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1、高中生物選修一高中生物選修一 分解纖分解纖維素的微生物的分離維素的微生物的分離纖維素與纖維素酶纖維素與纖維素酶1.1.纖維素纖維素 纖維素是一種由纖維素是一種由葡萄糖葡萄糖首尾相連而成的首尾相連而成的高高分子分子化合物，是含量最豐富的化合物，是含量最豐富的多糖多糖類物質。類物質。一、基礎知識一、基礎知識 植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物的天然產(chǎn)物。土壤中某些微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶土壤中某些微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶,把把纖維素分解為葡萄糖后再利用。纖維素分解為葡萄糖后再利用
2、。纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質，纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過植物每年產(chǎn)生的纖維素超過7070億噸，其中億噸，其中40%-40%-60%60%能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物所利用，能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物所利用，不會大量積累。不會大量積累。在草食性動物等的消化道內，也在草食性動物等的消化道內，也共生有共生有分解纖維素的微生物分解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。能力。人類可應用分解纖維素的微生物將秸人類可應用分解纖維素的微生物將秸稈等廢棄物轉變
3、成酒精，用纖維素酶處理稈等廢棄物轉變成酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。服裝面料等。2.2.纖維素酶纖維素酶 纖維素酶是一種纖維素酶是一種復合酶復合酶，一般認為它，一般認為它至少至少包括三種組分包括三種組分，即，即C C1 1酶酶(外切酶外切酶)、C CX X酶酶(內切酶內切酶)和葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維二糖纖維二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纖維素纖維素取二支取二支20mL20mL的試管的試管實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗實驗
4、：纖維素酶分解纖維素的實驗各加入一張濾紙條各加入一張濾紙條各加入各加入pH4.8pH4.8，物質量為，物質量為0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液的醋酸醋酸鈉緩沖液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙試管中加入在乙試管中加入1mL1mL纖維素酶纖維素酶兩支試管固定在錐形瓶中，放在兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min140r/min的搖床上振蕩的搖床上振蕩1h1h結果：乙試管的濾紙條消失結果：乙試管的濾紙條消失 討論討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？什么？提示：提示：本實驗的本實驗的自變量是纖維素
5、酶的有無自變量是纖維素酶的有無，自變，自變量的操縱方法是：在一支試管中添加適量量的操縱方法是：在一支試管中添加適量（1mL1mL）的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加）的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素酶，但需加入等量的緩沖液，不能加入纖維素酶，但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，否則會影響溶液的蒸餾水，否則會影響溶液的pHpH。實驗分析：實驗分析：P P2727的小實驗是如何構成對照的小實驗是如何構成對照的？的？剛果紅染色法剛果紅染色法 剛果紅能與纖維素形成紅色復合物剛果紅能與纖維素形成紅色復合物，而不與，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應。水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應
6、。（二）纖維素分解菌的篩選（二）纖維素分解菌的篩選 當我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅當我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復紅色復合物合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖纖維素的復合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會出現(xiàn)維素的復合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們就，這樣我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌?？筛鶕?jù)是否可根據(jù)是否產(chǎn)生產(chǎn)生透明圈透明圈來篩選纖維來篩選纖維素分解
7、菌素分解菌二、實二、實 驗驗 設設 計計 請你根據(jù)實驗流程圖和提供的三個資料以及請你根據(jù)實驗流程圖和提供的三個資料以及“操作操作提示提示”，在思考有關問題的基礎上，設計出一個詳細的，在思考有關問題的基礎上，設計出一個詳細的實驗方案。實驗方案。土壤取樣土壤取樣選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)梯度稀釋梯度稀釋 將樣品涂布在鑒別纖將樣品涂布在鑒別纖 維素分解菌的培養(yǎng)基上維素分解菌的培養(yǎng)基上 篩選產(chǎn)生透篩選產(chǎn)生透 明圈的菌落明圈的菌落分布環(huán)境分布環(huán)境1 1、土壤取樣：、土壤取樣：富含纖維素的環(huán)境中富含纖維素的環(huán)境中操作步驟操作步驟 生物與環(huán)境的互相依存關系，在富含纖維素生物與環(huán)境的互相依存關系，在富含纖維素的環(huán)境中纖
8、維素分解菌的含量相對提高，因此從的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。境。原因原因實例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積實例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。累的枯枝敗葉等。討論討論:如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應該埋在土壤中多深？為濾紙應該埋在土壤中多深？將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實際上是人工設置纖維素
9、分解菌生存的集中，實際上是人工設置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應將濾紙埋于深約適宜環(huán)境。一般應將濾紙埋于深約10cm10cm左右的左右的土壤中。土壤中。2 2、選擇培養(yǎng)、選擇培養(yǎng) 增加纖維素分解菌的濃度增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。樣品中分離所需要的微生物。目的：目的：制備選擇培養(yǎng)基：制備選擇培養(yǎng)基：操作：操作：將土樣加入裝有將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)蕩培養(yǎng)12天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復選擇培養(yǎng)
10、。選擇培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成提供主要的營養(yǎng)物質提供主要的營養(yǎng)物質纖維素粉纖維素粉 5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g氮源、無機鹽氮源、無機鹽KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g無機鹽無機鹽酵母膏酵母膏 0.5g生長因子、碳源、氮源生長因子、碳源、氮源水解酵素水解酵素 0.5g氮素、生長因子氮素、生長因子溶解后，蒸餾水定容至溶解后，蒸餾水定容至1000mL水水提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照
11、培養(yǎng)基。可用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照,或者將纖或者將纖維素改為葡萄糖。維素改為葡萄糖。A A A A、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）B B B B、這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，、這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，、這個培養(yǎng)基對微生物
12、是否具有選擇作用？如果具有，、這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進行選擇的？是如何進行選擇的？是如何進行選擇的？是如何進行選擇的？有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。分解纖維素的微生物可以大量繁殖。C C C C、你能否設計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用、你能否設計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用、你能否設計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用、你能否設計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用 說明：說明：分析分析“纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方配方”可知，該配方中的
13、酵母膏也能夠提供少可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長繁殖。只不過，由于酵母膏的含量極少，生長繁殖。只不過，由于酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。繁殖。在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適適應應這種營養(yǎng)條件的微生物得到這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖迅速繁殖，而那，而那些些不適應不適應這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制抑制，因此可以起到因此可以起到“濃縮濃縮”的作用。的作用。為什么選擇
14、培養(yǎng)能夠為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮濃縮”所需的微生物？所需的微生物？比較項目比較項目分解尿素的細菌分解尿素的細菌纖維素分解菌纖維素分解菌選選擇擇培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理培養(yǎng)基培養(yǎng)基類型類型目的目的鑒鑒定定培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理現(xiàn)象現(xiàn)象方法方法將細菌涂布在只有將細菌涂布在只有尿素做氮源的選擇尿素做氮源的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上將細菌涂布在只有將細菌涂布在只有纖維素粉做碳源的纖維素粉做碳源的選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株篩選菌株選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)思考：本實驗的流程與課題思考：本實驗的流程與課題2 2中的實驗流程有哪些中的實驗流程有哪些異同？異同？本實驗流程與課題本實驗流
15、程與課題2 2的流程的區(qū)別如下。課的流程的區(qū)別如下。課題題2 2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌得到菌落。本課題通過落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。他步驟基本一致。按照課題按照課題1 1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進行等比稀釋的培養(yǎng)基進行等比稀釋10101 110107 7倍。倍。3.3.梯度稀釋梯度稀釋10110
16、21031041051064.4.將樣品涂布到將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)的培養(yǎng)基上基上（1 1）制備鑒別培養(yǎng)基）制備鑒別培養(yǎng)基:（2 2）涂布平板：）涂布平板：將稀釋度為將稀釋度為10104 410106 6的菌懸液各取的菌懸液各取0.1ml0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，涂布到平板培養(yǎng)基上，3030倒置培養(yǎng)。倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質提供的主要營養(yǎng)物質CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生長因子碳源、氮源、生長因子KH2PO4 0.25g無機鹽無機鹽土豆汁土豆汁 100mL碳源、生長因子碳源、生長因子瓊脂瓊脂 15g凝固劑凝
17、固劑上述物質溶解后，加蒸餾上述物質溶解后，加蒸餾水定容至水定容至1000mL氫元素、氧元素氫元素、氧元素鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉水溶性羧甲基纖維素鈉)方法一：先方法一：先 ，再加入剛果紅進，再加入剛果紅進行顏色反應。行顏色反應。方法二：在方法二：在 時就加入剛果紅。時就加入剛果紅。培養(yǎng)微生物培養(yǎng)微生物倒平板倒平板5.剛果紅染色法剛果紅染色法 挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。纖維素的菌落。這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足？這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足？染色法染色法染色法染色法優(yōu)優(yōu)點點點點缺點缺點缺點缺點方
18、法一方法一方法一方法一方法二方法二方法二方法二顏色反應基本顏色反應基本上是纖維素分上是纖維素分解菌的作用解菌的作用操作繁瑣操作繁瑣剛果紅會使菌落之間發(fā)生剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜混雜操作簡便不操作簡便不存在菌落混存在菌落混雜問題雜問題1.1.產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈產(chǎn)生模糊透明圈2.2.有些微生物能降解色素，有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。形成明顯的透明圈。比較比較項目項目分解尿素的細菌分解尿素的細菌纖維素分解菌纖維素分解菌選選擇擇培培養(yǎng)養(yǎng)原理原理培養(yǎng)基類培養(yǎng)基類型型目的目的鑒鑒定定培培養(yǎng)養(yǎng)基基原原理理現(xiàn)現(xiàn)象象方方法法在細菌分解尿素的化學反應在細菌分解尿素
19、的化學反應中，細菌合成的脲酶將尿素中，細菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，的堿性增強，pHpH升高。在培升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果果pHpH升高指示劑會變紅升高指示劑會變紅剛果紅可以與纖維素形成剛果紅可以與纖維素形成紅色復合物，當纖維素被紅色復合物，當纖維素被纖維素酶催化分解后紅色纖維素酶催化分解后紅色復合物無法形成，培養(yǎng)基復合物無法形成，培養(yǎng)基上就會出現(xiàn)以纖維素分解上就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈菌為中心的透明圈觀察菌落周圍是否有著色的觀察菌落周圍是否有著色的環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌觀
20、察菌落周圍是否出現(xiàn)觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來篩選纖維素分解菌透明圈來篩選纖維素分解菌脲酶檢測法脲酶檢測法剛果紅染色法剛果紅染色法方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考：漂洗作用漂洗作用，洗去與纖維素結合不牢的剛果紅，洗去與纖維素結合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實際上剛果紅是結合到培養(yǎng)基的多糖活力的大小，實際上剛果紅是結合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能底物，但分解纖維素的細菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結分解這個多糖底物成為單糖
21、，這樣剛果紅就不能結合上去了，氯化鈉溶液就可以使結合不牢的剛果紅合上去了，氯化鈉溶液就可以使結合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當然分解纖維素的能就強！當然分解纖維素的能就強！在在產(chǎn)生明顯的透明圈產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，挑取的菌落，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在在30300 0C C 37 370 0C C培養(yǎng)，可獲得培養(yǎng)，可獲得純化培養(yǎng)純化培養(yǎng)。6 6、純化培養(yǎng)、純化培養(yǎng)四、結果分析與評價四、結果分析與評價 1.1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選培養(yǎng)基的制作是否合格
22、以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落出菌落 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。了分解纖維素的微生物。2.2.分離的結果是否一致分離的結果是否一致 由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取土的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學也可能得到真菌和放線菌等不樣的環(huán)境不同，不同同學也可能得到真菌和放線菌等
23、不同的分離結果。同的分離結果。為了確定分離得到的是纖維素分解菌，為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行還需要進行_實驗，纖維素酶的實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有發(fā)酵方法有_ _ 發(fā)酵和發(fā)酵和_ _ 發(fā)酵。纖發(fā)酵。纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的維素所產(chǎn)生的_ _ 含量進行定量測定。含量進行定量測定。發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶 液體液體 固體固體 葡萄糖葡萄糖 五、課題延伸五、課題延伸分解分解纖維纖維素的素的微生微生物的物的分離分離纖維素酶纖維素酶種類、作用種類、作用剛果紅染色剛果紅染色篩選原理篩選原理實實驗驗設設計計土壤取樣土壤取樣選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)涂布培養(yǎng)涂布培養(yǎng)純化培養(yǎng)純化培養(yǎng)前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纖維素土壤富含纖維素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鑒別染色鑒別分離出分解菌分離出分解菌課堂總結課堂總結
高中生物選修一分解纖維素的微生物的分離
