結(jié)直腸癌中黑色素瘤抗原基因mRNA的表達(dá)及意義

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1、結(jié)直腸癌中黑色素瘤抗原基因mRNA的表達(dá)及意義 【摘要】 目的 檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中黑色素瘤抗原基因mage1、3和4的表達(dá)，探討其在結(jié)直腸癌免疫治療及作為免疫分子標(biāo)志物的可行性。方法 采用rtpcr方法，檢測(cè)65例結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)正常粘膜組織中mage1、3和4的mrna表達(dá)，并對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行dna測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果 65例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中，53.8%（35/65)的患者至少表達(dá)一種mage基因。mage1、3、4 mrna表達(dá)率分別是18.5%(12/65)、33.9%(22/65)和20%(13/65)，表達(dá)任意兩種或以上的mage基因的標(biāo)本為27.7%(18/65)，

2、而相應(yīng)正常粘膜組織均未檢測(cè)到上述基因的表達(dá)。dna測(cè)序結(jié)果表明rtpcr產(chǎn)物確為目的基因片段。mage基因表達(dá)與患者的年齡(除外mage1,p=0.011)、性別、cea、腫瘤大小和位置、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度及tnm分期無(wú)關(guān)(p>0.05)。結(jié)論 結(jié)直腸癌中mage3可作為腫瘤疫苗的備選基因和免疫學(xué)檢測(cè)的分子標(biāo)志物，具有作為腫瘤免疫治療特異性靶位的潛在價(jià)值，而mage1,4因表達(dá)率低限制了其應(yīng)用價(jià)值。 【關(guān)鍵詞】 黑色素瘤抗原基因 結(jié)直腸腫瘤 mrna表達(dá) 黑色素瘤抗原基因（melanoma antigen gene，mage）是首先從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤特異

3、性抗原基因，主要表達(dá)于以黑色素瘤為主的惡性腫瘤組織中，現(xiàn)已證實(shí)在肝、胃、肺等惡性腫瘤中有較高的表達(dá)，而在正常組織（除睪丸和胎盤(pán)外）不表達(dá)[1]，其表達(dá)又與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系十分密切。WWw.133229.coM利用這一特點(diǎn)可作為腫瘤免疫治療理想的靶抗原。應(yīng)用mage基因編碼的抗原肽對(duì)黑色素瘤及轉(zhuǎn)移瘤的腫瘤免疫治療的實(shí)驗(yàn)和臨床研究正在進(jìn)行，并已取得較好的療效[2,3]。但mage基因在結(jié)直腸癌中表達(dá)的研究較少且結(jié)果不一。為了解mage基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)特點(diǎn)，我們采用rtpcr方法檢測(cè)mage1、3和4在結(jié)直腸癌中表達(dá)狀況，為研制結(jié)直腸癌特異性的腫瘤疫苗及開(kāi)展以此為靶抗原的免疫治療

4、提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 組織標(biāo)本 65例結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)的正常粘膜組織標(biāo)本，均取自2005年7月～11月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院手術(shù)治療的患者。男44例，女21例；年齡30～80歲，中位年齡55.0歲。其中，高中分化腺癌57例；粘液腺癌3例，復(fù)發(fā)2例；低分化癌2例，復(fù)發(fā)1例。腫瘤分期和分級(jí)根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果按最新國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)tnm分期[4]，who標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)，其中ⅰ期8例，ⅱ期32例，ⅲ期16例，ⅳ9例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例。所有病例術(shù)前均未進(jìn)行放化療。標(biāo)本采集：癌組織取癌灶周邊無(wú)明顯壞死的腫瘤組織，正常組織取自距病灶10cm以上的正常粘

5、膜，組織大小約1cm1cm1cm。標(biāo)本在手術(shù)切除后10min內(nèi)放入液氮凍存，后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存。標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)。睪丸組織用作陽(yáng)性對(duì)照。 1.2 方法 1.2.1 rna提取及逆轉(zhuǎn)錄 用trizol提取組織總rna，紫外分光光度計(jì)測(cè)od值，以od260/od280＝1.8～2.0為rna質(zhì)量判斷標(biāo)準(zhǔn)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系含總rna 3μg，oligo(dt)18 0.5μg，10mmol/ldntp 2μl，rnase抑制劑20u，逆轉(zhuǎn)錄酶200u，總體積為20μl。逆轉(zhuǎn)錄完畢后70℃變性10min，冰上冷卻后-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。以上所用器材均為rnase free

6、。gapdh用作內(nèi)參照。 1.2.2 mage1、mage3和mage4基因的擴(kuò)增（25μl反應(yīng)體系） 以1μl cdna為pcr擴(kuò)增模板，加1.5μl mgcl2，2.5μl 10buffer，1μl dntps ，1μl引物(包括mage、gapdh)，0.2μl taq 酶，16.8μl 滅菌水。各基因的引物[5]及反應(yīng)條件見(jiàn)表1。反應(yīng)完成后取5μl pcr產(chǎn)物，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，少量溴乙錠染色鑒定。于紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果。采用biorad凝膠圖像分析系統(tǒng)攝片。表1 rtpcr引物序列和反應(yīng)條件 1.2.3 mage1、mage3和mage

7、4基因擴(kuò)增產(chǎn)物dna的測(cè)序 隨機(jī)選取三種mage基因的陽(yáng)性pcr產(chǎn)物（各3例）進(jìn)行純化和序列測(cè)定。pcr產(chǎn)物純化采用bioflux試劑盒，操作按說(shuō)明進(jìn)行。送上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行dna測(cè)序。 1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件spss10.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行pearson χ2 檢驗(yàn)或fisher確切概率法檢驗(yàn),以p2 結(jié)果 2.1 不同mage基因的表達(dá) mage1、3和4三種基因在不同結(jié)直腸癌組織標(biāo)本表達(dá)情況見(jiàn)表2。65例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中mage mrna表達(dá)頻率最高的是mage3，表達(dá)率為33.9%(22/65)，mage1和mage4分別是1

8、8.5%(12/65)和20%(13/65)。內(nèi)參照gapdh在所有組織標(biāo)本中均有穩(wěn)定表達(dá)，且強(qiáng)度基本一致，證實(shí)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna的完整性,見(jiàn)圖1。dna測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增條帶均為目的基因。所有正常粘膜組織中均未檢測(cè)出上述mage基因中任何一種的表達(dá)。表2 結(jié)直腸癌組織mage1、3和4基因的陽(yáng)性表達(dá) 2.2 mage基因表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 三種mage基因的表達(dá)與患者年齡(除外mage1，p=0.007)、性別、cea、腫瘤大小和位置、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度及tnm分期無(wú)關(guān)，結(jié)果見(jiàn)表3。 2.3 結(jié)直腸癌標(biāo)本中mage基因表達(dá)的聚集性 65例癌組織中三

9、種mage基因表達(dá)呈不均勻分布，部分癌組織基因表達(dá)呈聚集性。53.8%(35/65)的癌癥患者至少表達(dá)一種抗原基因，其中mage1、3同時(shí)表達(dá)為12.3%(8/65)，mage1、4為10.7%(7/65)，mage3、4為9.2%(6/65)，三種同時(shí)表達(dá)9.2%(6/65)。 2.4 三種mage基因擴(kuò)增產(chǎn)物dna的測(cè)序 dna測(cè)序表明三種mage基因的rtpcr產(chǎn)物與genebank數(shù)據(jù)庫(kù)（mage1、3、4基因的登錄號(hào)分別為nm_004988.3、nm_005362.3、nm_001011548.1）檢索序列一致，證實(shí)所得目的基因的序列正確。 3 討論

10、 mage基因家族位于x染色體上，除睪丸和胎盤(pán)組織外，在正常組織中均不表達(dá)，但在肝、胃、肺等惡性腫瘤中表達(dá)，其編碼的抗原肽可與mhc分子表3 mage基因表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系注：*為淋巴結(jié)陰性組與陽(yáng)性組mage表達(dá)率比較的p值，#為淋巴結(jié)n1組與n2組比較的p值結(jié)合遞呈到細(xì)胞表面，被t細(xì)胞識(shí)別，從而激活抗腫瘤免疫應(yīng)答[1]。因此mage基因編碼蛋白成為腫瘤免疫治療的靶抗原，以此抗原為主組成的疫苗是目前腫瘤疫苗研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)[2,3]。自1991年van der bruggen 等用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)首次在黑色素瘤細(xì)胞中分離出mage1基因以來(lái)，許多學(xué)者對(duì)不同mage基因在不同惡性腫

11、瘤組織的表達(dá)進(jìn)行了廣泛研究，但有關(guān)mage基因在結(jié)直腸癌中表達(dá)的報(bào)道很少且各家報(bào)道的結(jié)果不一。scanlan等[6]在關(guān)于mage基因的綜述中提出結(jié)直腸癌屬于mage基因低表達(dá)的腫瘤(以不足30％的基因家族在一種腫瘤中的表達(dá)率>20%為標(biāo)準(zhǔn))。park等[7]研究38例結(jié)直腸癌病例的結(jié)果顯示，mage1未見(jiàn)一例表達(dá)，mage3和mage4陽(yáng)性表達(dá)率分別為5.3%和16.7%，有36.3%的腫瘤標(biāo)本至少表達(dá)一種基因，其表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤組織學(xué)分型、dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(p>0.05)。本實(shí)驗(yàn)僅有mage1表達(dá)與年齡有關(guān)(p=0.011)，分析原因可能與本組病例老年患者偏

12、少有關(guān)。gerhardt等[8]研究26例結(jié)直腸癌手術(shù)病例的癌組織及癌旁組織、手術(shù)切緣和8種細(xì)胞株的16種腫瘤抗原基因(主要為mage)的表達(dá)情況，認(rèn)為85%的標(biāo)本至少表達(dá)一種腫瘤抗原，其中mage1表達(dá)率為58%，而mage3未見(jiàn)表達(dá)。而li等[5]研究121例結(jié)直腸癌標(biāo)本結(jié)果顯示mage1、3和4的陽(yáng)性表達(dá)率分別為11.6%、27.3%、22.3%。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mage基因1、3和4的陽(yáng)性表達(dá)率分別為18.5%、33.9%和20%，以mage3表達(dá)率較高，53.8%(35/65)的患者至少表達(dá)一種抗原基因，而表達(dá)與性別、cea值、腫瘤大小、位置、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、

13、腫瘤浸潤(rùn)深度、組織學(xué)分級(jí)及tnm分期無(wú)關(guān)，提示這些基因與腫瘤進(jìn)展情況及惡性程度無(wú)關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似。相應(yīng)正常結(jié)直腸粘膜組織均未檢測(cè)到基因表達(dá)，證實(shí)了mage在結(jié)直腸癌中的特異性表達(dá)，并有理由認(rèn)為mage編碼抗原可能成為結(jié)直腸癌特異性免疫治療的攻擊靶點(diǎn)。同時(shí)分析結(jié)直腸癌組織相同基因研究結(jié)果，各家不一，我們認(rèn)為原因可能有：①標(biāo)本數(shù)不同或標(biāo)本量太少不能說(shuō)明整體情況；②pcr引物設(shè)計(jì)及技術(shù)條件的差異；③不同人種表達(dá)的hla分子類(lèi)型不盡相同。 對(duì)mage基因表達(dá)的分析還發(fā)現(xiàn)，在所檢測(cè)的65例標(biāo)本中呈不均勻分布，表達(dá)任意兩種mage基因的標(biāo)本為27.7%(18/65)，三種同時(shí)表達(dá)9.2%(

14、6/65)，呈聚集性表達(dá)，即表達(dá)一種mage家族基因的標(biāo)本可同時(shí)表達(dá)其他一種或兩種以上的同一家族基因。mage基因聚集性表達(dá)為使用多價(jià)疫苗、增強(qiáng)免疫反應(yīng)提供了可能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mage3在國(guó)人結(jié)直腸癌中較高表達(dá)而正常組織不表達(dá)。這種現(xiàn)象就使臨床上有可能將其編碼蛋白作為免疫源用于結(jié)直腸癌的腫瘤免疫治療，而mage1和4因其較低的表達(dá)率限制了應(yīng)用價(jià)值，與上述研究者的預(yù)期結(jié)果相吻合。同時(shí)我們還注意到在tnm分期ⅰ、ⅱ的早期病例即有較高的表達(dá)（mage1、3和4的表達(dá)率分別為22.5%、32.5%和25％），說(shuō)明mage表達(dá)有可能是結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程中的早期事件，檢測(cè)mage基因表達(dá)有可能作為結(jié)

15、直腸癌免疫學(xué)檢測(cè)的分子標(biāo)志物，并且具有作為免疫治療、基因治療特異性靶位的潛在價(jià)值。 mage基因在結(jié)直腸癌組織的確切表達(dá)機(jī)制和功能還沒(méi)有完全研究清楚。dna甲基化是目前被廣泛接受的關(guān)于mage基因表達(dá)與沉默的機(jī)制，特別是啟動(dòng)子區(qū)域cpg 島甲基化的狀態(tài)直接影響基因的轉(zhuǎn)錄失活和表達(dá)[9]。dna甲基化異常一般發(fā)生在腫瘤發(fā)生的早期階段，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未顯示mage基因的表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)。因此，進(jìn)一步深入研究結(jié)直腸癌組織中dna甲基化對(duì)其表達(dá)調(diào)控的影響也是今后我們要研究的課題。 【參考文獻(xiàn)】[1]ries j,schultzemosgau s,neukam f,et al.invest

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