高中生物《血紅蛋白的提取和分離》教案4新人教版選修

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1、 課題：血紅蛋白的提取和分離 教學(xué)目標(biāo)： 1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白 2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理 教學(xué)重點(diǎn)： 凝膠色譜法的原理和方法 教學(xué)難點(diǎn)： 樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填教學(xué)過(guò)程： （一）引入新課 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者， 是細(xì)胞內(nèi)含量最高的有機(jī)化合物。 對(duì)蛋白質(zhì)的研究有 助于人們對(duì)生命過(guò)程的認(rèn)識(shí)和理解。 所以需要從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。 怎樣提取蛋白質(zhì)呢？ （二）進(jìn)行新課 1．基礎(chǔ)知識(shí) 蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)

2、、親和力等千差萬(wàn)別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。 1． 1 凝膠色譜法（分配色譜法） ： （ 1）原理：（見(jiàn)課件圖） 分子量大的分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；分子量小的分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。 （ 2）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。 （ 3）分離過(guò)程： 混合物上柱→洗脫→大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢→收集大分子→收集小分子＊洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。 1． 2 緩沖溶液 （ 1）原理：由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成 （如 H2CO3－

3、 NaHCO3，HC－ NaC，NaH2PO4/Na2HPO4 等），調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同 pH 的緩沖液。 （2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對(duì)溶液 pH 的干擾而保持 pH 穩(wěn)定。 1． 3 凝膠電泳法： （ 1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。 ［思考］閱讀投影補(bǔ)充材料后，填寫(xiě)下表： 決定運(yùn)動(dòng) 形成庫(kù) 形成 決定運(yùn)動(dòng) 方向 侖力 阻力 速率 電荷 √ 性質(zhì) 電荷

4、 √ √ 量 分子 √ √ 形狀 分子 √ √ 用心 愛(ài)心 專心 1 大小 （2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經(jīng)膠電泳等。 （3）分離過(guò)程：在一定 pH 下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的 SDS，形成“蛋白質(zhì)－ SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。 2．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 2.1 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為哪些基本步驟？ 樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定。 思考：是否所有種類的蛋白質(zhì)的提取和

5、分離都是這樣的？為什么？ 不是。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的來(lái)源和性質(zhì)不同，分離方法差別很大。 2.2 選擇實(shí)驗(yàn)材料 （ 1）你認(rèn)為鳥(niǎo)類血液和哺乳動(dòng)物血液中，最好哪種血液來(lái)提取血紅蛋白？為什么？哺乳動(dòng)物血液。因?yàn)樵摷?xì)胞中沒(méi)有細(xì)胞核，血紅蛋白含量高。 （ 2）請(qǐng)閱讀投影資料，認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物血液組成及血紅蛋白性質(zhì)。并思考回答下列問(wèn)題： 血液由 和 兩部分組成。 血細(xì)胞中 細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞的含量最高的化合物是 。 該化合物是由 和 構(gòu)成的，其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與 O2 和 CO2結(jié)合的 基團(tuán)。 2.3 從紅細(xì)胞中分離出血紅蛋白的過(guò)程為： 洗滌紅細(xì)胞、 釋放

6、血紅蛋白、 分離血紅蛋白、 透析。洗滌紅細(xì)胞的目的是什么？ 除去血漿蛋白的雜蛋白，有利于后續(xù)步驟的分離純化。 紅細(xì)胞的洗滌過(guò)程為 血液＋檸檬酸鈉→低速短時(shí)離心→吸出上層血漿→紅細(xì)胞＋ 5 倍體積生理鹽水 →緩慢 攪拌 10min→低速短時(shí)離心→吸出上清液→反復(fù)洗滌直至上清液無(wú)黃色 思考：加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時(shí)離心？為什么要緩慢攪拌？ 防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 思考：你有什么方法將紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放出來(lái)？ 加入蒸餾水，用玻璃棒快速攪拌一段時(shí)間。 補(bǔ)充：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與

7、原血液體積要相同。 加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜， 有利于血紅蛋白的釋放和分離。 此時(shí)，紅細(xì)胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白， 而且還含有 細(xì)胞破碎物、脂質(zhì)、 甲苯有機(jī)溶劑等。怎樣除去這些雜質(zhì)呢？由于它們的密度不同，科學(xué)家采取了離心分離的方法： 紅細(xì)胞破碎混合液→中速長(zhǎng)時(shí)離心（ 2000c/min 10min ）→濾紙過(guò)濾除去脂質(zhì)→分液漏 斗分離出血紅蛋白 2.4 如何除無(wú)機(jī)鹽離子和小分子有機(jī)物質(zhì)呢？。 透析。半透膜的選擇透過(guò)性，大分子物質(zhì)不能通過(guò)半透膜，離子和小分子能夠通過(guò)半透 膜。 在透析過(guò)程中， 血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過(guò)半透膜擴(kuò)散

8、進(jìn)入到 pH＝ 7 的磷 酸緩沖液中。 思考：為何使用 pH＝7 的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠(yuǎn)多于血紅蛋白溶液量？ 維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴(kuò)散。 總結(jié)：通過(guò)以上四個(gè)基本過(guò)程，紅細(xì)胞中的血紅蛋白就被提取出來(lái)。但其中還含有其他種類的蛋白質(zhì)分子（如呼吸酶等） 。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開(kāi)來(lái)呢？我們來(lái)研究蛋白 質(zhì)提取和分離的第二個(gè)步驟――粗分離（凝膠色譜操作） 。 2.5 凝膠色譜分離蛋白質(zhì)包括：制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。 用心 愛(ài)心 專心 2 根據(jù)教材圖 5－ 19，說(shuō)出制作色譜柱

9、需要的材料。 橡皮塞 2 個(gè)、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)、玻璃管、尼龍管等。 色譜柱的制作過(guò)程：準(zhǔn)備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱 下面進(jìn)行第二步――凝膠色譜柱的裝填。請(qǐng)閱讀教材： 色譜柱的裝填過(guò)程。 步驟 操作要求 ① 操作要求 色譜柱垂直固定在支架上 ② 計(jì)算稱量凝膠 根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量 ③ 配制懸浮液 凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹 凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴 ④ 裝填懸浮液 一次性緩慢倒入；輕輕敲打 ⑤ 緩沖液洗滌平衡 立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h 樣品加入和

10、洗脫。其基本過(guò)程是： 調(diào)節(jié)緩沖液面→加入蛋白質(zhì)樣品→調(diào)節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)至此，血紅蛋白即可得到粗分離。在整個(gè)操作過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)注意以下事項(xiàng)： （ 1）紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過(guò)少；低速、短時(shí)離心。 （ 2）凝膠的預(yù)處理：沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡 （ 3）色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無(wú)氣泡；洗脫液不能斷流。 （ 4）色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。 （三）課堂總結(jié)、點(diǎn)評(píng) 血 蛋白質(zhì)分子的差異性 紅 蛋 凝膠色譜法 原 理 分離過(guò)程

11、 白 凝膠電泳法 的 提 緩沖溶液 組 成 作 用 取 和 蛋白質(zhì)的 樣品處理 粗 分 離 分 離 提取分離 純度鑒定 純 化 （四）實(shí)例探究 例 1 利用凝膠色譜法，什么樣的蛋白質(zhì)先洗脫出來(lái)（ ） A. 相對(duì)分子質(zhì)量大的 B. 溶解度高的 C.相對(duì)分子量小的 D.所代電荷多的 解析：凝集色譜法使根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分

12、離蛋白質(zhì)的有效方法。相對(duì)分子質(zhì)量較 小的蛋白質(zhì)能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道， 路程較長(zhǎng)， 移動(dòng)速度較慢； 相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)，路程較短，移動(dòng)速度較快，首先洗脫出來(lái)。 答案： A 例 2 蛋白質(zhì)提取和分離分為哪幾步（ ） A. 樣品處理、凝膠色譜操作、 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳 用心 愛(ài)心 專心 3 B. 樣品處理、凝膠色譜操作、純化 C.樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定 D.樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定 解析：蛋白質(zhì)的提取和分離分為樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定四步。 A 中凝膠色 譜操作及 SDS－聚丙

13、烯酰胺凝膠電泳為實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的技術(shù) 答案： C ☆綜合應(yīng)用 例 3 用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)（ ） A 路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢 B 路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快 C路程較短，移動(dòng)速度較慢 D 路程較短，移動(dòng)速度較快 解析：在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道， 當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)， 相 對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道， 路程較長(zhǎng)， 移動(dòng)速度較慢； 而相對(duì) 分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道， 只能在凝膠外部移動(dòng)， 路程較短， 移 動(dòng)速度較快。 答案： D （五）鞏固練習(xí) 1.

14、 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)是（ ） A. 對(duì)其他分子的親和力 B. 溶解度 C. 所帶電荷多少 D. 相對(duì)分子質(zhì)量的大小 2. 凝膠色譜法中所用的凝膠化學(xué)本質(zhì)大多是（ ） A. 糖類化合物B. 脂質(zhì) C. 蛋白質(zhì)D. 核酸 3. 選用紅細(xì)胞作為分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料，有何好處（ ） A. 血紅蛋白是有色蛋白 B. 紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核 C. 紅細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高 D. 紅細(xì)胞 DNA含量高 4. 將攪拌好的混合液離心來(lái)分離血紅蛋白溶液時(shí)，第二層是（ ） A. 甲苯 B

15、. 血紅蛋白水溶液 C. 脂溶性物質(zhì)的沉淀層 D. 其他雜質(zhì)的沉淀 5. 血紅蛋白因含有（ ）而呈紅色 A. O2 B. CO C. CO2 D. 血紅素 6. 下列操作正確的是（ ） A. 分離紅細(xì)胞時(shí)采用低速長(zhǎng)時(shí)間離心 B. 紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可 C. 分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心 D. 透析時(shí)要用 20mmol/l 的磷酸緩沖液，透析 12h 7. 樣品的加入和洗脫的敘述正確的是（ ） A. 先加入 1ml 透析后的樣品 B. 加樣前要

16、使緩沖液緩慢下降全部流出 C. 如果紅色帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功 D. 洗脫時(shí)可以用緩沖液也可以用清水 8. 下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程度敘述錯(cuò)誤的是（ ） A. 樣品的處理就是通過(guò)一系列操作收集到血紅蛋白溶液 B. 通過(guò)透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取 C. 可通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化 D. 可通過(guò) SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度 用心 愛(ài)心 專心 4 9. 凝膠色譜法操作正確的是（ ） A. 將橡皮塞上部用刀切出鍋底

17、狀的凹穴 B. 將橡皮塞下部切出凹穴 C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D. 將尼龍網(wǎng)剪成與橡皮塞下部一樣大小的圓片 10. 樣品的加入和洗脫的操作不正確的是（ ） A. 加樣前， 打開(kāi)色譜柱下端的流出口， 使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面 B. 加樣后，打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi) C. 等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口 D. 用吸管小心的將 1ml 透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面 ★ 教后小記 本課題重在讓學(xué)生了解生物科學(xué)在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的進(jìn)展， 說(shuō)明提取、 分離高純度的蛋白質(zhì) 的重要性和必要性， 并學(xué)習(xí)一些蛋白質(zhì)分離和提取的基本技術(shù)。 可以發(fā)揮學(xué)生的主動(dòng)性， 讓 學(xué)生介紹當(dāng)前有關(guān)蛋白質(zhì)研究的新進(jìn)展， 激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣， 然后指出本課題的學(xué)習(xí)意義， 讓學(xué)生初步體會(huì)分離純化蛋白質(zhì)的過(guò)程和方法。 用心 愛(ài)心 專心 5