《蛋白質(zhì)工程》課件

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1、蛋白質(zhì)工程與食品產(chǎn)業(yè) 內(nèi)容n一、蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)n二、蛋白質(zhì)工程的誕生n三、蛋白質(zhì)工程的基本步驟和改造方法n四、蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用 一、蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)n 1.1蛋白質(zhì)的功能n 1.2蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 1.1蛋白質(zhì)的功能n (1)蛋 白 質(zhì) 是 構(gòu) 成 生 命 的 重 要 物 質(zhì) 之 一n 蛋 白 質(zhì) 是 一 類 重 要 而 復(fù) 雜 的 生 物 大 分 子 ， 它 廣 泛 地 存 在于 所 有 生 物 界 的 機(jī) 體 之 中 ， 具 有 許 多 重 要 的 作 用 ：n 構(gòu) 成 生 物 體 新 陳 代 謝 的 幾 乎 全 部 的 化 學(xué) 反 應(yīng) 都 是 在 活 性蛋 白 質(zhì) -酶 的

2、 催 化 下 進(jìn) 行 的 ；n 高 等 動(dòng) 物 的 免 疫 反 應(yīng) ， 也 主 要 是 通 過 蛋 白 質(zhì) 即 抗 原 和 抗體 來 完 成 的 ； n 運(yùn) 動(dòng) 時(shí) 的 肌 肉 收 縮 靠 的 是 某 些 蛋 白 質(zhì) 的 相 互 作 用 來 完 成的 ；n 運(yùn) 輸 氧 和 二 氧 化 碳 的 是 血 紅 蛋 白 ；n 具 有 代 謝 和 調(diào) 節(jié) 功 能 的 是 多 種 蛋 白 質(zhì) 激 素 。 n (2) 蛋 白 質(zhì) 的 應(yīng) 用n 蛋 白 質(zhì) 是 人 類 賴 以 維 持 生 命 的 重 要 營 養(yǎng) 來 源 之一 。 人 們 需 要 從 各 種 肉 、 蛋 、 奶 、 豆 類 等 主 要 食 品中

3、 獲 得 所 需 的 蛋 白 質(zhì) 營 養(yǎng) 。n 用 蛋 白 質(zhì) 診 斷 和 治 療 某 些 疾 病 。 淀 粉 酶 、 脂 肪酶 、 蛋 白 酶 用 于 幫 助 消 化 ， 治 療 某 些 消 化 不 良 性 疾病 ； 胰 島 素 用 于 治 療 嚴(yán) 重 的 糖 尿 病 ； 轉(zhuǎn) 氨 酶 作 為 肝病 變 的 指 標(biāo) 等 。n 食 品 工 業(yè) 和 輕 工 業(yè) 中 主 要 應(yīng) 用 蛋 白 質(zhì) 或 利 用 蛋白 質(zhì) 的 性 質(zhì) 制 造 各 種 產(chǎn) 品 。 例 如 ， 釀 造 業(yè) 要 用 蛋 白酶 來 增 加 醬 油 的 鮮 味 等 。 用 于 人 類 衣 著 的 羊 毛 、 紡織 品 和 皮 革 主

4、 要 組 成 是 蛋 白 質(zhì) 。 1.2蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)n 氨 基 酸 是 蛋 白 質(zhì) 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 單 位 ， 各 種 氨 基 酸 之 間 通 過肽 鍵 彼 此 按 直 線 形 頭 尾 相 連 ， 構(gòu) 成 不 同 長 短 的 肽 鏈 。肽 鍵 的 形 成 n 肽 鏈 又 以 一 定 方 式 折 疊 盤 繞 成 獨(dú) 特 的 空 間 結(jié) 構(gòu) ， 這 時(shí) 才 產(chǎn) 生 具 有生 物 活 性 的 天 然 蛋 白 質(zhì) 。n 多 肽 鏈 的 折 疊 可 分 為 四 種 不 同 層 次 的 結(jié) 構(gòu) 。 一 級 結(jié) 構(gòu) ： 僅 指 肽 鏈中 的 氨 基 酸 線 型 排 列 順 序 ， 不 考 慮 空 間 的

5、 排 列 。 牛 胰 島 素 的 氨 基 酸 序 列 n 二 級 結(jié) 構(gòu) ： 主 鏈 原 子 的 局 部 空 間 排列 ， 不 包 括 側(cè) 鏈 構(gòu) 象 和 與 其 他 鏈 段的 相 互 關(guān) 系 ， 如 -螺 旋 、 -折 疊 等主 鏈 構(gòu) 象 單 元 就 是 二 級 結(jié) 構(gòu) 。 -螺 旋 三 級 結(jié) 構(gòu) ： 蛋 白 質(zhì) 的 多 肽 鏈 在 各 種 二 級 結(jié) 構(gòu) 的 基 礎(chǔ) 上 再進(jìn) 一 步 盤 曲 或 折 疊 形 成 具 有 一 定 規(guī) 律 的 三 維 空 間 結(jié) 構(gòu) 。 碳 酸 酐 酶 的 多 肽 骨 架 示 意 圖 n 四 級 結(jié) 構(gòu) ： 具 有 二 條 或 二 條 以 上 獨(dú) 立 三

6、級 結(jié) 構(gòu) 的 多 肽鏈 組 成 的 蛋 白 質(zhì) ， 其 多 肽 鏈 間 通 過 次 級 鍵 相 互 組 合 而形 成 的 空 間 結(jié) 構(gòu) 。 其 中 ， 每 個(gè) 具 有 獨(dú) 立 三 級 結(jié) 構(gòu) 的 多肽 鏈 單 位 稱 為 亞 基 。 四 級 結(jié) 構(gòu) 實(shí) 際 上 是 指 亞 基 的 立 體排 布 、 相 互 作 用 及 接 觸 部 位 的 布 局 。 如 血 紅 蛋 白 分 子中 四 個(gè) 亞 基 之 間 的 空 間 關(guān) 系 。血 紅 蛋 白 的 結(jié) 構(gòu) 內(nèi)容n一、蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)n二、蛋白質(zhì)工程的誕生n三、蛋白質(zhì)工程的基本步驟和改造方法n四、蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用 二、蛋白質(zhì)工程的誕

7、生n 蛋 白 質(zhì) 工 程 是 指 基 于 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 功 能 的研 究 結(jié) 果 ， 通 過 基 因 工 程 技 術(shù) ， 改 造 現(xiàn)有 蛋 白 質(zhì) 和 設(shè) 計(jì) 制 造 新 蛋 白 質(zhì) ， 因 而 也稱 為 第 二 代 基 因 工 程 。 n 美 國 斯 坦 福 大 學(xué) 的 Charles Yanofsky教 授 ， 在 1987年 的 美 國 微生 物 學(xué) 會(huì) 的 年 會(huì) 上 說 ， 生 物 理 論 和 技 術(shù) 在 下 列 九 方 面 的 發(fā)展 促 進(jìn) 了 蛋 白 質(zhì) 工 程 的 誕 生 。 新 的 克 隆 技 術(shù) ， 特 別 是 完整 的 cDNA的 克 隆 技 術(shù) ； 快 速 測 定

8、 DNA序 列 的 方 法 ； 從DNA序 列 推 算 蛋 白 質(zhì) 序 列 的 較 好 的 計(jì) 算 機(jī) 程 序 系 統(tǒng) ； 蛋白 質(zhì) 序 列 數(shù) 據(jù) 庫 的 建 立 ， 使 一 級 結(jié) 構(gòu) 相 似 的 蛋 白 質(zhì) 能 被 很快 地 鑒 定 出 來 ， 并 由 此 研 究 其 功 能 上 的 相 似 性 ； 對 原 核生 物 和 真 核 生 物 基 因 表 達(dá) 調(diào) 控 的 進(jìn) 一 步 深 入 了 解 ； 用 于基 因 體 外 誘 變 的 化 學(xué) 、 酶 學(xué) 和 合 成 技 術(shù) 的 進(jìn) 展 ； X-光 晶體 學(xué) 的 進(jìn) 展 ， 包 括 較 好 的 長 晶 體 策 略 、 同 步 輻 射 的 應(yīng) 用

9、 、電 子 區(qū) 域 檢 測 器 的 出 現(xiàn) ， 以 及 計(jì) 算 機(jī) 輔 助 的 數(shù) 據(jù) 分 析 ； 用 計(jì) 算 機(jī) 圖 像 系 統(tǒng) 為 工 具 直 接 觀 察 晶 體 數(shù) 據(jù) ； 核 磁 共 振技 術(shù) 的 改 進(jìn) ， 使 溶 液 中 的 原 子 分 布 能 得 到 直 接 檢 測 。 內(nèi)容n一、蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)n二、蛋白質(zhì)工程的誕生n三、蛋白質(zhì)工程的基本步驟和改造方法n四、蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用 三、蛋白質(zhì)工程的基本步驟和改造方法n 3.1 蛋白質(zhì)工程研究的基本步驟n 3.2 蛋白質(zhì)改造方法 3.1 蛋白質(zhì)工程研究的基本步驟n 分 離 純 化 目 的 蛋 白 ， 使 之 結(jié) 晶 并 作

10、 X晶 體 衍 射 分 析 ， 結(jié)合 核 磁 共 振 等 其 他 方 法 的 分 析 結(jié) 果 ， 得 到 其 空 間 結(jié) 構(gòu)的 盡 可 能 多 的 信 息 。n 對 目 的 蛋 白 的 功 能 作 詳 盡 的 研 究 ， 確 定 它 的 功 能 域 。n 通 過 對 蛋 白 質(zhì) 的 一 級 結(jié) 構(gòu) 、 空 間 結(jié) 構(gòu) 和 功 能 之 間 的 相互 關(guān) 系 的 分 析 ， 找 出 關(guān) 鍵 的 基 團(tuán) 和 結(jié) 構(gòu) 。n 在 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 研 究 的 基 礎(chǔ) 上 ， 借 助 于 計(jì) 算 機(jī) 圖像 顯 示 和 分 子 輔 助 設(shè) 計(jì) ， 提 出 對 目 的 蛋 白 分 子 的 改 建

11、或 構(gòu) 建 方 案 ， 并 用 基 因 工 程 的 方 法 去 實(shí) 施 。 n 對 經(jīng) 過 改 造 的 蛋 白 質(zhì) 進(jìn) 行 功 能 性 測 定 ， 看 看 改 造 的 效果 如 何 。 蛋 白 質(zhì) 工 程 的 程 序 3.2 蛋白質(zhì)改造方法n 3.2.1 天然蛋白質(zhì)的改造n 3.2.1.1 基因的定向誘變技術(shù)n 3.2.1.2 結(jié)構(gòu)域的拼接 3.2.1.1 基因的定向誘變技術(shù)n 一 般 ， 含 有 單 一 或 少 數(shù) 幾 個(gè) 突 變 位 點(diǎn) 的基 因 定 向 改 變 可 以 采 用 M13-DNA寡 聚 核苷 酸 介 導(dǎo) 誘 變 技 術(shù) 、 寡 核 苷 酸 介 導(dǎo) 的PCR誘 變 技 術(shù) 、

12、隨 機(jī) 誘 變 技 術(shù) 和 盒 式 突變 技 術(shù) 。 （1）M13-DNA寡聚核苷酸介導(dǎo)誘變技術(shù).將 要 改 造 的 蛋 白 質(zhì) 的 目 的 基 因 插 入 到 M13單 鏈 DNA中作 為 模 板 ， 以 含 有 要 改 變 的 堿 基 的 一 段 寡 聚核 苷 酸 作 為 引 物 ， 在 體 外 用 DNA聚 合 酶 進(jìn) 行雙 鏈 DNA的 合 成 ， 用 DNA連 接 酶 連 接 成 環(huán)狀將 雜 合 DNA雙 鏈 再 轉(zhuǎn) 入 大 腸 桿 菌 中 將 含 突 變 目 的 基 因 的 M13噬 菌 體 篩 選 出 來 ，提 取 它 們 的 DNA， 用 限 制 性 內(nèi) 切 酶 把 突 變 目

13、的 基 因 切 下 ， 并 重 組 到 表 達(dá) 質(zhì) 粒 中 （2）寡核苷酸介導(dǎo)的PCR誘變技術(shù)將目的基因克隆到質(zhì)粒載體上設(shè)計(jì)兩對引物由于兩個(gè)反應(yīng)物中引物的位置不同，PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物有不同的末端 將兩管PCR產(chǎn)物混合、變性、復(fù)性、退火，形成有兩個(gè)切口的環(huán)狀DNA，轉(zhuǎn)入大腸桿菌。 （3）隨機(jī)誘變技術(shù)將 待 突 變 基 因 克 隆 到 質(zhì) 粒 上 ， 使 基因 旁 有 兩 個(gè) 特 殊 的 限 制 性 酶 切 位 點(diǎn)用 大 腸 桿 菌 核 酸 外 切 酶 EIII從3 -凹 陷 端 降 解 DNA 用 修 復(fù) 后 的 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 化 大 腸 桿 菌 大 腸 桿 菌 DNA聚 合 酶 的 Klenow

14、片 段 是 完 整 的DNA聚 合 酶 的 一 個(gè) 片段 ， 只 有 在 5 3聚 合酶 活 性 和 3 5 外 切酶 活 性 ， 失 去 了 5 3外 切 酶 活 性反 應(yīng) 一 段 時(shí) 間 后 終 止 反 應(yīng) ， 再 用Klenow片 段 補(bǔ) 平 （4）盒式突變技術(shù)在目標(biāo)基因中選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)用含有突變序列的DNA片段來置換目標(biāo)基因上的一段DNA序列產(chǎn)生突變序列被集中在目標(biāo)基因的一個(gè)特定區(qū)域的突變家族 產(chǎn)生突變序列被集中在目標(biāo)基因的一個(gè)特定區(qū)域的突變家族 n 進(jìn) 行 盒 式 突 變 ， 需 要 解 決 兩 個(gè) 關(guān) 鍵 問 題 ：n 一 個(gè) 是 在 目 標(biāo) 基 因 序 列 中 ， 要

15、 有 適 當(dāng) 的 限 制 性 內(nèi) 切酶 識 別 位 點(diǎn) ， 使 得 用 以 取 代 天 然 DNA序 列 的 盒 式 突 變序 列 可 以 有 效 地 插 入 到 目 標(biāo) 基 因 中 。n 另 一 個(gè) 是 ， 如 何 得 到 各 種 合 適 的 、 用 以 取 代 目 標(biāo) 基因 中 特 定 DNA片 段 的 突 變 DNA片 段 。 值 得 注 意 的 是 ，突 變 序 列 的 兩 端 必 須 分 別 具 有 與 目 標(biāo) 基 因 上 相 匹 配 的的 限 制 性 內(nèi) 切 酶 識 別 位 點(diǎn) 。 n 盒 式 突 變 技 術(shù) 的 實(shí) 際 應(yīng) 用 ：n 加 酶 洗 衣 粉 是 人 們 日 常 生 活

16、 中 常 用 的 東 西 ， 在 洗 衣粉 中 常 加 入 的 酶 是 枯 草 桿 菌 蛋 白 酶 。 枯 草 桿 菌 蛋 白 酶有 一 個(gè) 弱 點(diǎn) ， 一 遇 到 漂 白 劑 ， 就 會(huì) 被 破 壞 而 失 去 活 性。 枯 草 桿 菌 酶 氧 化 失 活 的 原 因 是 由 于 第 222位 的 甲 硫 氨酸 的 被 氧 化 造 成 的 ， 但 還 不 知 道 哪 一 種 氨 基 酸 替 換 甲硫 氨 酸 能 維 持 酶 的 活 性 ， 并 同 時(shí) 使 它 具 有 抗 氧 化 的 特性 。 使 用 盒 式 突 變 技 術(shù) ， 1985年 發(fā) 現(xiàn) 只 有 半 光 氨 酸 取代 的 突 變 酶

17、 活 力 比 原 酶 提 高 138%， 并 可 在 過 氧 化 氫 （一 種 氧 化 劑 ） 存 在 小 時(shí) 不 丟 失 酶 活 力 。 這 樣 就 制 成了 合 乎 需 要 的 漂 白 加 酶 洗 衣 粉 了 。 3.2.1.2 結(jié)構(gòu)域的拼接n 結(jié) 構(gòu) 域 是 蛋 白 質(zhì) 構(gòu) 象 中 二 級 結(jié) 構(gòu) 與 三 級 結(jié) 構(gòu) 之 間 的 一個(gè) 層 次 。 在 較 大 的 蛋 白 質(zhì) 分 子 中 ， 由 于 多 肽 鏈 上 相 鄰的 超 二 級 結(jié) 構(gòu) 緊 密 聯(lián) 系 ， 形 成 二 個(gè) 或 多 個(gè) 在 空 間 上 可以 明 顯 區(qū) 別 它 與 蛋 白 質(zhì) 亞 基 結(jié) 構(gòu) 的 區(qū) 別 。n 結(jié) 構(gòu)

18、 域 拼 接 是 通 過 基 因 操 作 把 位 于 兩 種 不 同 蛋 白 質(zhì) 上的 幾 個(gè) 結(jié) 構(gòu) 域 連 接 在 一 起 ， 形 成 融 合 蛋 白 ， 它 兼 有 原來 兩 種 蛋 白 的 性 質(zhì) 。 n 金 屬 硫 蛋 白 是 一 類 小 分 子 量 的 球 蛋 白 ， 哺 乳 動(dòng) 物 中 的 金 屬硫 蛋 白 分 子 由 61個(gè) 氨 基 酸 殘 基 組 成 ， 分 為 兩 個(gè) 結(jié) 構(gòu) 域 ， 分別 叫 結(jié) 構(gòu) 域 和 結(jié) 構(gòu) 域 。 結(jié) 構(gòu) 域 能 結(jié) 合 4個(gè) 金 屬 離 子 ， 趨向 于 與 鎘 和 汞 結(jié) 合 ； 而 結(jié) 構(gòu) 域 能 結(jié) 合 3個(gè) 金 屬 離 子 ， 趨 向于

19、 與 鋅 和 銅 結(jié) 合 。 實(shí) 驗(yàn) 表 明 ， 結(jié) 構(gòu) 域 結(jié) 合 鎘 的 能 力 比 結(jié)構(gòu) 域 高 出 1000倍 以 上 。n 用 計(jì) 算 機(jī) 分 子 模 型 軟 件 對 金 屬 硫 蛋 白 的 空 間 結(jié) 構(gòu) 進(jìn) 行 分 析表 明 ， 天 然 金 屬 硫 蛋 白 的 兩 個(gè) 結(jié) 構(gòu) 域 之 間 具 有 較 大 的 獨(dú) 立性 ， 是 可 以 拆 分 和 構(gòu) 建 的 ， 因 而 構(gòu) 建 結(jié) 構(gòu) 域 的 “ 二 倍 體 ”的 設(shè) 想 是 可 行 的 。n 用 化 學(xué) 合 成 的 方 法 分 別 合 成 結(jié) 構(gòu) 域 和 連 接 肽 段 的 基 因 ， 并設(shè) 法 將 它 們 拼 接 起 來 。

20、再 插 入 載 體 并 轉(zhuǎn) 入 植 物 細(xì) 胞 中 ， 使金 屬 硫 蛋 白 的 結(jié) 構(gòu) 域 多 倍 體 基 因 在 植 物 中 表 達(dá) 。 3.2.2 合成全新蛋白質(zhì)n 基 于 天 然 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 改 造 的 蛋 白 質(zhì) 工 程可 以 優(yōu) 化 蛋 白 質(zhì) 的 活 性 ， 而 全 新 蛋 白 質(zhì)設(shè) 計(jì) 是 合 成 具 有 新 奇 的 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 的 新蛋 白 質(zhì) 。 從 頭 設(shè) 計(jì) 一 個(gè) 蛋 白 質(zhì) 的 基 本 步 驟 ： 構(gòu) 建 一 個(gè) 多 肽 鏈 骨 架模 型從 已 知 三 維 結(jié) 構(gòu) 的 數(shù) 據(jù) 庫 中 挑 選 出一 個(gè) 合 適 的 片 段 ， 進(jìn) 行 修 改 和 組

21、合 依 據(jù) 氨 基 酸 殘 基 的 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 數(shù) 據(jù) 和 排列 的 優(yōu) 先 順 序 ， 確 定 每 個(gè) 殘 基 位 置上 的 氨 基 酸優(yōu) 化 目 標(biāo) 蛋 白 的 三 維 模 型 檢 驗(yàn) 和 考 核 所 給 定 的 目 標(biāo) 蛋 白 質(zhì) 結(jié)構(gòu) 是 否 合 理 ， 對 所 設(shè) 計(jì) 的 模 型 做 進(jìn)一 步 修 正 幾 輪 的 設(shè) 計(jì) 、 檢 驗(yàn) 和 再 設(shè) 計(jì) ， 獲 得一 個(gè) 正 確 折 疊 和 帶 有 人 們 預(yù) 期 功 能的 目 標(biāo) 蛋 白 質(zhì) 內(nèi)容n一、蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)n二、蛋白質(zhì)工程的誕生n三、蛋白質(zhì)工程的基本步驟和改造方法n四、蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用 四、蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)

22、中的應(yīng)用n 在 實(shí) 際 生 產(chǎn) 中 ， 可 以 應(yīng) 用 蛋 白 質(zhì) 工 程 對 一些 生 產(chǎn) 中 重 要 酶 或 蛋 白 質(zhì) 性 質(zhì) 加 以 改 造 ，提 高 現(xiàn) 有 酶 或 蛋 白 質(zhì) 的 工 業(yè) 實(shí) 用 性 ， 如 提高 酶 的 熱 穩(wěn) 定 性 、 改 變 酶 的 最 適 pH值 條件 、 提 高 酶 的 催 化 活 性 等 。 例 如 ， 通 過 引入 二 硫 鍵 ， 改 善 酶 的 熱 穩(wěn) 定 性 。 n 溶 菌 酶 是 一 種 廣 泛 應(yīng) 用 于 食 品 工 業(yè) 的 酶 制 劑 ， 其 催 化 速 率隨 溫 度 升 高 而 升 高 ， 因 此 ， 它 的 熱 穩(wěn) 定 性 是 提 高

23、其 應(yīng) 用 潛力 的 重 要 標(biāo) 準(zhǔn) 。n 蛋 白 質(zhì) 晶 體 結(jié) 構(gòu) 研 究 表 明 ， T4溶 菌 酶 分 子 的 一 個(gè) 重 要 特 性是 在 第 97位 和 54位 殘 基 上 是 兩 個(gè) 未 形 成 二 硫 鍵 的 半 胱 氨 酸 ，所 以 ， 設(shè) 想 通 過 在 分 子 中 增 加 一 對 或 數(shù) 對 二 硫 鍵 ， 來 提 高酶 熱 穩(wěn) 定 性 。n 研 究 表 明 ， 采 用 定 位 突 變 技 術(shù) 使 該 菌 肽 鏈 第 9位 和 第 164位 氨基 酸 殘 基 轉(zhuǎn) 變 為 半 胱 氨 酸 ， 并 形 成 一 對 二 硫 鍵 ， 獲 得 的 突變 體 的 酶 活 性 高 于 天 然 酶 6%， 熔 點(diǎn) 溫 度 提 高 6.4度 ， 顯 然 ，新 引 入 的 “ 工 程 二 硫 鍵 ” 能 夠 穩(wěn) 定 兩 個(gè) 結(jié) 構(gòu) 域 之 間 的 相 對位 置 ， 進(jìn) 而 穩(wěn) 定 了 由 兩 個(gè) 結(jié) 構(gòu) 域 所 形 成 的 活 性 中 心 。 思考題n 1.什 么 是 蛋 白 質(zhì) 工 程 ？ 它 與 基 因 工 程 有 何關(guān) 聯(lián) ？n 2.什 么 是 定 位 突 變 技 術(shù) ？ 它 包 括 哪 些 常 用方 法 ？