微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課件.ppt

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1、專題2 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,了解有關(guān)微生物及培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識(shí),進(jìn)行無菌技術(shù)的操作,進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。,一、課題目標(biāo):,掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù),熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作,成功地培養(yǎng)微生物。,無菌技術(shù)的操作。,二、課題重點(diǎn)和難點(diǎn):,三、技能目標(biāo):,,微生物包括哪五類:,病毒 細(xì)菌 放線菌 真菌 原生動(dòng)物,特點(diǎn):結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,形體微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到,有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用.,,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,,,一、基礎(chǔ)知識(shí): (一)微生物,細(xì)菌的外形與大小,細(xì)菌:?jiǎn)渭?xì)胞不分枝的原核微生物。 細(xì)

2、菌細(xì)胞微小而透明,通常用適當(dāng)染料染色后顯微鏡觀察,圖1-1 常見的三種細(xì)菌典型形態(tài) A.球菌 B.桿菌 C.弧菌,,,,,細(xì)菌細(xì)胞由外向里依次有鞭毛、菌(纖)毛、莢膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞質(zhì)中又有液泡、儲(chǔ)存性顆粒、核質(zhì)等。,細(xì)菌的構(gòu)造,圖1-3 細(xì)菌的結(jié)構(gòu),,,,,,,,,,*細(xì)胞壁,結(jié)構(gòu)特點(diǎn):堅(jiān)韌且有彈性 細(xì)胞壁有哪些功能? 固定細(xì)胞外形;,保護(hù)細(xì)胞免受外力的損傷;,,阻攔大分子物質(zhì)進(jìn)人細(xì)胞;,使細(xì)胞具有致病性及對(duì)噬菌體的敏感性。,傷寒桿菌細(xì)胞壁中含毒素,芽孢,有些細(xì)菌在一定的條件下,細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體,叫做芽孢。芽孢的壁很厚,對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有

3、很強(qiáng)的抵抗力。例如,有的細(xì)菌的芽孢,煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕,可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜(如溫度、水分適宜)的時(shí)候,芽孢又可以萌發(fā),形成一個(gè)細(xì)菌.,學(xué)車問答 學(xué)車問題回答,駕駛員模擬考試2016 科目一 科目二 科目三 科目四,菌落:,單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí),就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見的,具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體,叫做菌落。 菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。,菌落,細(xì)菌的菌落特征因種而異,細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)類型,根據(jù)細(xì)菌所利用的能源和碳源的不同,將細(xì)菌分為兩大營(yíng)養(yǎng)類型。 自養(yǎng)菌:分類,舉例? 異養(yǎng)菌: 腐生菌 寄生菌 大部分病原菌,,光合自養(yǎng)型:光合細(xì)菌 化能自養(yǎng)型:硝化細(xì)菌,鐵細(xì)

4、菌,硫細(xì)菌,放線菌,1、結(jié)構(gòu): 單細(xì)胞原核 分支狀的菌絲(基內(nèi)菌絲、氣生菌絲),鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、 氯霉素、紅霉素、慶大霉素,微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素,其中2/3是 由放線菌產(chǎn)生的,應(yīng)用:,病毒的結(jié)構(gòu),2、病毒的增殖:,真菌,一、基礎(chǔ)知識(shí):,(二)培養(yǎng)基,培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)是由人工方法配制而成的,專供微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)液。,(1)按物理狀態(tài)分:固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種保存及分離、鑒定菌落、活菌計(jì)數(shù)等,半固體培養(yǎng)基可觀察微生物的運(yùn)動(dòng),液體培養(yǎng)基常用于發(fā)酵工業(yè)。 (2)按功能分:選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。 (3)按成分分:天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。,

5、1.培養(yǎng)基的類型和用途,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌等真菌 加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌 不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌 不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物 加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: 分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞 加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基: 分離雜交瘤細(xì)胞,天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液(如雞胚和牛胚浸液)。 優(yōu)點(diǎn):營(yíng)養(yǎng)成分豐富,培養(yǎng)效果好 缺點(diǎn):來源受限;成分復(fù)雜,影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;,根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量,用人工方法模擬合成

6、的。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn):標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),組分和含量相對(duì)固定;成本低 缺點(diǎn): 缺少某些成分,不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。,合成培養(yǎng)基:,天然培養(yǎng)基:,血清中含有: 多種蛋白質(zhì)(白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等) 多種金屬離子; 激素; 促貼附物質(zhì),如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。 各種生長(zhǎng)因子 轉(zhuǎn)移蛋白 不明成分,人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存,要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖,還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基(如血清)。,液體培養(yǎng)基:,表面生長(zhǎng),均勻混濁生長(zhǎng),沉淀生長(zhǎng),固體培養(yǎng)基:菌落,菌苔,半固體培養(yǎng)基:,無動(dòng)力 有動(dòng)力(彌散),,,(是否運(yùn)動(dòng)),

7、2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方 (參考教材附錄內(nèi)容),3.不管哪種培養(yǎng)基,一般都含有水、碳源、和氮源、 無機(jī)鹽、等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 另外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),例如:生長(zhǎng)因子(即細(xì)菌生長(zhǎng)必需,而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。,4.培養(yǎng)基的用途,液體培養(yǎng)基:增菌 固體培養(yǎng)基:純化,增菌 半固體培養(yǎng)基:動(dòng)力檢測(cè),保種,,二、無菌技術(shù),1.無菌技術(shù)的概念,無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中,所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學(xué)到的倒平板、平板劃線操作,還是平板稀釋涂布法,其操作中的每一步都需要做到“無菌”,即防

8、止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作,才可能成功地培養(yǎng)微生物。,()消毒定義: 利用化學(xué)或物理方法,殺死大部份致病微生物的過程。區(qū)分為高程度消毒(High-level Disinfection)、中程度消毒(Intermediate-level Disinfection)、低程度消毒(Low-level Disinfection)三種方式。,2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別,(2)滅菌的定義:,以化學(xué)劑或物理方法消滅所有微生物,包括所有細(xì)菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒,而達(dá)到完全無菌之過程。 滅菌消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2

9、、巴氏消毒法:70-75 下煮30min或 80 下煮15min 3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源 4、紫外線消毒 ,(1)消毒的方法:,3.常用的消毒與滅菌的方法,1、灼燒滅菌 2、干熱滅菌:160-170 下加熱1-2h。 3、高壓蒸氣滅菌:100kPa、121 下維持15-30min.,(2)滅菌的方法:,最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌,它可以殺滅所有的生物,包括最耐熱的某些微生物的休眠體,同時(shí)可以基本保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。 有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌,特別是空氣中的雜菌污染,試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口,

10、通常采用棉花塞,也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽,它們只可讓空氣通過,而空氣中的其他微生物不能通過。 而平皿是由正反兩平面板互扣而成,這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計(jì)的。,無菌技術(shù),3.微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序,1、器具的滅菌 2、培養(yǎng)基的配制 3、培養(yǎng)基的滅菌 4、倒平板 5、微生物接種 6、恒溫箱中培養(yǎng) 7、菌種的保存,1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外,還有什么目的?,2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要,請(qǐng)選擇合適的方法。 (1) 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 (2) 玻棒、試管、燒瓶和吸管 (3) 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手,答:

11、無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答:(1)、(2)需要滅菌;(3)需要消毒。,三、實(shí)驗(yàn)操作,1.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)細(xì)菌),1計(jì)算、稱量 2溶化 3調(diào)pH:pH76 4過濾:這一步可以省去。 5分裝:分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。 6加塞 7包扎,操作步驟,8滅菌: 將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中,塞上棉花塞,包上牛皮紙,再放入高壓蒸氣滅菌鍋,在壓力為100kPa、溫度為121,滅菌1530min。將培養(yǎng)基用舊報(bào)紙包裹,放入干熱滅菌箱內(nèi),在160170 下滅菌2h。 9倒

12、平板: 待培養(yǎng)基冷卻到50 左右時(shí),在酒精燈附近倒平板。(倒平板操作見課本)2d后觀察平板,無雜菌污染才可用來接種. 10無菌檢查: 將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448小時(shí),以檢查滅菌是否徹底。,倒平板技術(shù),1.培養(yǎng)基滅菌后,需要冷卻到50 左右時(shí),才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度?,問題討論,答:可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶,感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí),就可以進(jìn)行倒平板了。,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰?,答:通過灼燒滅菌,防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,3.平板冷凝后,為什么要將平板倒置?,4.在倒平板的過程中,如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之

13、間的部位,這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎?為什么?,答:平板冷凝后,皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠,凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高,將平板倒置,既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā),又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基,造成污染。,答:空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生,因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。,2、純化大腸桿菌,接種方法有: 平板劃線法和稀釋涂布平板法,平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.,微生物的接種技術(shù),平板劃線的操作方法 交叉劃線法 連續(xù)劃

14、線法,平板劃線時(shí)不能劃破培養(yǎng)基的原因,一旦劃破,會(huì)造成劃線不均勻,難以達(dá)到分離單菌落的目的; 二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無法形成規(guī)矩的菌落,菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng),會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。,問題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)?在劃線操作結(jié)束時(shí),仍然需要灼燒接種環(huán)嗎?為什么?,答:操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物;每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后,接種環(huán)上殘留的菌種,使下一次劃線時(shí),接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端,從而通過劃線次數(shù)的增加,使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少,以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán),能及時(shí)殺死接

15、種環(huán)上殘留的菌種,避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,2.在灼燒接種環(huán)之后,為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線?,答:以免接種環(huán)溫度太高,殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí),為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線?,答:劃線后,線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少,每次從上一次劃線的末端開始,能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少,最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。,問題討論,涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求,想一想,第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作?,應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如,酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒

16、精燈火焰周圍等等。,微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),菌種的保存,1、臨時(shí)保藏:接種到固體斜面培養(yǎng)基,菌落長(zhǎng)成后置于4冰箱保存。 2、長(zhǎng)期保存:甘油冷凍管藏法,四、課題成果評(píng)價(jià),(一)培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無菌落生長(zhǎng),說明培養(yǎng)基的制備是成功的,否則需要重新制備。 (二)接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、形狀、大小基本一致,并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn),則說明接種操作是符合要求的;如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落,則說明接種過程中,無菌操作還未達(dá)到要求,需要分析原因,再次練習(xí)。 (三)是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄 培養(yǎng)12 h

17、與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同,及時(shí)觀察記錄的同學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn),并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。,本課題知識(shí)小結(jié):,【典例解析】,例1關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中,正確的 A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽 D.無機(jī)氮源也能提供能量,解析:不同的微生物,所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有較大差別,要針對(duì)微生物的具體情況分析。對(duì)于A、B選項(xiàng),它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源,如二氧化碳;有的碳源可同時(shí)是氮源,如NH4HCO3;有的碳源同時(shí)是能源,如葡萄糖;有的碳源同時(shí)是氮源,也是能源,如蛋白胨。對(duì)于C

18、選項(xiàng),除水以外的無機(jī)物種類繁多,功能也多樣。如二氧化碳,可作為自養(yǎng)型微生物的碳源;NaHCO3,可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機(jī)鹽;而NaCl則只能提供無機(jī)鹽。對(duì)于D選項(xiàng),無機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的,如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。,答案:D,例2下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是 A.防止雜菌污染 B.消滅雜菌 C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前,答案:B,解析:滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的,因?yàn)榘l(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種,整個(gè)發(fā)酵過程不能混入其他微生物(雜菌),所以是正確的;B是錯(cuò)誤的,因?yàn)闇缇哪康氖欠乐闺s菌污染,但實(shí)際操作

19、中不可能只消滅雜菌,而是消滅全部微生物。C是正確的,因?yàn)榕c發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌;發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的,滅菌必須在接種前,如果接種后再滅菌就會(huì)把所接菌種也殺死。,例3右表是某微生物培養(yǎng)基成分,請(qǐng)據(jù)此回答: (1)右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是 。 (2)若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。 如不想浪費(fèi)此培養(yǎng)基,可再加入 .,自養(yǎng)型微生物,含碳有機(jī)物,(3)若除去成分,加入(CH2O),該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng) 。 (4)表中營(yíng)養(yǎng)成分共有 類。 (5)不論何種培養(yǎng)基,在各種成分都溶化后分裝前,要進(jìn)行的是 。 (6)右表中各成分重量確定的原則是 。 (7)若右表培養(yǎng)基用于菌種鑒定,應(yīng)該增加的成分 。,固氮微生物,3,調(diào)整pH,依微生物的生長(zhǎng)需要確定,瓊脂(或凝固劑),

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