃縮膠 電泳及染色 凝膠板剝離與染色,,配制分離膠溶液,制備分離膠,凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入。注膠過程要一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡。,,,,,加入分離膠溶液 pH 8.8,,,,,,制備分離膠,封水的目的是使分離膠上表面平直,并排除氣泡。 凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。,配制濃縮膠溶液,制備濃縮膠,,,,,,分離膠 pH 8.8,,,,制備濃縮膠,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

4、,,,,,濃縮膠 pH 8.6,分離膠 pH 8.8,上樣及電泳,開始電流恒定在10mA,當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為20mA,溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時,停止電泳。,凝膠板剝離與染色,電泳結(jié)束后,撬開玻璃板,將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi),加入染色液,染色1小時左右。 脫色:染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次,再用脫色液脫色,直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。 剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分.,,影響電泳速度的外界因素,1.電場強度 2.溶液的pH值 3.溶液的離子強度 4.電滲現(xiàn)象 5.溫度的影響 6.支持物的影響,四、結(jié)果分析,標(biāo)難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。,,以每個蛋白標(biāo)準(zhǔn)的

5、分子量對數(shù)對它的相對遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線,量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量。,五、注意事項,1.丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性并容易吸附于皮膚,操作時應(yīng)免避沾在臉、手等皮膚上。最好戴一次性塑料手套操作。 2.過硫酸銨的主要作用是提供自由基引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合反應(yīng),故一定要新鮮,貯存過久的過硫酸銨商品不能使用。此外,10%過硫酸銨必須現(xiàn)用現(xiàn)配,4冰箱貯存不超過48小時。 3.灌制凝膠時,應(yīng)避免產(chǎn)生汽泡,因為汽泡會影響電泳分離效果。 4.剛灌注分離膠混合溶液后,應(yīng)在分離膠液面上加12cm高的水層,以阻隔空氣。膠液面上加水層時要特別小心,緩緩疊加,以免沖壞凝膠的膠面。 5.聚丙烯酰胺凝膠電泳耗時長,電泳過程中產(chǎn)熱多,特別是夏天產(chǎn)熱更多。故電泳過程中應(yīng)安裝循環(huán)冷卻水以帶走熱量,或在4冰箱中電泳。,,

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