生物化學(xué)課件第三章核酸化學(xué)

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1、生 物 化 學(xué)Biochemistry第 三 周 第 二 講2010.9.30 蛋 白 質(zhì) 章 節(jié) 測(cè) 驗(yàn) 1班 級(jí) 、 學(xué) 號(hào) 、 姓 名問(wèn) 題 一 ：u 如 何 通 過(guò) 樣 品 中 的 含 氮 量 （ N%） 來(lái) 大 致 地 推 測(cè) 樣 品 中粗 蛋 白 的 含 量 （ Pro%） ？u 解 釋 這 樣 推 測(cè) 的 依 據(jù) 是 什 么 ？問(wèn) 題 二 ：u維 持 蛋 白 質(zhì) 一 、 二 、 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 主 要 作 用 力 分 別 有 那 些 ？問(wèn) 題 三 ：u凝 膠 過(guò) 濾 分 離 蛋 白 質(zhì) 的 依 據(jù) 和 原 理 ？ 通 過(guò) 本 章 的 學(xué) 習(xí) 應(yīng) 該 明 確 以 下 幾 個(gè) 問(wèn)

2、 題 ：1、 核 酸 的 種 類(lèi) 、 基 本 組 成 單 位 是 什 么 ？ RNA的 三 種 主 要 形 式 是 什 么 ？ 它 們 分 別 承 擔(dān) 什 么 樣 的 生 物 功 能 ？2、 DNA和 RNA的 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 和 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 分 別 有 何 特 征 ？3、 什 么 是 DNA的 變 性 和 復(fù) 性 ？ 有 何 特 征 ？ 第 一 節(jié) 概 述一 、 核 酸 的 發(fā) 現(xiàn) 與 發(fā) 展1869年 核 酸 最 早 分 離 自 外 科 繃 帶 膿 細(xì) 胞 的 細(xì) 胞 核 ，當(dāng) 時(shí) 發(fā) 現(xiàn) 這 種 物 質(zhì) 含 磷 量 之 高 超 過(guò) 當(dāng) 時(shí) 發(fā) 現(xiàn) 的 任 何一 種 有 機(jī) 物 ， 并

3、 且 含 有 很 強(qiáng) 的 酸 性 ， 故 得 名 核 酸 。1909年 其 組 成 被 研 究 清 楚 ， 1944年 生 物 功 能 初 步 澄清 ， 后 來(lái) 在 X射 線(xiàn) 衍 射 技 術(shù) 支 持 下 建 立 雙 螺 旋 結(jié) 構(gòu) 模型 。 核 酸 的 分 類(lèi) 及 分 布 存 在 于 細(xì) 胞 核 和 線(xiàn) 粒 體 內(nèi) 。存 在 于 胞 核 、 胞 液 和 線(xiàn) 粒 體 。(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脫 氧 核 糖 核 酸 核 糖 核 酸 攜 帶 遺 傳 信 息 ， 決 定 細(xì) 胞 和 個(gè)體 的 遺 傳 型 (genotype

4、)。參 與 遺 傳 信 息 的 復(fù) 制 與 表 達(dá) 。某 些 病 毒 RNA也 可 作 為 遺 傳 信息 的 載 體 。 DNA RNA 蛋 白 質(zhì)復(fù) 制 復(fù) 制轉(zhuǎn) 錄反 轉(zhuǎn) 錄 翻 譯 染 色 體 的 結(jié) 構(gòu)示 意 圖 核 酸核 苷 酸磷 酸 核 苷戊 糖 堿 基 水解核 酸 的 化 學(xué) 組 成除 含 C、 H、 O、 N外 ， 還 含 有 較 多 的 磷 和 少 量 的 硫 ， 含 磷 量 在 9 10 一 、 磷 酸 （ phosphate） OH HO-P=O OH 二 、 戊 糖（ 構(gòu) 成 RNA）核 糖 (ribose) （ 構(gòu) 成 DNA）脫 氧 核 糖 (deoxyribose

5、) 124 5 3 O OHOH HH H CH2OH H OH O HOH HH H CH2OH H OH12 34 5 嘌 呤 嘧 啶 堿 基 腺 嘌 呤 （ A）鳥(niǎo) 嘌 呤 （ G）胞 嘧 啶 （ C）胸 腺 嘧 啶 （ T）尿 嘧 啶 （ U） DNA、 RNA均 有DNA有RNA有每 種 核 酸 都 含 有 四 種 堿 基 。三 、 堿 基 （ nitrogenous base） 嘌 呤 (purine) N N NH N 1 2345 678 9 N N NH N NH2腺 嘌 呤 (adenine, A) N NH NH N NH2 O鳥(niǎo) 嘌 呤 (guanine, G) 堿 基

6、 N NH1 32456 嘧 啶 (pyrimidine)胞 嘧 啶 (cytosine, C) N NH NH2 O 尿 嘧 啶 (uracil, U)NH NHO O胸 腺 嘧 啶 (thymine, T) NH NH O O CH3 四 、 核 苷 （ nucleoside)核 苷 是 核 糖 與 堿 基 (嘌 呤 堿 或 嘧 啶 堿 )結(jié) 合 物 。 嘌 呤 核 苷 是 嘌 呤 的 第 9位 N與 核 糖 或 脫 氧 核 糖第 1位 碳 連 接 ； 嘧 啶 核 苷 是 嘧 啶 的 的 第 1位 N與 核 糖 或 脫 氧 核糖 第 1位 碳 連 接 ； 堿 基 和 核 糖 （ 或 脫 氧

7、 核 糖 ） 通 過(guò) 糖 苷 鍵 連接 形 成 核 苷 (nucleoside) （ 或 脫 氧 核 苷 ） 。 腺嘌呤核苷 N N NN9NH2 O OHOH HH H CH2OH H 12 糖苷鍵 胞嘧啶脫氧核苷 1N NO NH2 12O HOH HH HCH2OHH 糖苷鍵 核 苷 酸 ：AMP, GMP, UMP, CMP脫 氧 核 苷 酸 ：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP 核 苷 （ 脫 氧 核 苷 ） 和 磷 酸 以 酯 鍵 連 接 形 成 核苷 酸 （ 脫 氧 核 苷 酸 ） 。 糖苷鍵酯鍵 腺苷酸 N N N N9 NH2 O OHOH HH H CH2 H 1

8、2 OPO-HO O 5 核 苷 酸 是 核 苷 的 磷 酸 酯 。 核 糖 核 苷 酸 的 磷 酸 酯 有 三 種 形 式(2、 3和 5位 )； 脫 氧 核 糖 核 苷 酸 的 磷 酸 酯 有 兩 種 形 式(3和 5位 )。 八 種 核 苷 酸 如 下 表 所 示 RNA的 名 稱(chēng) 為 某 苷 (一 磷 )酸 ， DNA在 某 前 加 脫 氧 兩 字 。例 如 ： AMP稱(chēng) 腺 苷 一 磷 酸 (或 腺 苷 酸 ） ， dAMP稱(chēng) 為 脫 氧 腺 苷 一 磷 酸 （ 脫 氧 腺 苷 酸 ） 。 稀 有 核 苷 酸 與 上 類(lèi) 似 ； 腺 嘌 呤 A 鳥(niǎo) 嘌 呤 G 胞 嘧 啶 C 尿 嘧

9、 啶 U 胸 腺 嘧 啶 TRNA AMP G MP CMP UMP 未 發(fā) 現(xiàn)DNA dAMP dG MP dCMP 未 發(fā) 現(xiàn) dTMP l 多 磷 酸 核 苷 酸 ： NMP， NDP， NTP N N N N9 NH2 O OHOH HH H CH2 H 12 OPO-O OPO O-OPO-O O 一磷酸腺苷（AMP） 二磷酸腺苷（ADP） 三磷酸腺苷（ATP） 六 、 稀 有 組 分 （ Minor components）稀 有 組 分 是 稀 有 堿 基 和 稀 有 核 苷 的 總 稱(chēng) 。1、 稀 有 堿 基 （ Minor bases） 次 黃 嘌 呤 (I)、 黃 嘌 呤 (

10、X)、 5-甲 基 胞 嘧 啶 (m5C)、二 氫 尿 嘧 啶 (Dhu )、 5-羥 甲 基 胞 嘧 啶 (hm5C)2、 稀 有 核 苷 （ Minor nucleoside） 假 尿 嘧 啶 核 苷 ( )、 次 黃 嘌 呤 核 苷 、 二 氫 尿 嘧啶 核 苷 。 一 、 核 酸 的 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 核 酸 的 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 是 指 核 苷 酸 的 組 成 及 排 列順 序 （ 即 堿 基 序 列 ） 。 DNA、 RNA都 是 由 許 多 核 苷 酸 通 過(guò) 3、 5磷 酸 二 酯 鍵 將 前 一 個(gè) 核 苷 酸 與 后 一 個(gè) 核苷 酸 連 接 起 來(lái) ， 形 成 無(wú) 分 支 的

11、 多 核 苷 酸鏈 。 在 鏈 的 一 端 的 一 個(gè) 戊 糖 的 3位 上 OH是 游離 存 在 的 ， 另 一 端 的 戊 糖 其 5位 上 連 有 一個(gè) 磷 酸 基 團(tuán) 呈 單 磷 酸 酯 狀 態(tài) ， 這 兩 個(gè) 末端 分 別 稱(chēng) 為 3末 端 及 5末 端 。 5端 3端核 苷 酸 之 間 以 3 , 5 -磷 酸 二 酯 鍵 連 接 形 成 多 核苷 酸 鏈 ， 即 核 酸 。 C GA DNA一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 簡(jiǎn) 寫(xiě) 形 式 核 苷 酸 順 序 又 稱(chēng) 堿 基 順 序 ， 是 蛋 白 質(zhì) 與 RNA結(jié) 構(gòu) 的 生 物 語(yǔ)言 。 戊 糖P 5 3首 端 末 端PP P P PP 書(shū)

12、 寫(xiě) 方 法 P P A P C P C P T P G OH C P T P A P A 5 3 pApCpTpG pCpTpApApC-OH 3 5 ACTG CTAAC3 5 DNA 與 RNA的 區(qū) 別核 酸 堿 基 戊 糖DNA A、 G、 C、 T 脫 氧 核 糖RNA A、 G、 C、 U 核 糖 二 、 DNA的 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu)雙 螺 旋 結(jié) 構(gòu) DNA雙 螺 旋 結(jié) 構(gòu) 模 型 的 要 點(diǎn) (1) DNA分 子 是 由 兩 條 反 平 行 的 多聚 脫 氧 核 苷 酸 鏈 ， 繞 同 一 中 心軸 盤(pán) 旋 形 成 的 右 手 螺 旋 結(jié) 構(gòu) ；(2) 每 條 主 鏈 由 脫

13、氧 核 糖 與 磷 酸通 過(guò) 3、 5磷 酸 二 酯 鍵 連 接 而成 ， 并 位 于 螺 旋 外 側(cè) 。 堿 基 位于 螺 旋 內(nèi) 側(cè) ， 堿 基 平 面 與 螺 旋中 心 軸 垂 直 。 螺 旋 表 面 有 兩 條螺 旋 形 的 凹 槽 大 溝 和 小 溝 。 (3) 兩 鏈 間 的 堿 基 以 氫 鍵 互 相 配 對(duì) 。 A與 T配 有 兩 個(gè)氫 鍵 ， G與 C配 有 三 個(gè) 氫 鍵 。DNA分 子 所 含 嘌 呤 堿 基 的 總 數(shù) 等 于 嘧 啶 堿 基 的 總 數(shù) (即A+G=T+C) 堿 基 當(dāng) 量 定 律 。(4)維 持 雙 螺 旋 穩(wěn) 定 的 因 素 ： 橫 向 為 氫 鍵

14、 ， 縱 向 為 堿基 間 的 堆 積 力 。 DNA堿 基 組 成 的 Chargaff規(guī) 則（ 1） 腺 嘌 呤 和 胸 腺 嘧 啶 的 摩 爾 數(shù) 相 等 ， 即 A T（ 2） 鳥(niǎo) 嘌 呤 和 胞 嘧 啶 的 摩 爾 數(shù) 也 相 等 ， 即 G C（ 3） 含 氨 基 的 堿 基 (腺 嘌 呤 和 胞 嘧 啶 )總 數(shù) 等 于 含 酮基 的 堿 基 (鳥(niǎo) 嘌 呤 和 胸 腺 嘧 啶 )總 數(shù) ， 即 A+C=G+T（ 4） 嘌 呤 的 總 數(shù) 等 于 嘧 啶 的 總 數(shù) ， 即 A+G=C+T所 有 DNA中 堿 基 組 成 必 定 是 A=T， G=C這 一 規(guī) 律暗 示 A與 T,

15、 G與 C相 互 配 對(duì) 的 可 能 性 ， 為 Watson和 Crick提 出 DNA雙 螺 旋 結(jié) 構(gòu) 提 供 了 重 要 根 據(jù) 。 DNA雙 螺 旋 結(jié) 構(gòu) 的 多 樣 性 Z型 DNAB型 DNAA型 DNA DNA的 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) DNA的 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 是 指 雙 螺 旋 DNA的 扭 曲 或 再 螺 旋 。 生 物 化 學(xué)Biochemistry第 四 周 第 二 講2010.10.9 RNA（ 核 糖 核 酸 ） 主 要 分 布 在 細(xì) 胞 質(zhì) 中 ， 與 蛋 白 質(zhì) 合 成 密 切 相 關(guān) Ribosomal RNAs (rRNA， 核 糖 體 RNA)占 80%以

16、上 ： 與蛋 白 質(zhì) 構(gòu) 成 核 糖 體 ， 是 合 成 蛋 白 質(zhì) 的 場(chǎng) 所 Messenger RNAs (mRNA， 信 使 RNA) 占 5%： 合 成 蛋 白質(zhì) 的 模 板 Transfer RNAs (tRNA ， 轉(zhuǎn) 運(yùn) RNA)占 15%： 在 蛋 白 質(zhì)合 成 中 運(yùn) 輸 氨 基 酸三 、 RNA的 結(jié) 構(gòu)RNA分 子 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 是 一 條 線(xiàn) 性 的 多 核 苷 酸 鏈 ， 由 四種 核 糖 核 苷 酸 以 3 ， 5 -磷 酸 二 酯 鍵 連 接 而 成 。 （ 一 ） 、 信 使 RNA的 結(jié) 構(gòu) 與 功 能2、 其 結(jié) 構(gòu) 模 式 為 5 -帽 子 -5

17、非 編 碼 區(qū) -編 碼 區(qū) -3 非 編 碼 區(qū) - 3 多聚 A1、 真 核 mRNA鏈 翻 譯 產(chǎn) 生 一 條 多 肽 鏈 。 5-帽 子 結(jié) 構(gòu)(1) 大 多 數(shù) 真 核 mRNA的 5末 端 均 在 轉(zhuǎn) 錄 后 加 上 一 個(gè) 7-甲 基 鳥(niǎo)苷 ， 經(jīng) 焦 磷 酸 與 mRNA的 5-末 端 核 苷 酸 相 連 ， 形 成 5，5-磷 酸 酯 鍵 。 同 時(shí) 第 一 個(gè) 核 苷 酸 的 C2可 能 也 是 甲 基 化 ，形 成 帽 子 結(jié) 構(gòu) （ 甲 基 鳥(niǎo) 苷 三 磷 酸 ） ： m7GpppN-。O NNNN NH2O OCH3O HH HCH2HOPO-OOHN N NOH2N

18、 N OOHH HH CH2HOH O POO-CH3 PO-O5 235* mRNA結(jié) 構(gòu) 特 點(diǎn) (2) 大 多 數(shù) 真 核 mRNA的 3末 端 有 一 個(gè) 多 聚 腺 苷 酸 (polyA)結(jié) 構(gòu) ， 稱(chēng) 為 多 聚 A尾 。多 聚 腺 苷 酸 （ 多 聚 A)的 尾 的 作 用 可 能 是 延 長(zhǎng) mRNA的 壽命 ， 從 而 可 以 增 加 蛋 白 質(zhì) 合 成 的 數(shù) 量 。此 外 ， 還 可 能 有 助 于 mRNA穿 過(guò) 核 膜 ， 進(jìn) 入 細(xì) 胞 質(zhì) 執(zhí) 行其 模 板 功 能 . mRNA核 內(nèi) 向 胞 質(zhì) 的 轉(zhuǎn) 位mRNA的 穩(wěn) 定 性 維 系翻 譯 起 始 的 調(diào) 控

19、帽 子 結(jié) 構(gòu) 和 多 聚 A尾 的 功 能mRNA的 功 能 ： 作 為 蛋 白 質(zhì) 合 成 的 模 板 。 * tRNA的 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 特 點(diǎn) 含 稀 有 堿 基 較 多 3末 端 為 CCA-OH 5末 端 大 多 數(shù) 為 G 由 70-90個(gè) 核 苷 酸 組 成(二 ） 、 轉(zhuǎn) 運(yùn) RNA的 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 稀 有 堿 基 HN NHO O R5 1 HN N NN HN CH2CH2NO O 7 O RI RDHU N N NNOH R mGH2N CH3 * tRNA的 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu)三 葉 草 形 氨 基 酸 臂額 外 環(huán) * tRNA的 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 倒 L形* tR

20、NA的 功 能活 化 、 搬 運(yùn) 氨 基 酸到 核 糖 體 ， 參 與 蛋 白 質(zhì)的 翻 譯 。 * rRNA的 結(jié) 構(gòu)（ 三 ） 、 核 糖 體 RNA的 結(jié) 構(gòu) 與 功 能* rRNA的 功 能參 與 組 成 核 糖 體 ，作 為 蛋 白 質(zhì) 生 物 合 成的 場(chǎng) 所 。 核 糖 體 的 組 成原 核 生 物 真 核 生 物小 亞 基 30S 40SrRNA 16S 18S蛋 白 質(zhì) 21種 33種大 亞 基 50S 60SrRNA 23S5S 28S5.8S5S蛋 白 質(zhì) 33種 49種核 糖 體 70S 80S 第 四 節(jié) 核 酸 及 核 苷 酸 的 性 質(zhì)一 、 一 般 理 化 性

21、質(zhì) 核 酸 為 多 元 酸 ， 具 有 較 強(qiáng) 的 酸 性 ；DNA是 線(xiàn) 性 高 分 子 ， 粘 度 極 大均 為 極 性 化 合 物 ， 難 溶 于 有 機(jī) 溶 劑 。 嘌 呤 堿 和 嘧 啶 堿 均 含 有 共 軛 雙 鍵 ， 因 此 ， 核 苷 、 核 苷 酸 、 DNA和 RNA在 240 290nm范 圍 內(nèi) 均 有 紫 外 吸 收 。最 大 吸 收 峰 在 260nm左 右 。二 、 紫 外 吸 收 性 質(zhì) 核 酸 的 紫 外 吸 收 性 質(zhì) 可 以 用 于 鑒 定 DNA和 RNA的 純 度 ，常 用 A260/A280比 值 來(lái) 判 斷 。純 DNA A260/A280=1.

22、8純 RNA A260/A280=2.0若 樣 品 的 蛋 白 質(zhì) 含 量 增 加 ， A260/A280比 值 怎 樣 變 化 ？ 增 色 效 應(yīng) (hyperchromic effect) 當(dāng) 核 酸 變 性 或降 解 時(shí) ， 其 紫 外 吸 收 顯 著 增 強(qiáng) ， 這 就 是 核 酸 的增 色 效 應(yīng) 。減 色 效 應(yīng) (hypochromic effect) 當(dāng) 變 性 的 核 酸在 一 定 條 件 下 恢 復(fù) 其 原 有 的 性 質(zhì) 時(shí) ， 其 紫 外 吸收 的 強(qiáng) 度 又 可 恢 復(fù) 到 原 有 的 水 平 ， 這 種 現(xiàn) 象 稱(chēng)為 減 色 效 應(yīng) 。 三 、 核 酸 和 核 苷

23、酸 的 兩 性 解 離 在 核 酸 和 核 苷 酸 分 子中 ， 既 含 有 可 以 給 出H+的 磷 酸 基 團(tuán) ， 又 含有 可 以 得 到 H+的 堿 性基 團(tuán) (堿 基 上 的 -N=，如 嘌 呤 的 N1和 N7， 胞 嘧啶 的 N3)， 所 以 核 酸 和核 苷 酸 是 兩 性 化 合 物 ，有 等 電 點(diǎn) 。 NNNN NH2 O HOH HH HHOP-O O-O5 脫 氧 腺 苷 一 磷 酸 四 、 核 酸 的 變 性 、 復(fù) 性 和 分 子 雜 交1、 變 性 (1) 概 念 核 酸 變 性 是 指 核 酸 分 子 中 雙 螺 旋 區(qū) 域 的 堿 基 對(duì) 之間 的 氫 鍵

24、受 某 些 理 化 因 素 的 作 用 而 破 壞 ， 變 成 單鏈 的 過(guò) 程 。 核 酸 變 性 不 涉 及 共 價(jià) 鍵 的 斷 裂 ， 所 以 變 性 后相 對(duì) 分 子 量 不 變 ， 但 其 理 化 性 質(zhì) 和 生 物 功 能都 會(huì) 發(fā) 生 變 化 ， 最 重 要 的 表 現(xiàn) 為 溶 液 粘 度 降 低沉 降 速 率 增 加紫 外 吸 收 顯 著 增 強(qiáng) DNA可 增 加 20-25% RNA可 增 加 10%左 右 。生 物 功 能 喪 失 或 減 弱 。 DNA變 性 的 本質(zhì) ： 雙 鏈 間氫 鍵 的 斷 裂 (2) 引 起 核 酸 變 性 的 因 素 高 溫極 端 pH (pH

25、10或 pH4)變 性 劑 (如 尿 素 等 )(3) DNA的 變 性 溫 度 (Tm):DNA的 變 性 不 是 隨 溫 度 升 高 而 逐 步 發(fā) 生 的 ， 而是 當(dāng) 溫 度 達(dá) 到 某 一 數(shù) 值 時(shí) ， 在 很 窄 的 溫 度 范 圍 內(nèi) ，變 性 突 然 發(fā) 生 并 迅 速 完 成 ， 就 象 晶 體 物 質(zhì) 達(dá) 到 熔點(diǎn) 時(shí) 突 然 融 化 一 樣 ， 這 一 溫 度 就 稱(chēng) 為 DNA的 變 性 溫度 ， 也 稱(chēng) 為 DNA的 熔 點(diǎn) ， 用 T m來(lái) 表 示 。 實(shí) 際 上 ， Tm是 增 色 效 應(yīng) 達(dá) 到 最 大 值 的 50%時(shí) 的 溫 度 。也 就 是 說(shuō) ， DN

26、A溶 液 的 溫 度 達(dá) 到 Tm時(shí) ， 將 有 50%的DNA雙 鏈 處 于 解 鏈 狀 態(tài) 。DNA的 Tm一 般 為 82 95 。Tm隨 DNA分 子 中 G-C堿 基 對(duì) 含 量 的 增 加 而 升 高 。 它也 與 溶 液 的 離 子 強(qiáng) 度 有 關(guān) ， 一 般 情 況 下 ， 離 子 強(qiáng)度 低 ， Tm值 小 。 2、 DNA的 復(fù) 性 變 性 的 DNA在 適 當(dāng) 條 件 下 ， 兩 條 彼 此 分 開(kāi) 的 互 補(bǔ)單 鏈 又 可 以 恢 復(fù) 堿 基 配 對(duì) ， 重 新 成 為 雙 螺 旋 ， 這 個(gè)過(guò) 程 稱(chēng) 為 DNA的 復(fù) 性 （ DNA renaturation） 。復(fù)

27、性 后 的 DNA的 某 些 理 化 性 質(zhì) 和 生 物 活 性 也 可 以得 到 部 分 或 全 部 恢 復(fù) 。 如 減 色 效 應(yīng) 。退 火 （ annealing） : 即 DNA由 單 鏈 復(fù) 性 變 成 雙 鏈 結(jié) 構(gòu) 的 過(guò) 程 。 來(lái) 源相 同 的 DNA單 鏈 經(jīng) 退 火 后 完 全 恢 復(fù) 雙 鏈 結(jié) 構(gòu) ， 不 同源 DNA之 間 、 DNA和 RNA之 間 退 火 后 形 成 雜 交 分 子 。 一 定 條 件 下 ， 去 除 變 性 因 素 后 ， 核 酸 恢 復(fù) 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu)及 生 物 活 性 的 現(xiàn) 象 退 火 （ annealing） (1) 降 溫 速 度 。

28、 若 熱 變 性 的 DNA從 高 溫 (Tm)迅 速冷 卻 至 低 溫 (4 以 下 )， 則 不 能 復(fù) 性 ， 此 過(guò) 程稱(chēng) 為 淬 火 。(2) DNA溶 液 的 濃 度 越 大 ， 互 補(bǔ) DNA鏈 片 段 碰 撞 機(jī)會(huì) 越 多 容 易 發(fā) 生 復(fù) 性 。(3) DNA片 段 越 大 ， DNA內(nèi) 部 的 順 序 越 復(fù) 雜 ， 擴(kuò) 散速 度 也 越 慢 ， 互 補(bǔ) 鏈 的 相 遇 機(jī) 會(huì) 也 越 小 ， 復(fù) 性也 越 難 。與 復(fù) 性 有 關(guān) 的 因 素 3、 分 子 雜 交 （ Hybridization ） 不 同 來(lái) 源 的 變 性 DNA， 若 彼 此 之 間 有 部 分

29、互 補(bǔ) 的核 苷 酸 順 序 ， 當(dāng) 它 們 在 同 一 溶 液 中 進(jìn) 行 熱 變 性 和退 火 處 理 時(shí) ， 分 子 間 部 分 配 對(duì) 成 雙 鏈 ， 這 個(gè) 過(guò) 程稱(chēng) 為 分 子 雜 交 。 將 膠 浸 泡 在 堿 溶 液 中 使 DNA進(jìn) 行 變 性 ， 然 后 將變 性 DNA轉(zhuǎn) 移 到 硝 酸 纖 維 素 膜 上 （ 硝 酸 纖 維 素膜 只 吸 附 變 性 DNA)， 在 80 烤 4 6小 時(shí) ， 使DNA牢 固 地 吸 附 在 硝 酸 纖 維 素 膜 上 。然 后 與 放 射 性 同 位 素 標(biāo) 記 的 變 性 后 的 DNA探 針進(jìn) 行 雜 交 。雜 交 須 在 較 高

30、 的 鹽 濃 度 及 適 當(dāng) 的 溫 度 (68 )下進(jìn) 行 數(shù) 小 時(shí) 或 十 余 小 時(shí) 。Southern印 跡 法 (Southern blotting) 應(yīng) 用 類(lèi) 似 的 方 法 也 可 用 于 分 析 RNA、 蛋 白 質(zhì) 。 將 RNA變 性 后 轉(zhuǎn) 移 到 硝 酸 纖 維 素 膜 再 進(jìn) 行 雜 交 ， 這方 法 稱(chēng) Northern印 跡 法 (Northern blotting)。 根 據(jù) 抗 體 與 抗 原 可 以 結(jié) 合 的 原 理 ， 也 可 以 分 析 蛋 白質(zhì) 。 這 個(gè) 方 法 稱(chēng) Western印 跡 法 (Western blotting) 核 酸 分 子

31、 中 含 有 核 糖 和 磷 酸 ， 它 們 可 以 分 別 與 專(zhuān) 一性 的 化 學(xué) 試 劑 發(fā) 生 顏 色 反 應(yīng) ， 作 為 定 性 、 定 量 檢 測(cè)核 酸 的 依 據(jù) 。六 、 核 酸 的 呈 色 反 應(yīng) (1) 核 糖 的 地 衣 酚 (3， 5-二 羥 基 甲 苯 )反 應(yīng) 用 于 定 量 測(cè) 定 RNA的 含 量 。 (2) 脫 氧 核 糖 的 二 苯 胺 反 應(yīng) 用 于 定 量 測(cè) 定 DNA的 含 量 。 (3) 核 酸 中 磷 酸 的 定 量 測(cè) 定 經(jīng) 典 的 鉬 藍(lán) 法 磷 酸 與 鉬 酸 銨 作 用 產(chǎn) 生 磷 鉬 酸 ， 其 在 還 原 劑 的 作用 下 形 成 藍(lán) 色 的 鉬 藍(lán) RNA和 DNA的 含 磷 量 分 別 為 9.2%和 9.5%。 核 酸 的 分 離 和 純 化核 酸 堿 基 順 序 分 析聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng)（ 自 學(xué) 內(nèi) 容 ）Frederick Sanger Kary Mullis