生物質(zhì)譜技術(shù)與方法

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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,質(zhì)譜技術(shù)與方法,1,質(zhì)譜分析法,（mass spectrometry，MS）,是將化合物形成離子和碎片離子，按質(zhì)荷比,（,m/z）的不同進(jìn)行分離，來(lái)進(jìn)行成分和結(jié),構(gòu)分析的,方法。,所得結(jié)果用質(zhì)譜圖（亦稱(chēng)質(zhì)譜，,Mass,Spectrum,）表示。,根據(jù)質(zhì)譜圖提供的信息可以進(jìn)行有機(jī)物及無(wú),機(jī)物的定性和定量分析、生物大分子的結(jié)構(gòu),分析、樣品中各種同位素比的測(cè)定及固體表,面的結(jié)構(gòu)和組成分析等。,2,生物質(zhì)譜,（,Bio-mass spectrometry,，,Bio-MS,）,是用于生物分子分析的質(zhì)譜技術(shù)。,生物

2、質(zhì)譜要求測(cè)定上萬(wàn)甚至是幾十萬(wàn)的,相對(duì)分子質(zhì)量。,隨著電噴霧電離（,ESI）和基質(zhì)輔助激光,解吸電離（,MALDI）技術(shù)的完善和成熟，,生物大,分子的質(zhì)譜分析才得以實(shí)現(xiàn)。,3,The Nobel Prize in Chemistry 2002,for the development of methods for identification and,structure analyses of biological macromolecules,for their development of soft,desorption ionisation methods for,mass spectrom

3、etric analyses of,biological macromolecules,for his,development of,nuclear magnetic,resonance,spectroscopy for,determining the,three-dimensional,structure of,biological,macromolecules in,solution,約翰,芬,田中耕一,庫(kù)爾特,伍斯里,奇,4,質(zhì)譜法的基本原理,質(zhì)譜分析的基本過(guò)程是使樣品在離子源中,發(fā)生電離，生成不同質(zhì)荷比的帶電離子，,經(jīng)加速電場(chǎng)的作用形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量,分析器，在其中再利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使

4、其發(fā),生色散、聚焦，獲得質(zhì)譜圖。,5,質(zhì)譜分析中，多種離子化技術(shù)均可使物質(zhì),分子失去外層價(jià)電子形成分子離子,（,molecular ion,，,M,+,），分子離子中的化,學(xué)鍵還可以繼,續(xù)發(fā)生某些有規(guī)律的斷裂而,形成不同質(zhì)量的碎片離子（,fragment ion）：,M,M,+,+,碎片離子,+中性分子,6,被分析樣品離子電離后經(jīng)加速進(jìn)入磁場(chǎng)時(shí)，其動(dòng),能與加速電壓及電荷,z有關(guān)，即：,zeU=1/2mv,2,其中：,z,為電荷數(shù)，,e,為元電荷（,e=1,60,10,-19,C,），,U,為加速電壓，,m,為離子的質(zhì)量，,v為離子初,加速后的運(yùn)動(dòng)速度。,具有速度,v的帶電粒,子進(jìn)入質(zhì)譜儀的質(zhì)量

5、分析器中，,根據(jù)所選擇的分離方式，最終各種離子按質(zhì)荷比,（,m,z）的不同實(shí)現(xiàn)分離。,7,質(zhì)譜儀,質(zhì)譜儀包括進(jìn)樣系統(tǒng)、電離系統(tǒng)、質(zhì)量分析器,和檢測(cè)系統(tǒng)。為了獲得離子的良好分析，必須,避免離子損失，因此凡有樣品分子及離子存在,和通過(guò)的地方，必須處于真空狀態(tài)。,在進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，一般過(guò)程是：通過(guò)合適的,進(jìn)樣裝置將樣品引入并進(jìn)行氣化。氣化后的樣,品引入到離子源進(jìn)行電離。電離后的離子經(jīng)過(guò),適當(dāng)?shù)募铀俸筮M(jìn)入質(zhì)量分析器，按不同的,m,z,進(jìn)行分離。然后到達(dá)檢測(cè)器，產(chǎn)生不同的信號(hào),而進(jìn)行分析。,8,質(zhì)量分析器,檢測(cè)器,樣品導(dǎo),入系統(tǒng),離子源,真空泵,m/z,計(jì)算機(jī)控制與,數(shù)據(jù)處理,相,對(duì),豐,度,質(zhì)譜儀的構(gòu)

6、成,9,Data,System,Mass,spectrum,out,Inlet,System,Mass,Analyzer,Ion,Source,Detector,Sample,in,Inlet systems:,Ion sources:,Mass analyzers:,Simple vacuum lock,HPLC,GC,Electrospray(ESI),MALDI,FAB/LSIMS,Electron ionization(EI),Quadrupole,Time-of-flight,Ion trap,Magnetic sector,FTMS,Mass Spectrometer Schema

7、tic,Vacuum envelope,10,離子源,(ion source),質(zhì)譜儀中將分子轉(zhuǎn)化為離子的裝置稱(chēng)為離子,源,(ion source)。由于離子化所需要的能量,隨分子不同差異很,大，因此，對(duì)于不同的分,子應(yīng)選擇不同的離解方法。,通常將能給樣品較大能量、生成較多碎片離,子的電離方法稱(chēng)為,硬電離方法,（如電子轟擊,離子化，,EI），而給樣品較小能量、,碎片離,子較少或不生成碎片離子的電離方法稱(chēng)為,軟,電離方法,。,11,生物質(zhì)譜中有代表性的離子源,1,電噴霧電離,(,Electrospray Ionization,，,ESI,),2,離子噴霧電離（,Ion spray Ionizat

8、ion,，,ISI,）,3,大氣壓化學(xué)電離,(,Atmospheric Pressure,Chemical Ionization,，,APCI,),4,基質(zhì)輔助激光解吸電離,(,Matrix Assisted,Laser Desorption Ionization,，,MALDI,),5,快原子轟擊電離,(,Fast Atom Bonbardment,Ionization,，,FAB,),12,離子源是質(zhì)譜儀的心臟，可以將離子源,看作是離子化反應(yīng)器，樣品在其中發(fā)生,一系列的特征裂解反應(yīng)，反應(yīng)在很短時(shí),間（,10,-11,s）內(nèi)發(fā)生，所以可以快速地獲,得質(zhì)譜圖。,13,質(zhì)量分析器,質(zhì)量分析器是質(zhì)

9、譜儀的核心，它將離子,源產(chǎn)生的離子按其質(zhì)量和電荷比（質(zhì)荷,比,m/z,，,m,離子的質(zhì)量數(shù)，,z離子攜,帶的電荷數(shù)）的不同在空間的位置,時(shí)間的先后或軌道的穩(wěn)定與否進(jìn)行分離,以便得到按質(zhì)荷比（,m/z）大小順序排列,而成的,質(zhì)譜圖。,14,質(zhì)量分析器,(mass analyzer)的種類(lèi),1.,磁質(zhì)量分析器,(,單聚焦質(zhì)量分析器,雙聚,焦質(zhì)量分析器),2.,四極質(zhì)量分析器,(,四極桿濾質(zhì)器,),3.,飛行時(shí)間質(zhì)量分析器,(TOF),4.,離子阱,(Ion Trap)質(zhì)量分析器,5.離子回旋共振,質(zhì)量分析器,其中,234是目前生物質(zhì)譜,分析中常,用的質(zhì)量分析器,15,檢測(cè)器,1.,直接電檢測(cè)器,2

10、.電子倍增器,3.閃爍檢測(cè)器,4.微通道板,16,計(jì)算機(jī)控制與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),1.,監(jiān)控各單元的工作狀態(tài),實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜儀的,全自動(dòng)操作.,2.,數(shù)據(jù)的采集和簡(jiǎn)化,.,3.,質(zhì)量數(shù)的轉(zhuǎn)換,.,4.,扣除本底或相鄰組分的干擾,.,5.,譜峰強(qiáng)度歸一化,.,6.,標(biāo)出高分辨質(zhì)譜的元素組成,.,17,7.,用總離子流對(duì)質(zhì)譜峰強(qiáng)度進(jìn)行修正,.,8.,譜圖的累加,平均,.,9.,輸出質(zhì)量色譜圖,.,10.,單離子檢測(cè)和多離子檢測(cè),.,11.,譜圖檢索,.,18,質(zhì)譜圖,質(zhì)譜分析中，按各離子,m/z的順序及相對(duì),強(qiáng)度大,小記錄分析結(jié)果的圖譜即為質(zhì)譜,圖。由于圖譜中離子的質(zhì)量及相對(duì)強(qiáng)度,是各物質(zhì)所特有的，即反映了物

11、質(zhì)的性,質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，因此通過(guò)質(zhì)譜解析可以,進(jìn)行物質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)分析。,常見(jiàn)的質(zhì)譜圖是經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)處理后得到,的棒圖（,bar graph）。,19,常見(jiàn)的質(zhì)譜圖是經(jīng)計(jì)算機(jī),處理的棒圖,.,圖中,縱坐,標(biāo)表示離子的,相對(duì)豐度,(以質(zhì)譜中最強(qiáng),峰的高度為100%,并將此,峰稱(chēng)位基峰,其余峰按與,基峰的比例加以表示,又,稱(chēng)為相對(duì)強(qiáng)度);橫坐標(biāo)表,示離子的質(zhì)荷比,.,根據(jù)峰位,(,棒位,)可進(jìn)行定,性鑒別,;根據(jù)相,對(duì)豐度可,進(jìn)行定量測(cè)定,.,15,28,29,31(,基峰,),32,(,分子離子峰,),33,100,80,60,40,20,10,20,30,40,50,m/z,相,對(duì),峰,強(qiáng),棒圖,

12、(bar graph),CH,3,OH,20,21,%Intensity,1239.4,1679.8,2120.2,2560.6,Mass(,m/z,),0,3001.0,0,799.0,10,20,30,100,1480.60,1567.46,90,80,70,60,50,40,804.68,2044.21,1738.35,1570.45,1439.65,1894.26 2047.21,927.77,843.87,2470.78,2210.10,1923.27,1724.38,1000.70,1209.84,1391.67,1574.12,2661.87 2807.67,2066.13,牛血

13、清蛋白（,BSP,）酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖,Voyager Spec#1BP=1480.6,8127,22,10,0,30,%Int.,100,90,80,70,60,50,40,3494,3495,3496,3497,3498,3499,3500,3501,3502,3503,3497.6422,3496.6541,3498.6256,3495.6545,3499.6528,20,3500.6595,3501.6502,Resolution 20,000,m/z,胰島素的高分辨質(zhì)譜圖,23,質(zhì)譜儀的主要性能指標(biāo),衡量質(zhì)譜儀整體性能的主要指標(biāo)有：,質(zhì)量范圍,分辨率,質(zhì)量準(zhǔn)確度,靈敏度,掃描速度等,2

14、4,質(zhì)量,分析器,質(zhì)量上限,(m/z),質(zhì)量準(zhǔn)確,度（u）,分辨率,（R）,掃描速度,（u/s）,適用,范圍,四極桿質(zhì),譜,4000,0.1,500,3000,4000,6000,小分子、,多電荷離,子大分子,離子阱質(zhì),譜,10000,0.1,1000,10000,4000,6000,小分子、,多電荷離,子大分子,飛行時(shí)間,質(zhì)譜,500000,0.001(高,分辨飛行,時(shí)間質(zhì)譜),500,1000,（低），,2000,20000,（高）,1000000,小分子、,大分子,不同類(lèi)型質(zhì)量分析器的性能指標(biāo),25,質(zhì)量范圍,(mass range),是指質(zhì)譜儀能夠測(cè)量的離子質(zhì)量范圍，通常用最小和最大離

15、,子的離子質(zhì)量表示。,質(zhì)譜分析中，是以核素,12,C,質(zhì)量（,12,C=12.000u,）的,1/12為一,個(gè)質(zhì)量單位（u）。,1u=,（,12.00000 gmol,-1,/6.02214,10,23,mol,-1,）,/12,=1.66054,10,-24,g,在生物大分子的質(zhì)譜分析中，還常用道爾頓（,dalton,，,Da,）,作為度量單位。,1Da=1.6603,10,-24,g,。,Da,與,u兩者相差,萬(wàn)分之三左右，在生物質(zhì)譜分析中，可以視為1Da=1u。,26,質(zhì)量準(zhǔn)確度（,mass accuracy）,質(zhì)量準(zhǔn)確度又稱(chēng)質(zhì)量精度，即離子質(zhì)量實(shí)測(cè),值,M,與理論值,M,0,的相對(duì)誤差

16、：,質(zhì)量精度,=,M,M,0,/m,10,6,(ppm),（,m為,離子質(zhì)量數(shù)的整數(shù)）,儀器的質(zhì)量精度一般應(yīng)小于,10 ppm。,27,分辨率,(resolution,，,R),分辨率是指儀器能分離相鄰兩質(zhì)譜峰的能力。若,將強(qiáng)度近似相等、質(zhì)量分別為,M,和,M+,M 的兩個(gè),相鄰峰恰好分開(kāi)，則質(zhì)譜儀的分辨率定義為：,R,m,1,/(m,2,-m,1,),m,1,/,M,其中,m,1,、,m,2,：為質(zhì)量數(shù)，且,m,1,m,2,：，故在兩,峰質(zhì)量相差越小時(shí)，要求儀器分辨率越大。,28,重點(diǎn)介紹兩種生物質(zhì)譜分析方法,基質(zhì)輔助激光解吸電離,/飛行時(shí)間質(zhì)譜,（Matrix Assisted Laser Desorption,Ionization/Time of Flight Mass Spectra,，,MALDI-TOF MS）,電噴霧電離,(Electrospray Ionization，,ESI)質(zhì)譜,29,電噴霧離子化（,ESI）原理,內(nèi)襯彈性石英管的不銹鋼毛細(xì)管（內(nèi)徑,0.1,0.15mm）被,加以2,5kV,的正電壓，與相距約,1,2cm接地的反電極形,成強(qiáng)靜電場(chǎng)。,被分析的樣品溶