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1、單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,*,*,第四講 細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術,（一）動物細胞培養(yǎng),從機體取出立即培養(yǎng)的細胞叫原代細胞（10代）。,將原代細胞分離、稀釋接種到新的培養(yǎng)中繼續(xù)培養(yǎng)的細胞為傳代細胞。,從原代培養(yǎng)細胞中分離出來的可繼續(xù)傳代繁殖到4050的細胞群體叫細胞株，細胞具有接觸抑制的行為，有些具有貼壁生長的行為，具有正常的遺傳物質。,從原代細胞或細胞株中獲得的可無限傳代的細胞叫細胞系。細胞無接觸抑制行為，且具有遺傳突變，帶有癌細胞的特征。,一、細胞培養(yǎng),細胞培養(yǎng)就是將動植物組織或細胞從機體取出，分散成單個細胞 或直接以單
2、細胞 生物，給予必要的生長條件，讓其在培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)基上繼續(xù)生長與增殖。,（二）,動物細胞融合技術即,單克隆抗體技術,1975年英國學者Milestein等開創(chuàng)了將產生抗體的單個細胞同瘤細胞雜交的技術。他們的設計是經綿羊紅細胞免疫過的小鼠脾細胞(B淋巴細胞)與骨髓瘤細胞融合，融合的雜交瘤具有兩種親本細胞的特性即可分泌抗綿羊紅細胞的抗體，又可無限增殖。學者們紛紛利用這 一技術來制備針對不同抗原的高度純一的單克隆抗體。,單克隆抗體,就是單個雜交瘤細胞增殖產生的克隆細胞群分泌的高度純一的抗體。,動物細胞融合技術即單克隆抗體技術,骨髓瘤細胞？,體外培養(yǎng),從培養(yǎng)液中獲取,抗原？,淋巴細胞？,體內培養(yǎng),從
3、腹水中提取,單克隆抗體,細胞融合,、篩選,雜交瘤細胞,細胞培養(yǎng),（三）植物細胞培養(yǎng),1、單倍體細胞培養(yǎng)：花藥離體培養(yǎng)。（秋水仙素）,2、原生質體培養(yǎng)：去壁的植物細胞叫原生質體。可培養(yǎng)成植株或體細胞雜交植株。,植物組織培養(yǎng),植物體細胞雜交,過程,離體的植物器官、組織或細胞,愈傷組織,根、芽,植物體,外植體,脫分化,植物激素：,細胞分裂素、生長素,再分化,植物組織培養(yǎng),植物組織培養(yǎng)條件,：,含有全部營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、一定的溫度、空氣、無菌環(huán)境、適合的PH、適時光照等。,植物A細胞,植物B細胞,去壁,原生質體A,原生質體B,原生質體融合,融合體,再生壁,雜種細胞,細胞分裂,愈傷組織,雜種植株,去壁的
4、常用方法：,酶解法（纖維素酶、果膠酶等）,原生質體融合方法,：,物理法：離心、振動、電刺激等,化學法：聚乙二醇（PEG）,植物體細胞雜交,過程示意圖,三、非細胞體系在細胞生物學研究中的作用,來源于細胞，而不具有完整的細胞結構，但包含了正常生物學反應所需的物質（供能系統(tǒng)和酶反應體系等）組成的體系即為非細胞體系。,四、細胞工程,應用細胞生物學方法，按照預先的設計，有計劃地改變或創(chuàng)造細胞遺傳物質的技術以及發(fā)展這種技術 的領域為細胞工程。,細胞工程所使用的技術主要是細胞培養(yǎng)、細胞分化的定向誘導、細胞融合和顯微注射等。,（一）細胞融合與細胞雜交技術,真核生物的體細胞經過培養(yǎng)，兩個或多個細胞融 合成一個雙
5、核或多核細胞的過程叫細胞融合。,動物細胞融合一般要用滅活的病毒(如仙臺病毒)或 化學物質(如聚乙二醇，即PEG）介導；植物細胞事例時，要用纖維素酶去掉纖維素壁,。,20世紀80年代又發(fā)明了電融合技術。,細胞融合可以在基因型相同的細胞間進行，也可以在基因型不同的種內細胞間甚至種間細胞間進行。,（二）細胞折合與顯微操作技術,細胞拆合就是用物理方法（機械法和短波光）、化學法（用細胞松弛素）把細胞核與質分離開后將不同來源的細胞質與細胞核相互配合，形成核質雜交細胞。,顯微操作技術：即在顯微鏡下用顯微操作裝置對細胞進行解剖和微量注射的技術。,第四講 細胞膜與細胞表面,第一節(jié) 細胞膜與細胞表面特化結構,細胞
6、膜又稱質膜，是圍繞在細胞最外層，由膜脂和膜蛋白構成。,一、細胞膜的結構模型,流動鑲嵌模型,1925年Gorter（歐文頓）等人提出質膜由雙層脂分子構成。,1935年Danielli和Davson提出三夾板模型。,1959年Robertson（羅伯特森）提出單位膜模型。,1972年,Singer（桑格）和 Nicolson（尼克森）提出流動鑲嵌模型。該模型主要強調膜的流動性；膜蛋白的分布不對稱性；這是生物膜的基本特征。,根據已有的實驗結果，,生物膜具有如下共同特征,：鑲嵌性。膜的基本結構由脂雙層分子層鑲嵌蛋白構成，雙層脂分子以疏水性尾部相對，極性頭部朝向水 相。,流動性,。蛋白質和類脂分子具有相
7、對側向流動性，,不對稱性,。膜兩側的分子性質和結構不同。蛋白質極性。多肽鏈的極性區(qū)突向膜表面，非極性部位埋在脂雙層內。,二、細胞膜（質膜）的成分,（一）,膜脂,：主要包括磷脂、糖脂、膽固醇三種,類型。,1、磷脂：甘油磷脂和鞘磷脂（C、H、O、N、P）,磷脂構成了膜脂的基本成分，由極性頭部和兩條疏水尾部組成，為雙極性分子（由極性頭部和兩條疏水尾部組成，為雙極性分子）。,2、糖脂：,為鞘氨醇的衍生物。含17個糖殘基。,3、膽固醇和中性脂質：,膽固醇主要存在于動物細胞，可調節(jié)膜的流動性、增加膜的穩(wěn)定性及降低水溶性物質的通透性。某些細菌含有中性脂類。,4、膜脂的運動方式,膜脂分子的熱運動方式：1、側向
8、運動；2、自旋運動；3、尾部擺動；4、翻轉運動。,（二）膜蛋白,1、類型：,膜周邊蛋白和膜內在蛋白兩類：,。,外在膜蛋白為水溶性蛋白，分布在膜表面，與膜結合較疏松，用溫和的方法就可從膜上分離下來，膜結構并不被破壞。內在蛋白多為跨膜蛋白，也有些插入脂雙層中，與脂雙層分子結合緊密。只有用去垢劑使膜崩解后才可分離出。,2、膜內在蛋白與膜脂結合的方式：主要方式有3種,內在膜蛋白跨膜結構域是與膜脂結合的主要部位。具體作用方式為：,跨膜結構域含有20個左右的疏水氨基酸殘基形成螺旋，其外部疏水側鏈通過范德華力與脂雙層分相互作用。,某些螺旋的外側是非極性鏈，內側極性鏈，形成特異極性分子的跨膜通道。,某些跨膜蛋
9、白的跨膜結構域常常僅有1012個氨基酸殘基形成 折疊結構。,3、,膜蛋白的分離：去垢劑,是分離與研究膜蛋白的常用試劑，可使細胞膜分解。,去垢劑有離子型去垢劑(如SDS)和非離子去垢劑(Triton x100),。,三、膜的的結構特點：,（一）,流動性,1、膜脂的流動：膜脂的流動性主要指脂分子的側向運動。,膜蛋白的運動:,（二）膜的不對稱性,2、膜脂的不對稱性,是指膜脂分子在膜的脂雙層中呈不均勻分布，尤其糖脂的分布表現出完全不對稱性（在質膜的外表面）。,3、膜蛋白的不對稱性,膜蛋白的不對稱性主要指每種膜蛋白分子(受體、載體蛋白）在細胞膜上都具有明確的方向性。,各種生物膜的特征及其生物學功能主要由
10、膜蛋白來決定的,。,四、細胞膜的功能,細胞質膜的主要功能：,為細胞的生命活動提供相對穩(wěn)定的內環(huán)境；,選擇性的物質運輸并伴隨著能量的傳遞；,細胞識別與信息傳遞；,為多種酶提供結合位點；,介導細胞與細胞、細胞與基質這間的連接；,參與形成細胞表面特化結構。,骨架與細胞表面的特化結構,細胞表面的,特化結構包括膜骨架、鞭毛、纖毛、變形足和微絨毛等，,它們都是細胞質膜與膜內細胞骨架纖維形成的復合結構，分別于維持細胞的形態(tài)、細胞的運動、細胞與環(huán)境的物質交換等功能有關。,（一）膜骨架,膜骨架是指細胞質膜下與膜蛋白相連的由,纖維蛋白組成的網架結構,，它參與維持細胞質膜的形狀并協(xié)助完成多種功能。,紅細胞的膜骨架成
11、分主要包括：血影蛋白、肌動蛋白、,錨蛋白,等。,（二）,細胞外被(cell coat)又叫糖萼。一般指動物細胞外表由糖蛋白或糖脂構成的絨絮狀物質。起保護細胞和識別細胞的作用。,（三）胞外基質,是指分布于細胞外空間，由細胞分泌的蛋白和多糖所構成的網狀結構，它將細胞粘連在一起構成組織，在細胞中或組織之間起支持作用。,細胞外基質的基本成分是由,膠原蛋白和彈性蛋白,組成的,纖維蛋白、層粘連蛋白和纖粘連蛋白,組成的,粘連蛋白,和由,糖胺聚糖,形成的水合膠體構成的復雜的結構體系。層粘連蛋白和纖粘連蛋白具有多個結合位點，在細胞與胞外基質成分相互粘著中起重要作用。,（四）基底膜：,膠原蛋白,1、膠原蛋白的類型
12、及分子結構,膠原,蛋白,是胞外基質最基本成分之一，是動物體內含量最豐富的蛋白，目前已發(fā)現20種。型膠原是形成纖維的膠原，型纖維為片狀(或網狀)結構，基膜所特有。,膠原纖維的基本分子結構是原膠原。原膠原由3條多肽連盤繞成3股螺旋結構，長300nm直徑1.5nm，具有Glyxy（甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸）重復序列。,2、膠原,蛋白,的功能,膠原在細胞外基質中含量最高，,剛性和抗張力強度最大,，構成細胞外基質的骨架結構，對細胞具有粘連作用。,膠原基質能影響培養(yǎng)細胞的生長和分化。,糖胺聚糖和蛋白聚糖,1、糖胺聚糖,糖胺聚糖由重復的氨基已糖+糖醛酸二糖單位構成的長鏈多糖?？煞譃?類。如透明質酸、肝素等。
13、,透明質酸是一種重要的糖氨聚糖是細胞增殖和遷移細胞胞外基質的主要成分，尤其在胚胎組織中。在胞外基質中，透明質酸使結締具有,抗壓能力,。,2、蛋白聚糖,蛋白聚糖是由糖胺聚糖與核心蛋白的絲氨酸殘基共價連接形成的分子，這樣的單體可借連接蛋白以非共價鍵與透明質酸結合形成多聚體。,層粘連蛋白和纖粘連蛋白,這兩種蛋白均為高分子量糖蛋白。,1、層粘連蛋白,層粘連蛋白是動物組織基膜的主要結構組分，對基膜,基質的組裝起關鍵作用，可介導細胞粘著于膠原進而鋪展，,并促進細胞生長。,通常細胞不直接與型膠原或蛋白聚糖結合，而是通過,層粘連蛋白將細胞錨定于基膜上。,2、纖粘連蛋,纖粘連蛋白的主要功能是介導細胞粘著。,彈性
14、蛋白,彈性蛋白是彈性纖維的主要成分。,彈性纖維與膠原纖維共同存在，分別賦予組織以彈性及抗張性。,（五）、植物細胞壁,植物細胞壁可看作是高等植物細胞的胞外基質，主要成分是纖維素、半纖維素、果膠質、伸展蛋白和蛋白聚糖等。細胞壁不僅起支持保護作用，而且其中的某些寡糖具有信號分子的作用。,胞外基質不僅提供細胞外的網架賦予組織以抗壓和抗張力的機械性能，而且還與細胞的增殖分化和凋亡等重要生命活動有關。,第二節(jié) 細胞連接,細胞連接是多細胞有機體中相鄰細胞之間通過質膜相互聯系、協(xié)同作用的重要結構。主要有3種類型：,封閉連接、錨定連接、,通訊連接,一、封閉連接,封閉連接的主要形式是緊密連接,。,緊密連接存在于上
15、皮細胞之間,，通過嵴線,使相鄰細胞質膜緊靠在一起，可阻止可溶性物質沿細胞間隙滲入體內。,同時還起到膜蛋白的隔離作用。,二、錨定連接,錨定連接使相鄰細胞的骨架系統(tǒng)或將細胞與基質相連形成 一個堅挺有序的群體。,（一）橋粒與半橋粒,橋粒在細胞之間形成紐扣式的結構將相鄰細胞鉚接在一起，同時也是細胞內中等纖維的錨定位點,。橋粒相鄰細胞質膜的間隙約30nm。在質膜的胞質面有一致密斑，中間纖維直接與其相連。相鄰兩細胞的致密斑由跨膜連接糖蛋白連接。,（二）粘合帶與粘合斑,粘合帶位于上皮組織的下方，相鄰細胞間形成一個連續(xù)的帶狀結構,。粘合帶處相鄰細胞質膜的間隙約1520nm。與粘合帶相連的是,微絲（,又稱肌動蛋
16、白纖維），在細胞中形成平行質膜的可收縮的纖維束。,粘合斑是肌動蛋白纖維與細胞外基質的連接方式。在粘合斑處，跨膜連接糖蛋白向外通過纖粘連蛋白與胞外,基質結合，其胞內結構域則通過微絲結合蛋白與肌動蛋白纖維結合。,粘合帶及粘合斑均起細胞附著與支持作用,。,三、通訊連接,（一）間隙連接,間隙連接相鄰處質膜間的間隙為23nm。連接的基本單位是連接子。連接子由6個相同或類似的跨膜蛋白亞單位環(huán)繞。形成直徑越1.5nm的孔道。相鄰細胞質膜上的兩個連接子相對形成間隙連接單位。,間隙連接在細胞間代謝耦聯和細胞通訊中具有重要作用。,（二）胞間連絲,高等植物細胞之間通過胞間連絲相互連接，完成細胞通訊聯絡。,（三）化學突觸,化學突觸是存在于可興奮細胞之間的細胞連接方式，它通過釋放神經遞質來傳導神經沖動。,四、細胞表面的粘著因子（了解）,細胞與細胞之間的粘連是由特定的細胞粘著因子鈣粘素等介導的，細胞之間的錨定連接也需要粘著因子鈣粘素與整聯蛋白等參與。,粘著因子均為整合膜蛋白，在胞內與細胞骨架成分相連。多數要依賴Ca,2+,或Mg,2+,才起作用，少數不需要Ca,2,。,1、鈣粘素,同親性依賴Ca,2+,的細胞粘連
細胞生物學第二節(jié)課
