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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,*,第三章 生物材料的預(yù)處理、細(xì)胞破碎和液,-,固分離,第三章 生物材料的預(yù)處理、細(xì)胞破碎和液-固分離,第一節(jié) 生物材料的預(yù)處理,第二節(jié) 細(xì)胞破碎,第三節(jié) 液,-,固分離,第一節(jié) 生物材料的預(yù)處理,第一節(jié) 生物材料的預(yù)處理,一、確定預(yù)處理方法的依據(jù),二、動(dòng)物材料的預(yù)處理,三、細(xì)胞培養(yǎng)液的預(yù)處理,第一節(jié) 生物材料的預(yù)處理 一、確定預(yù)處理方法的依據(jù),1.,生物活性物質(zhì)存在方式與特點(diǎn),胞外：,多數(shù)微生物酶如淀粉酶、蛋白酶、糖化酶常大量存在于胞外培養(yǎng)液中。而合成酶類、代謝酶類、遺傳物質(zhì)和代謝中間物則存在于細(xì)胞內(nèi)，如
2、,DNA,聚合酶、細(xì)胞色素,C,等。,微生物酶,是指起著催化作生物體系中特定反應(yīng)的、由微生物活細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。作為催化劑的微生物酶，它可以加速三種反應(yīng)：水解反應(yīng)、氧化反應(yīng)和合成反應(yīng)。,一、確定預(yù)處理方法的依據(jù),1.生物活性物質(zhì)存在方式與特點(diǎn)一、確定預(yù)處理方法的依據(jù),1.,生物活性物質(zhì)存在特點(diǎn),組成復(fù)雜，含量低,（見后頁,),分離純化難,:,目的物與雜質(zhì)的理化性質(zhì)如溶解度、分子量、等電點(diǎn)等都十分接近，所以分離、純化比較困難。,容易失活,1.生物活性物質(zhì)存在特點(diǎn),（,1,）,胰島素是治療糖尿病的特效藥，胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從 豬、牛等動(dòng)物的胰腺中提取，,胰島素在胰臟中的含
3、量為,0.02,，,100Kg,胰腺,只能提取,4-5g,（,50-60,），其產(chǎn)量之低和價(jià)格之高可想而知。,將合成的胰島素基因?qū)?大腸桿菌,，每,2000L,培養(yǎng)液就能產(chǎn)生,100g,胰島素！,大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)不但解決了這種比黃金還貴的藥品產(chǎn)量問題，,1982,年美國一家公司用基因工程手段生產(chǎn)胰島素，生產(chǎn)成本降低,30-50%,。,（1）胰島素是治療糖尿病的特效藥，胰島素是治療糖尿病的特,（,2,）,人類的生長激素是由,191,個(gè),氨基酸,相連、,分子,量約,22000,的一種,蛋白質(zhì),。這種激素在幼年時(shí)分泌不足造成,侏儒,癥，分泌過多造成,巨人癥,，成年時(shí)分泌過多導(dǎo)致,肢端肥大癥,等。過
4、去從死人腦,垂體,提取作藥用，治療一個(gè)侏儒病人約需,600,具尸體的腦垂體，量少價(jià)昂。,1979,年美國一家,基因,公司成功地把人的基因移入,大腸桿菌,生產(chǎn)出生長激素，每升工程菌液含生長激素,2.4mg,，治療一例病人只需,100,多升菌液。目前已開始人工生產(chǎn)并進(jìn)入臨床應(yīng)用試驗(yàn)。,（2）人類的生長激素是由191個(gè)氨基酸相連、分子量約220,2.,后續(xù)操作的要求,一般要求：濾液澄清、,pH,適中、有一定的濃度,不同后續(xù)操作有不同的要求,離子交換,-,高價(jià)無機(jī)離子、澄清度等嚴(yán)格控制,溶劑萃取,-,蛋白質(zhì)含量較低，防乳化,2.后續(xù)操作的要求,3.,目的物穩(wěn)定性,不穩(wěn)定的：要防失活,青霉素,-pH4.
5、8-5.2,，低溫,蛋白類,-,高級結(jié)構(gòu),穩(wěn)定的：可采用較劇烈的變性和處理?xiàng)l件，沉淀雜質(zhì)蛋白,.,如：,鏈霉素，,1943,年美國,S.A.,瓦克斯曼從鏈霉菌中析離得到，是繼青霉素后第二個(gè)生產(chǎn)并用于臨床的抗生素。它的抗結(jié)核桿菌的特效作用，開創(chuàng)了結(jié)核病治療的新紀(jì)元。,鏈霉素穩(wěn)定性較好，可在,pH 2.83.2,，,75,加熱處理，提高過濾速度。,鏈霉素為白色無定形粉末，有吸濕性。易溶于水，不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下不穩(wěn)定。,3.目的物穩(wěn)定性,二、動(dòng)物材料的預(yù)處理,絞肉機(jī)絞碎,:,提取蛋白質(zhì)和酶,勻漿和組織搗碎,:,一些胞內(nèi)產(chǎn)物不能有效地提取，須通過特殊的勻漿才行。在實(shí)驗(yàn)室常用的是玻璃
6、勻漿器和組織搗碎器，工業(yè)上可用高壓勻漿泵。,二、動(dòng)物材料的預(yù)處理絞肉機(jī)絞碎:提取蛋白質(zhì)和酶,三、細(xì)胞培養(yǎng)液的預(yù)處理,為什么需要預(yù)處理？,可溶性粘膠狀物質(zhì)：雜蛋白、不溶性多糖等,粘度增加、影響提取操作,無機(jī)鹽,在采用離子交換提取時(shí)，會(huì)影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量。,三、細(xì)胞培養(yǎng)液的預(yù)處理為什么需要預(yù)處理？,（,1,）加入凝聚劑,凝聚作用,：,指在某些,電解質(zhì),作用下，使膠體粒子的擴(kuò)散雙電層的排斥電位降低，破壞了膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，而使膠體粒子聚集的過程。,某些無機(jī)鹽可使細(xì)胞、細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)等膠體顆粒發(fā)生凝聚作用而被去除。,1.,細(xì)胞及蛋白質(zhì)的處理,（1）加入凝聚劑1.細(xì)胞及蛋白質(zhì)的處理,膠體粒
7、子穩(wěn)定的原因：,帶同種電荷靜電排斥作用,表面水化作用，形成水化層,無機(jī)鹽促凝聚作用：,加入相反電性電解質(zhì)，中和膠體表面電荷，降低了雙電層的排斥力,無機(jī)鹽在水中的水化作用，破壞了膠粒水化層,膠體粒子穩(wěn)定的原因：,影響凝聚作用的主要因素有無機(jī)鹽的種類、化合價(jià)以及無機(jī)鹽的用量等。,通常培養(yǎng)液中細(xì)胞或菌體帶負(fù)電荷，常采用高價(jià)陽離子促其凝固。,陽離子對帶負(fù)電荷的膠粒凝聚能力的次序?yàn)椋?Al,3+,Fe,3+,H,+,Ca,2+,Mg,2+,K,+,Na,+,Li,+,常用的凝聚劑有：,Al,2,(SO,4,),3,18H,2,O,、,AlCl,3,6H,2,O,、,FeCl,3,、,ZnSO,4,、,M
8、gCO,3,等。,影響凝聚作用的主要因素有無機(jī)鹽的種類、化合價(jià)以及無機(jī)鹽的用量,（,2,）加入絮凝劑,絮凝劑：有機(jī)高分子，易溶，鏈長，活性功能基團(tuán)多,絮凝作用：,當(dāng)往膠體懸浮液中加入絮凝劑時(shí)，膠?？蓮?qiáng)烈吸附在絮凝劑表面的功能團(tuán)上，而且一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的顆粒的表面上，形成架橋聯(lián)接，形成粗大的絮凝團(tuán)沉淀出來，有助于過濾。,（2）加入絮凝劑,影響因素：,分子量：大，效果好；過大，溶解度,用量：低濃度增加用量有助架橋，濃度過高吸附飽和失去架橋作用，降低了效果。,pH,：影響功能團(tuán)電離度，電離度，鏈伸展，效果,操作條件：,攪拌：初期，快好；后期，會(huì)破壞絮凝團(tuán),影響因素：,（,3,
9、）變性作用,天然蛋白質(zhì)分子受到某些物理因素（如熱、紫外線照射、高壓和表面張力等）、,化學(xué)因素（,如有機(jī)溶劑、脲、胍、酸、堿等）影響時(shí)，,生物活性喪失，溶解度降低，不對稱性增高以及其他的物理化學(xué)常數(shù)發(fā)生改變,。,用途：,雜蛋白質(zhì)變性沉淀析出,方法：,加熱,、大幅度改變,pH,，加有機(jī)溶劑、重金屬鹽或表面活性劑,（3）變性作用,（,4,）吸附,方法：,加入吸附劑：活性碳除熱原,加入反應(yīng)劑,：相互作用形成沉淀吸附蛋白質(zhì),四環(huán)素發(fā)酵液：黃血鹽,+,硫酸鋅，生成亞鐵氰化鋅鉀,K,2,Zn,3,Fe(CN),6,2,的膠狀沉淀，能將雜蛋白質(zhì)和菌體等黏附在其中而除去。,枯草桿菌的堿性蛋白酶發(fā)酵液：,氯化鈣,
10、+,磷酸鹽生成磷酸鈣鹽沉淀（吸附、助濾），,不僅能吸附雜蛋白和菌體等膠狀懸浮物，還能起助濾劑作用,（4）吸附,（,5,）等電沉淀,蛋白質(zhì)是一種兩性物質(zhì)，在酸性溶液中帶正電荷，堿性溶液中帶負(fù)電荷,而在某,pH,下，凈電荷為零，稱為等電點(diǎn)，此時(shí)它在水中溶解度最小，能沉淀除去。,硫酸軟骨素是自哺乳動(dòng)物氣管等,軟骨,提取而得的酸性黏多糖。,制備過中先將豬喉,(,鼻,),軟骨提取出來鹽解后調(diào),pH 2,3,，攪拌,10min,，靜置后再濾至澄清，以 除去酸性雜蛋白。,有些蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有一定的溶解度，單靠等電點(diǎn)的方法還不能 將其大部分沉淀除去。通常可結(jié)合其他方法，如加熱、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等以增強(qiáng)沉
11、淀 效果。,常與其他方法合用,（,6,）加各種沉淀劑沉淀,沉淀劑與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物沉淀,（5）等電沉淀,（,6,）加各種沉淀劑沉淀,沉淀劑與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物沉淀,在酸性溶液中，蛋白質(zhì)能與一些陰離 予如互氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、，苦味酸鹽、鞣酸鹽、。過氯酸鹽等形成沉淀。在堿 性溶液中，能與一些陽離子如,Ag+,、,Cu2+,、,zn2+,、,Fe3+,和,Pb2+,等形成沉淀只如在四環(huán)素 發(fā)酵液中加入的硫酸鋅，可促進(jìn)一些蛋白質(zhì)沉淀。,（6）加各種沉淀劑沉淀,2.,多糖的去除,酶：,轉(zhuǎn)化為單糖,如發(fā)酵液中殘留的淀粉：淀粉酶,粘多糖與一些陽離子表面活性劑,如十六烷基溴化銨（,CTAB,）,形成沉
12、淀,2.多糖的去除,Mg,2+,三聚磷酸鈉,(Na,5,P,3,P,10,),形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物,Ca,2+,草酸、,草酸鈉,形成草酸鈣沉淀,（注意回收草酸）,Fe,2+,黃血鹽,(K,4,Fe(CN),6,),普魯士藍(lán),沉淀,3.,高價(jià)金屬離子的去除,Mg2+三聚磷酸鈉(Na5P3P10)形成三聚磷酸鈉鎂,微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層均為細(xì)胞壁，細(xì)胞壁里面是細(xì)胞膜，細(xì)胞膜和它所包圍的細(xì)胞漿合稱原生質(zhì)體。,動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜。,通常細(xì)胞壁較堅(jiān)韌，細(xì)胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細(xì)胞破碎的阻力主要來自于細(xì)胞壁。,第二節(jié) 細(xì)胞破碎,微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層均為細(xì)胞壁，細(xì)胞壁
13、里面是細(xì)胞膜，細(xì)胞,一、機(jī)械法,1,、勻漿法,2,、珠磨法,3,、超聲波,三、化學(xué)法,1.,化學(xué)試劑處理,2.,制成丙酮粉,二、物理法,1.,干燥,2.,凍融,3.,滲透壓,沖擊,四、生物法,1.,酶解法,2.,自溶,一、機(jī)械法三、化學(xué)法二、物理法四、生物法,一、機(jī)械法,原理：剪切力,1.,高壓勻漿器,原理：進(jìn)入高壓室的細(xì)胞懸浮液被強(qiáng)迫通過一個(gè)狹窄的小孔，產(chǎn)生液相剪切力引起細(xì)胞破碎。,一、機(jī)械法,易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，,較小的革蘭氏陽性菌，,含有包含體的基因工程菌（因包含體堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥）,適用于：微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模破碎。,不宜采用高壓勻漿法的微生物：,易造成堵塞的團(tuán)狀或絲
14、狀真菌，適用于：微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大,2.,高速珠磨機(jī),原理：玻璃小珠與細(xì)胞懸液一起快速攪拌，研磨作用，細(xì)胞破碎。,操作過程中會(huì)產(chǎn)生熱量，易造成某些 生化物質(zhì)破壞，故磨室還,裝有冷卻夾套，以冷卻細(xì)胞懸浮液和玻璃小珠。,2.高速珠磨機(jī)操作過程中會(huì)產(chǎn)生熱量，易造成某些 生化物質(zhì)破壞,3.,超聲波振蕩器,原理：利用超聲波的空穴作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。,3.超聲波振蕩器,影響因素：超聲波的聲強(qiáng)、頻率、破碎時(shí)間、介質(zhì)的離子強(qiáng)度、,pH,、菌體的濃度和種類。,一般桿菌比球菌易破碎，,G-,細(xì)菌比,G+,細(xì)菌易破碎，對酵母菌的效果較差。超聲破碎時(shí)細(xì)胞濃度一般在,
15、20,左右。,超聲波破碎法在實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用較廣。操作時(shí)常應(yīng)把懸浮液預(yù)先冷卻到,0,5,，并且還應(yīng)在夾套中連續(xù)通入冷卻劑進(jìn)行冷卻。,影響因素：超聲波的聲強(qiáng)、頻率、破碎時(shí)間、介質(zhì)的離子強(qiáng)度、pH,二、物理法,1.,干燥法,原理：,干燥后的菌體，期細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生變化，同時(shí)部分菌體會(huì)產(chǎn)生自溶，然后用丙 酮、丁醇或緩沖液溶劑處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就會(huì)被抽提出來。,氣流干燥,主要適用于酵母菌,，,一般在,25,30,的氣流中吹干；,真空干燥,多用于細(xì)菌,；冷凍干燥,適用于較不穩(wěn)定的物質(zhì),。,二、物理法,2.,反復(fù)凍融法,將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約,-15,），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用
16、。,原理：,細(xì)胞膜疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，增加細(xì)胞親水性,冰晶粒使細(xì)胞破裂,適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。,2.反復(fù)凍融法,3.,滲透壓沖擊法,原理：,細(xì)胞在濃鹽中平衡，再投入水中膨脹破裂。,3.滲透壓沖擊法,三、化學(xué)法,1.,加入化學(xué)試劑,采用化學(xué)法處理可以溶解細(xì)胞或抽提胞內(nèi)組分。,堿：溶解除細(xì)胞壁外大部分組分，改變,pH,，改變蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì),有機(jī)溶劑：如丁醇、丙醇、三氯甲烷等，他們能溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)化合物，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，而將胞內(nèi)產(chǎn)物抽提出來。但是，這些溶劑容易生物活性物質(zhì) 破環(huán)，使用時(shí)應(yīng)考慮其穩(wěn)定性，操作要在低溫下進(jìn)行，處理后還必須將抽提液中的有機(jī)溶 劑進(jìn)行分離回收。,三、化學(xué)法1.加入化學(xué)試劑,三、化學(xué)法,1.,加入化學(xué)試劑,表面活性劑：改變膜的通透性，細(xì)胞溶解,胞內(nèi)異淀粉酶：,0.1%SDS,，,30,振蕩,30h,三、化學(xué)法1.加入化學(xué)試劑,2.,丙酮粉,保存,+,破碎,脫水脫脂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散,方法：,組織或勻漿懸浮,0.01mol/LpH6.5,的磷酸緩沖溶液中，,0,一邊攪拌，一邊徐徐倒入,10,倍體積的,-1
生物材料預(yù)處理、細(xì)胞破碎和液固分離全解課件
