生物芯片與高通量篩選

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1、第十一講 生物芯片與高通量篩選,胡海峰,測試情況總結(jié),本次平時測試結(jié)果作為平時成績，檢查同學(xué)聽課質(zhì)量，平均96分，總體效果良好。 存在問題：部分同學(xué)答題不夠認(rèn)真，掌握不夠準(zhǔn)確，特別第一和二部分必須準(zhǔn)確，問答題必須內(nèi)容充實(shí)。 大家建議：增加互動，放慢講課速度，突出重點(diǎn)，內(nèi)容豐富短時間難以消化吸收，參考文獻(xiàn)和參考書推薦等。 應(yīng)答：時間有限、教室條件差、人數(shù)太多（82人）、專業(yè)較多，考慮放慢速度、進(jìn)行必要互動、加強(qiáng)交流。,主要內(nèi)容,生物芯片 基因芯片（DNA芯片） 蛋白質(zhì)芯片（Protein Chips） 細(xì)胞芯片 組織芯片 高通量篩選,生物芯片,生物芯片(biochip) 是指采用微量點(diǎn)樣等方式,

2、將核酸片段、多肽分子、組織切片和細(xì)胞等生物樣品有序地固定于支持物(如玻片、硅片、尼龍膜等載體) 的表面,組成密集二維陣列,然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中的靶分子進(jìn)行雜交、或用免疫組織化學(xué)、原位雜交等技術(shù)使待檢分子可視化,最后通過特定的儀器如激光共聚焦掃描儀或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)(CCD) 對可視化信號的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析,從而判斷樣品中靶分子的相對數(shù)量。由于常用玻片/ 硅片作為固相支持物,且在制備過程模擬計算機(jī)芯片的制備技術(shù),所以稱之為生物芯片技術(shù)。,生物芯片,根據(jù)芯片上固定的生物物質(zhì)的不同,生物芯片分為基因芯片( Genechip) 、蛋白質(zhì)芯片(proteinchip) 、細(xì)胞芯

3、片(cellchip) 、組織芯片(tissuechip) ;如芯片上固定的是寡核苷酸或DNA ,就稱為基因芯片或DNA 微陣列(DMA Microarray) ;又如芯片上固定的是組織,就稱為組織芯片。,基因芯片（Gene Chips）,定義：就是按特定的排列方式固定有大量基因探針/基因片段的硅片、玻片、塑料。 基因芯片技術(shù)是高效地大規(guī)劃獲取相關(guān)生物信息的重要手段。 應(yīng)用領(lǐng)域: 主要有基因表達(dá)譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預(yù)測、藥物篩選、基因測序。,基因芯片作用原理,采用高速打印或光刻合成技術(shù)可在硅片、玻璃或尼龍膜上制造DNA 微陣列即基因芯片； 樣品D

4、NA/RNA 通過PCR 擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子, 與微陣列雜交后通過熒光掃描儀器掃描及計算機(jī)分析即可獲得樣品中大量基因序列及表達(dá)的信息。,Flow chart of cDNA microarray,基因制備方法,分為兩大類: 一類是原位合成; 一類是直接點(diǎn)樣； 原位合成適用于寡核苷酸; 直接點(diǎn)樣多用于大片段DNA , 有時也用于寡核苷酸, 甚至mRNA。 原位合成有兩種途徑。一是光刻法; 一是壓電打印法。光刻法可以合成30n t 左右, 打印法可以合成40250n t, 光刻法每步縮合率較低, 一般說噴印法特異性應(yīng)比光刻法高。此外, 噴印法不需特殊的合成試劑。 與原位合成法比較

5、點(diǎn)樣法較簡單, 只需將預(yù)先制備好的寡核苷酸或cDNA 等樣品通過自動點(diǎn)樣裝置點(diǎn)于經(jīng)特殊處理的玻離片或其它材料上即可。,芯片的種類,電子芯片：帶有陽電荷的硅芯片、芯片經(jīng)熱氧化, 制成1mm 1mm 的陣列、每個陣列含多個微電極, 在每個電極上通過氧化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將連接鏈親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上, 在電場作用下生物素標(biāo)記的探針即可結(jié)合在特定電極上。 三維芯片： 三維生物芯片實(shí)質(zhì)上是一塊顯微鏡載玻片, 其上有10, 000 個聚乙烯酰胺凝膠條, 每個凝膠條可用于靶DNA , RNA 和蛋白質(zhì)的分析。先把已知化合物加在凝膠條上, 再用3cm 長的微型玻璃毛細(xì)管將待測樣品加到凝膠條上。每

6、個毛細(xì)管能把小到012n l 的體積打到凝膠上。,基因芯片應(yīng)用,基因表達(dá)譜分析 新基因發(fā)現(xiàn) 基因突變及多態(tài)性分析 基因組文庫作圖 疾病診斷和預(yù)測 藥物篩選 基因測序,,基因表達(dá)譜分析,基因芯片技術(shù)可清楚地直接快速地檢測出以1: 300, 000 水平出現(xiàn)的mRNA , 且易于同時檢測成千上萬的基因。 Lockhart 等人對芯片技術(shù)定量檢測基因表達(dá)及其敏感性、特異性進(jìn)行了研究。在陣列的雜交實(shí)驗中, 從克隆cDNA文庫或直接從細(xì)胞mRNA 制備標(biāo)記RNA 靶, 用于雜交的RNA 靶通過體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)摻入熒光素標(biāo)記的核糖核苷酸制備, 然后隨機(jī)地將該RNA 靶裂解為平均50100 個堿基大小的片段,

7、樣品與陣列雜交30 分鐘到22 小時, 陣列的熒光影像用特制的掃描共聚焦顯微鏡檢測。,新基因發(fā)現(xiàn),定量檢測大量基因表達(dá)水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療靶等方面是很有價值的。 如該技術(shù)在炎癥性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA ) 和炎癥性腸病( IBD) 的基因表達(dá)研究中,由RAIBD 組織制備探針, 用Cy3 和Cy5 熒光素標(biāo)記, 然后與靶cDNA 微陣列雜交, 可檢測出炎癥疾病誘導(dǎo)的基因如TNF 或粒細(xì)胞集落刺激因子, 同時發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)的基因如HME 基因和黑色素瘤生長刺激因子。,DNA序列分析,人類基因組計劃的實(shí)施促進(jìn)了更高效率的、能夠自動化操作的測序方法的發(fā)展

8、。芯片技術(shù)中雜交測序( SBH ) 技術(shù)及鄰堆雜交(CSH) 技術(shù)一種新的高效快速測序方法。 用含65，536 個8聚寡核苷酸的微陣列, 采用SBH 技術(shù), 可測定200bp 長DNA 序列, 采用67, 108, 864 個13 個聚寡核苷酸的微陣列, 可對數(shù)千個堿基長的DNA 測序。SBH 技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加而提高, 但微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加則提高了微陣列的復(fù)雜性, 降低了雜交準(zhǔn)確性。CSH 技術(shù)彌補(bǔ)了SBH 技術(shù)存在的弊端, CSH 技術(shù)的應(yīng)用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長度, 加強(qiáng)了序列準(zhǔn)確性, 可進(jìn)行較長的DNA 測序。,突變體和多態(tài)性的檢測,S

9、HB 技術(shù)可大規(guī)模地檢測和分析DNA 的變異及多態(tài)性。 Guo 等人利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸(A SO s) 微陣列建立了簡單快速的基因多態(tài)性分析方法。將A SO s 共價固定于玻璃載片上, 采用PCR 擴(kuò)增基因組DNA , 其一條引物用熒光素標(biāo)記, 另一條引物用生物素標(biāo)記, 分離兩條互補(bǔ)的DNA 鏈, 將熒光素標(biāo)記DNA 鏈與微陣列雜交, 通過熒光掃描檢測雜交模式, 即可測定PCR 產(chǎn)物存在的多種多態(tài)性, 該方法對人的酪氨酸酶基因第4 個外顯子內(nèi)含有的5 個單堿基突變進(jìn)行分析, 結(jié)果顯示單堿基錯配與完全匹配的雜交模式非常易于區(qū)別。這種方法可快速、定量地獲得基因信息。,疾

10、病診斷和預(yù)測,,Cancer Array 腫瘤基因芯片,基因芯片狀況,自從1996年美國Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于藥物篩選和實(shí)驗室試驗用的生物芯片。 美國的Hyseq公司、Syntexi公司、Nanogen公司、Incyte公司及日本、歐洲各國都積極開展DNA 芯片研究工作；摩托羅拉、惠普、IBM等跨國公司也相繼投以巨資開展芯片研究。 預(yù)計在今后五年內(nèi)生物芯片銷售可達(dá)200-300億美元；據(jù)財富雜志預(yù)測(97.3)，在21世紀(jì)，生物芯片對人類的影響將可能超過微電子芯片。,基因芯片狀況,我國在生物芯片研究方面剛剛起步，98年10月，中科院將基因芯片列為“”九五”特別支持項

11、目，利用中科院在微電子技術(shù)、生化技術(shù)、物理檢測技術(shù)方面的優(yōu)勢，組織跨所、跨學(xué)科合作。 現(xiàn)在在微陣列芯片和基于MEBS的芯片方面有大的突破，在DNA芯片設(shè)計、基片修飾、探針固定、樣品標(biāo)記、雜交和檢測等方面的技術(shù)都有較大的進(jìn)展，已研制出肝癌基因差異表達(dá)芯片、乙肝病毒多態(tài)性檢測芯片、多種惡性腫瘤病毒基因芯片等有一定實(shí)用意義的基因芯片和DNA芯片檢測儀樣機(jī)。,蛋白質(zhì)芯片,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是指把制備好的蛋白質(zhì)樣品固定于經(jīng)化學(xué)修飾的玻片、硅片等載體上,蛋白質(zhì)與載體表面結(jié)合,同時仍保留蛋白質(zhì)的物化性質(zhì)和生物活性。蛋白質(zhì)芯片是高通量、微型化和自動化的蛋白質(zhì)分析技術(shù)。 蛋白質(zhì)芯片主要分兩種: 1）一種類似于芯片,

12、即在固相支持物表面高密度排列的探針蛋白點(diǎn)陣,可特異地捕獲樣品中的靶蛋白,然后通過檢測器對靶蛋白進(jìn)行定性或定量分析。 2）另一種就是微型化的凝膠電泳板。在電場作用下,樣品中的蛋白質(zhì)通過芯片上的孔道分離開來,經(jīng)噴霧直接進(jìn)入質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測,以確定樣品中蛋白質(zhì)的分子量及種類。,抗體蛋白質(zhì)芯片原理,原理,蛋白質(zhì)芯片是將已知蛋白點(diǎn)印在固定于不同種類支持介質(zhì)上,制成由高密度的蛋白質(zhì)或多肽分子的微陣列組成蛋白微陣列,其中每個分子的位置及序列為已知,并將待測蛋白質(zhì)與該芯片進(jìn)行孵育反應(yīng),再將熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)與芯片 蛋白質(zhì)復(fù)合物反應(yīng),當(dāng)熒光標(biāo)記的靶分子與芯片上的分子結(jié)合后,可通過激光掃描系統(tǒng)或電荷偶聯(lián)照像系統(tǒng)(）

13、, 對熒光信號的強(qiáng)度進(jìn)行檢測,進(jìn)一步對雜交結(jié)果進(jìn)行量化分析,檢測蛋白質(zhì)的存在情況。,蛋白質(zhì)芯片應(yīng)用,蛋白質(zhì)芯片應(yīng)用,疾病診斷和療效判定 研究蛋白質(zhì)的相互作用 發(fā)現(xiàn)藥物或毒物作用靶位和作用機(jī)制,發(fā)展,日開發(fā)出廉價蛋白質(zhì)芯片 ：開發(fā)成功可迅速檢測癌癥等疾病的廉價蛋白質(zhì)芯片。把目前數(shù)十萬日元一個的蛋白質(zhì)芯片價格降到了僅為幾千日元。預(yù)計這種芯片在4年內(nèi)可以使用。 光學(xué)蛋白質(zhì)芯片是一種基于橢圓偏振光原理，利用抗原和抗體以及受體與配體特異性的結(jié)合，將分子間的相互作用轉(zhuǎn)換為可直接讀取的灰度值，對檢測樣品進(jìn)行定量檢測的方法。它由于無須對探針分子進(jìn)行標(biāo)記，因此有利于對蛋白質(zhì)進(jìn)行活性分析。應(yīng)用后冠心病檢測加速。,

14、發(fā)展,中國科學(xué)家研制的丙型肝炎蛋白質(zhì)芯片獲國家藥監(jiān)局頒發(fā)的生物制品一類新藥證書。這不僅是我國的第一個獲新藥證書的硅基材料蛋白質(zhì)芯片，也是迄今為止世界上惟一得到政府藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)頒發(fā)新藥證書的蛋白質(zhì)芯片。 兩英寸大小的蛋白質(zhì)芯片已由深圳益生堂生物企業(yè)有限公司投產(chǎn)。只需要微升（一滴血的十分之一）血清或血漿，小時后就能檢測出結(jié)果。而每次的檢測費(fèi)用只有元左右。,細(xì)胞芯片,新型的細(xì)胞芯片, 其原理是應(yīng)用細(xì)胞膜表面不同的抗原物質(zhì), 與結(jié)合在玻片上的不同抗體發(fā)生特異性結(jié)合, 通過自動捕獲能力將所獲細(xì)胞固定在特定區(qū)域, 以此對淋巴瘤細(xì)胞進(jìn)行診斷和分類。 細(xì)胞芯片的制作: 每種抗體與pH1012 的Tris2

15、HCl 緩沖液等體積稀釋, 通過生物芯片點(diǎn)樣儀自動點(diǎn)樣, 將8 種抗體分別點(diǎn)在醛基玻片上的各自區(qū)域, 每一抗體點(diǎn)4 個點(diǎn), 直徑約2mm 左右, 形成4 8 微陣列。點(diǎn)樣后迅速將玻片置于濕盒中,4 冰箱水化, 過夜。,細(xì)胞芯片應(yīng)用,疾病診斷,胸腔液中淋巴瘤細(xì)胞檢測,發(fā)展,最近出現(xiàn)了一種細(xì)胞微陣列芯片，他是將不同的質(zhì)粒DNA點(diǎn)在玻璃片上做成質(zhì)粒DNA芯片，接著在脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑處理好的芯片上培養(yǎng)細(xì)胞，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞因此獲得了外源DNA賦予的新性狀，因此也稱為反向轉(zhuǎn)染(reverse transfection). 這種技術(shù)不但可以用于 cDNA、融合肽或RNA分子的分析，而且還可以用于研究一些細(xì)胞因子、

16、化學(xué)抑制劑或放射性標(biāo)記對基因表達(dá)的影響.,組織芯片,Kononen 等(1998) 年在自然雜志上首次報道了組織芯片這一高通量的技術(shù)。 組織芯片技術(shù)可以將數(shù)十個甚至上千個不同個體的臨床組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計的順序排列在一張玻片進(jìn)行分析研究，是一種高通量、多樣本的分析工具。它使科研人員第一次有可能同時對幾百甚至上千種正?；蚣膊∫约凹膊“l(fā)展不同階段的自然病理生理狀態(tài)下的組織樣本，進(jìn)行某一個或多個特定的基因，或與其相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的研究。,應(yīng)用,如Kononen等使用標(biāo)準(zhǔn)免疫組化方法利用組織芯片技術(shù)研究了645例各種乳腺癌組織標(biāo)本，試驗數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)病理切片相應(yīng)研究結(jié)果完全一致；同時他們還發(fā)現(xiàn)有關(guān)p53等6種

17、基因的檢測結(jié)果表明，新鮮與石蠟包埋的組織標(biāo)本的檢測結(jié)果沒有差異。 Hedenfalk等結(jié)合組織芯片技術(shù)和基因芯片技術(shù)檢測了原發(fā)性乳腺癌及組織標(biāo)本。 Hoos等用組織芯片技術(shù)對59例成纖維細(xì)胞瘤進(jìn)行免疫表型分析。Mucci等用組織芯片證實(shí)了神經(jīng)內(nèi)分泌因素與前列腺癌進(jìn)展的關(guān)系。,高通量篩選（High Throughput Screen， HTS）,,新藥發(fā)現(xiàn),細(xì)胞分析平臺HTS,HTS,90年代初期,一個實(shí)驗室采用傳統(tǒng)的方法,借助20余種藥物作用靶位,一年內(nèi)僅能篩選75000個樣品;到了1997年HTS發(fā)展的初期,采用100余種靶位,每年可篩選1000000個樣品;而到1999年,由于HTS的進(jìn)一

18、步完善,每天的篩選量就高達(dá)100000種化合物2,因而,稱之為超高通量篩選(ultrahigh-throughput screening)。這種新的飛躍,將大大加速新藥發(fā)現(xiàn)的速度。,HTS,高通量藥物篩選技術(shù)是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來的一種用于尋找新藥的高新技術(shù),由于該技術(shù)的快速、高效等特點(diǎn),受到國際藥物研究機(jī)構(gòu)的極大重視。 高通量藥物篩選技術(shù)是將多種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)合而形成的新的技術(shù)體系,它以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗方法為基礎(chǔ),以微板形式作為實(shí)驗工具載體,以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗過程,以靈敏快速的檢測儀器采集實(shí)驗數(shù)據(jù),以計算機(jī)對實(shí)驗獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,在同一時間內(nèi)對數(shù)以千、萬計的樣品進(jìn)

19、行檢測,并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫支持整個技術(shù)體系的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。,HTS原理,高通量篩選分析通常在96孔板上進(jìn)行,采用自動化技術(shù)對流體進(jìn)行分配并對微孔板進(jìn)行處理,化合物、藥物活性的檢測在微孔板中進(jìn)行,這種分析模式至今仍被廣泛采用,但許多研究機(jī)構(gòu)已轉(zhuǎn)向384孔板或孔數(shù)更高、體積更小的分析模式。 現(xiàn)今,國外許多制藥公司已把高通量篩選作為發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的主要手段。典型的高通量篩選模式為每次篩選1000個化合物；而超高通量篩選可每天篩選10萬多個化合物。隨著分析容量的增大,分析檢測技術(shù)、液體處理及自動化,還有連續(xù)流動以及信息處理已成為制約高通量篩選發(fā)展的瓶頸。因此,為減少成本和降低操作費(fèi)用,高通量篩選須向自動化、

20、分析微量化方向發(fā)展。,HTS的樣品,采用HTS進(jìn)行篩選的樣品主要有組合化學(xué)庫、天然化合物、化學(xué)合成化合物、反義核酸、肽核酸、可溶性蛋白等。 目前已將生物芯片技術(shù)用于HTS藥物篩選研究,如正在改進(jìn)Calipers顯微流態(tài)芯片以用于HTS。,HTS篩選模型,高通量藥物篩選模型可以根據(jù)其生物學(xué)特點(diǎn)分為以下幾類：受體結(jié)合分析法。酶活性測定法。細(xì)胞因子測定法。細(xì)胞活性測定法。代謝物質(zhì)測定法?；虍a(chǎn)物測定法等等。,FMAT 8100 HTS熒光高通量篩選系統(tǒng)（美國AB公司）,FMAT8100系統(tǒng)是全世界第一臺全自動Macro-Confocal共聚焦式高通量熒光篩選系統(tǒng),她由Appliedbiosystem

21、s公司和Becton Dickinson(BD公司)共同合作研制. 它具有樣品量大（最多60塊96孔或384孔/板）；篩選速度快（75000樣品/天）；操作簡便、無需進(jìn)行放射性標(biāo)記等特點(diǎn). 待測樣品與熒光分析試劑自動混合后直接分析熒光強(qiáng)度,不必洗脫,并可自動機(jī)械傳送樣品板,對每一樣品孔進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測.,基于親近閃爍檢測(SPA)的HTS,基于親近閃爍檢測(Scintillation Proximity Assay，SPA)方法的高通量藥物篩選技術(shù)平臺由國家新藥篩選中心在國內(nèi)建立； 上世紀(jì)90年代由葛蘭素史克等跨國制藥公司首先開發(fā)應(yīng)用，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低廉和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，非常適

22、合于自動化的藥物高通量篩選； 利用SPA技術(shù)對數(shù)十個定向合成化合物進(jìn)行過氧化物增殖子活化受體g(PPARg)結(jié)合力的測定中，發(fā)現(xiàn)了幾個具有良好生物活性的“苗頭”化合物，為創(chuàng)新藥物的研究開發(fā)提供了方向。,SPA原理,親近閃爍檢測法(Scintillation Proximity Assay，SPA)：該技術(shù)使用能激發(fā)產(chǎn)生冷光的特制平板或圓球微粒，其底部或外層包被有連接分子，能高容量地結(jié)合藥物靶位(如受體、酶等生物活性分子)，后者與同位素標(biāo)記的配體特異性結(jié)合，在近距離釋放射線能量激發(fā)產(chǎn)生冷光，繼而被探測器所監(jiān)測；不能特異性結(jié)合的小分子，其標(biāo)記同位素所發(fā)出的射線能量大部分被水溶液散射，而不足以激發(fā)產(chǎn)生冷光。這一方法在實(shí)驗過程中無需分離步驟，可連續(xù)觀測，適用于自動化操作和高通量藥物篩選。,第十二講,走進(jìn)21世紀(jì)的我國新藥研究與開發(fā),