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1、實時定量 PCR （ qRT-PCR） 實時定量 PCR （ qRT-PCR） Polymerase Chain Reaction（ PCR） 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 偉大的天才發(fā)現(xiàn)！ Kary B. Mullis 1989年美國 Science雜志列 PCR 為十 余項重大科學(xué)發(fā)明之首 ,比喻 1989年為 PCR爆 炸年 ,Mullis榮獲 1993年度諾貝爾化學(xué)獎。 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時間（ min） 溫 度 （ ） 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù) 13步 2530輪 目的 DNA片段 擴增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復(fù)性 子鏈延伸
2、 DNA加倍 DNA 變 性 形 成2 條 單 鏈 PCR的基本原理 PCR的基本原理 模板 DNA 94 50-65 引物 1 引物 2 DNA引物 72 PCR的基本原理 引物 1 引物 2 DNA引物 72 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點 第 1輪結(jié)束 94 第 2輪開始 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點 50-65 Taq Taq Taq Taq 72 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點 第 2輪結(jié)束 PCR基本原理 Mg2+ 模板 引物 dNTP DNA 聚合酶 PCR PCR反應(yīng) 基本
3、要素 1、 單、雙鏈 DNA， cDNA均可 2、 不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合 酶抑制劑 DNA結(jié)合蛋白類 3、 一般 100ng DNA模板 /100L,模板濃度 過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加 （ 1）模板 1、引物濃度一般為 0.1-0.5 mol/L，濃度過高易 導(dǎo)致模板與引物錯配 ,反應(yīng)特異性下降 2、引物的設(shè)計 （ 2）引物 （ 3） Taq DNA聚合酶 1、酶的用量一般為 0.5-2.5 U/50 l， 2、酶量增加使反應(yīng)特異性下降 ;酶量過少 影響反應(yīng)產(chǎn)量。 （ 4） Mg2+ 1、 Mg2+是 DNA聚合酶的激活劑，一般用量為 0.5mmol/L-2.5mmol/L
4、反應(yīng)體系。 2、 Mg2+濃度過低會使 Taq酶活性喪失、 PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。 3、 Mg2+可與負離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中 dNTP、 EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的 Mg2+濃度。 1、 dNTP濃度取決于擴增片段的長度 2、四種 dNTP濃度應(yīng)相等 3、濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則 降低反應(yīng)產(chǎn)量 4、 dNTP可與 Mg2+結(jié)合，使游離的 Mg2+濃度下降， 影響 DNA聚合酶的活性。 （ 5） dNTP (1)變性 使雙鏈 DNA解鏈為單鏈 ,94 30-40s (2)退火 溫度由 引物長度 和 GC含量 決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特
5、異性結(jié) 合 ;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。 循環(huán)參數(shù) （ 3）延伸 68-75, 一般為 72 延伸時間由擴增片段長度決定 （ 4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模板 DNA的濃度 ,一般為 25-35次 次數(shù)過多 ,擴增效率降低 ,錯誤摻入率增加 常用 PCR反應(yīng)體系 (以 HiFi Taq為例 ) 模板 1.0 L 上游引物 0.5 L 下游引物 0.5 L 10X HiFi Buffer（ +Mg2+） 2.5 L dNTPs 2.0 L HiFi Taq酶 0.2-0.3 L ddH2O 補足 25 L 共 25 L 常用 PCR反應(yīng)條件 94 2-5min 94 30-40s Tm 30-45
6、s 72 1min/1kb 72 10min 12 + 25-35個循環(huán) 幾種常用 PCR技術(shù) RT-PCR (Reverse Transcription PCR) 反向 PCR (Reverse PCR) RACE (Rapid-Amplification of cDNA Ends) qRT-PCR (Quantitative Real Time PCR) 基因 mRNA 蛋白質(zhì)多肽鏈 RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄 PCR) DNA水平 RNA水平 蛋白水平 RT-PCR基本原理 mRNA AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT Reverse Transcription mRNA A
7、AAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT cDNA RT-PCR一般步驟 1、 RNA提取 RNA質(zhì)量的檢測 一般 RT-PCR要求提取的 RNA要有較高的 完整性 和 純度 完整性檢測（ 1%瓊脂糖膠電泳） 純度檢測（ OD260/280） OD260/280一般介于 1.9-2.1之間，小于 1.9 時蛋白污染；大于 2.1時 RNA發(fā)生降解 2 8 S 1 8 S 5 S 2、反轉(zhuǎn)錄 RT-PCR一般步驟 在冰盒上加入以下試劑： 組成 體積 隨機引物 或 Oligo dT） 1L 1-5g Total RNA xL DEPC-Treated H2O yL 體系配制完成后瞬時離心，
8、 70 反應(yīng) 5min,然后迅速轉(zhuǎn)移至冰盒，冰浴 2-5min, 此步驟的作用是 去除 mRNA的二級結(jié)構(gòu) 。 RT-PCR一般步驟 組成 體積 5X Buffer 4L dNTPs 1L RNAse inhibitor 1L M-MLV 1L DEPC-Treated H2O xL 1、混勻， 42 ， 90min 2、 70 ， 10min，終止反應(yīng) 3、 A3檢測 在冰盒上加入以下試劑： 反向 PCR (reverse） PCR) 已知序列 未知序列 未知序列 反向 PCR是用反向的互補引物來擴增兩引物以外 的 DNA片段對某個已知 DNA片段兩側(cè)的未知序列 進行擴增 。 可對未知序列擴
9、增后進行分析 ,如探索鄰接已知 DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長 cDNA的克隆 ,擴增基因文庫的插入 DNA；建立基 因組步移文庫。 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 連接酶 反向 PCR原理 cDNA 末端快速擴增技術(shù) (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)是一種基于 PCR技術(shù)從 低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴增 cDNA 的 5和 3 末端的有效方法 ,以其簡單、快速、廉價等優(yōu) 勢而受到越來越多的重視。 RACE (rapid-amplification of cDNA ends) AAAAAAAA mRNA 接頭序列 AAAAAA
10、AA mRNA GeneRacer 3Primer GSP2 GeneRacer 3Nested Primer NGSP2 Reverse transcription GeneRacer Oligo dT Primer TTTTTTTTTGTGACAGTACGGCAATGCATCGCATAGCAACTGTCG cDNA TTTTTTTTTGTGACAGTACGGCAATGCATCGCATAGCAACTGTCG 已知片段 RACE 3RACE原理 mRNA AAAAAA mRNA NNNNNNNNNNN AAAAAA Oligo dT Reverse Transcription NGSP1 Ge
11、neRacer 5Nested Primer GSP1 GeneRacer 5 Primer GeneRacer RNA Oligo Sequence NNNNNNNNNNN 接頭序列 TTTTTT NNNNNNNNNNN cDNA mRNA AAAAAA NNNNNNNNNNN 已知片段 5RACE原理 qRT-PCR (Quantitative Real Time PCR) 通過 熒光染料 或熒光標(biāo)記的特異性 探針 ,對 PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤 ,實時在線監(jiān)控反應(yīng)過 程 ,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進行分析 ,計 算待測樣品的初始模板量。 內(nèi)摻式染料 SYBR Green I 序列特異性探針
12、 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特異性探針 Amplifluor (Intergen) 1、 SYBR Green 法 SYBR Green 工作原理 SYBR Green法優(yōu)缺點 融解曲線（ dissociation curve） 正常 有非特異 性擴增 2、 TaqMan探針法 作 用 機 理 TaqMan TaqMan法與 SYBR Green I的 比較 幾個重要概念 基線（ Baseline） 熒光閾值（ threshold） 熒光閾值（ threshold） 是在熒光擴增曲線上 人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號 指數(shù)
13、擴增階段任意位置上，一般熒光域值的 設(shè)置是基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。熒光域值是 PCR3 15個循環(huán)熒光信 號標(biāo)準(zhǔn)差的 10倍，熒光域值設(shè)定在 PCR擴增 的指數(shù)期。 Ct值（ threshold value ） 每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定 的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 Ct 值。 研究表明，各模板的 Ct值與該模板 的 起始拷貝數(shù) 的對數(shù)存在線性關(guān)系， 起始拷貝數(shù)越多， Ct值越小。反之 亦然。 定量 PCR的數(shù)學(xué)原理 熒光定量 PCR的解析方法 相對定量 內(nèi)參基因 目的基因 1 2 0.2 內(nèi)參基因 內(nèi)參基因 ： qRT-PCR時，每個標(biāo)本都要做對 應(yīng)的內(nèi)參，而且每次
14、都是管家基因，一般用 -actin，有時也用 GAPDH。 管家基因 ：又稱 持家基因 (house-keeping genes)生物體各類細胞中都表達，其產(chǎn)物是 對維持細胞基本生命活動所必需的蛋白質(zhì)編 碼的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基 因與核糖體蛋白基因等。是為維持細胞基本 生命活動所需而時刻都在表達的基因。 內(nèi)參基因的選擇 理想的內(nèi)參基因應(yīng)該滿足以下條件 ： 1、不存在假基因，以避免基因 DNA的擴增 2、高度或中度表達，排除低表達 3、穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織（如正常細 胞和癌細胞），而且其表達量是近似的，無顯著性 差別 4、表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關(guān) 5、其穩(wěn)定
15、的表達水平與目標(biāo)基因相似 6、不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受 任何實驗處理措施的影響 常用內(nèi)參基因 家蠶常用內(nèi)參基因 Actin3 GAPDH sw22934 數(shù)據(jù) 處理（ Ct法） qRT-P C R的優(yōu)點及限制因素 qRT-PCR不僅實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的 飛躍，而且與常規(guī) PCR相比，它具有 操作簡 便 、 快速高效 、 敏感性 高 、 特異性 強 、有效 解決了 PCR污染 的問題、 自動化程度高 等特 點 qRT-PCR限制因數(shù) 實驗費用昂貴，需要設(shè)置多組重復(fù)和對照 怎樣避免擴增基因組 DNA、如何消除和評定由于樣品處理、 儀器的差異和個人操作而帶來的誤差以及如何更準(zhǔn)
16、確定量 基因？ 值得指出的是， qRT-PCR只能定量 mRNA水平，但 mRNA水平可能不能反映細胞中蛋白水平，因為在轉(zhuǎn)錄后 還有諸多調(diào)節(jié)因素。 要準(zhǔn)確而全面的了解機體的表達水平，除了分析 mRNA水 平外，還需要免疫組織化學(xué)和生物化學(xué)實驗的數(shù)據(jù)。 更多關(guān)于 qRT-PCR的信息，請參照 ： 引物設(shè)計 常用引物設(shè)計軟件： primer Premier， Oligo 序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴增區(qū)無同 源序列 引物長度： 17-25bp 堿基盡可能隨機分布 , GC%： 40%-60% 盡量避免 錯配（ False Priming)、引物二聚體 (Dimer)和 發(fā)夾結(jié)構(gòu)（ Hairpin） 引物設(shè)計 引物長度： 17-25bp GC%: 40-60% Tm:60 （ Primer Premier 5.0） 產(chǎn)物長度： 80-300bp,100-200bp最佳
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