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1、第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)目錄目錄 返回總目錄返回總目錄概述概述1熒光免疫顯微技術(shù)熒光免疫顯微技術(shù)2共聚焦顯微技術(shù)共聚焦顯微技術(shù)3熒光免疫測(cè)定技術(shù)熒光免疫測(cè)定技術(shù)4免疫芯片技術(shù)免疫芯片技術(shù)5第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、熒光的基本知識(shí)一、熒光的基本知識(shí) 某些物質(zhì)受到一定波長光的激發(fā)后會(huì)發(fā)射某些物質(zhì)受到一定波長光的激發(fā)后會(huì)發(fā)射熒光（熒光（fluorescence）。不同的熒光物質(zhì)具有。不同的熒光物質(zhì)具有不同的發(fā)射光譜、激發(fā)光譜和熒光壽命。不同的發(fā)射光譜、激發(fā)光譜和熒光壽命。
2、第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)（一）（一）熒光技術(shù)中有關(guān)的概念和參數(shù)熒光技術(shù)中有關(guān)的概念和參數(shù)熒光：熒光：某些物質(zhì)受到一定波長光的激發(fā)后躍某些物質(zhì)受到一定波長光的激發(fā)后躍遷到遷到激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)，當(dāng)其在極短時(shí)間內(nèi)回復(fù)至，當(dāng)其在極短時(shí)間內(nèi)回復(fù)至基態(tài)基態(tài)發(fā)射出的波長大于激發(fā)光波長的光。發(fā)射出的波長大于激發(fā)光波長的光。 發(fā)射光譜：發(fā)射光譜：指固定激發(fā)波長，在不同波長指固定激發(fā)波長，在不同波長下記錄到的樣品所發(fā)射的下記錄到的樣品所發(fā)射的熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度。第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)激發(fā)光譜：激發(fā)光譜：指固定檢測(cè)發(fā)射波長，用不同波長的激指固定檢測(cè)發(fā)射波長，用不同波長的激發(fā)光激發(fā)樣品所記錄到
3、的相應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度。發(fā)光激發(fā)樣品所記錄到的相應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度。 Stokes位移：位移：熒光物質(zhì)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)過程中，熒光物質(zhì)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)過程中，部分能量丟失，發(fā)射光波長比激發(fā)光波長長。部分能量丟失，發(fā)射光波長比激發(fā)光波長長。 熒光效率：熒光效率：熒光物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百熒光物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率。分率。吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）熒光效率熒光效率 = =發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強(qiáng)度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強(qiáng)度）第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)熒光壽命：熒光壽命：指熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減指熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒
4、光衰減到一定程度時(shí)所用的時(shí)間。到一定程度時(shí)所用的時(shí)間。 熒光的淬滅：熒光的淬滅：熒光物質(zhì)在某些理化因素或受到激發(fā)熒光物質(zhì)在某些理化因素或受到激發(fā)光較長時(shí)間的照射作用，會(huì)發(fā)生發(fā)射熒光減弱甚至光較長時(shí)間的照射作用，會(huì)發(fā)生發(fā)射熒光減弱甚至消退的現(xiàn)象。消退的現(xiàn)象。 熒光偏振：熒光偏振： 當(dāng)當(dāng)P=0時(shí)，表明時(shí)，表明完全不偏振完全不偏振；P在在-1至至+1之間為之間為部分偏振部分偏振。FH +FLP=FH FL第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)（二）（二）影響熒光的因素影響熒光的因素pH溫度溫度熒光素的濃度熒光素的濃度試劑中雜質(zhì)試劑中雜質(zhì)細(xì)胞固定劑細(xì)胞固定劑第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) （三
5、）（三） 熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)1. 1. 熒光色素：熒光色素：FITC、RB200、TRITC、PE、ECD、PeCy5、PeCy7、APC、PI。2. 2. 鑭系螯合物鑭系螯合物 ：Eu3+ 等。等。第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)最大吸收最大吸收光譜（光譜（nm）最大發(fā)射最大發(fā)射光譜（光譜（nm）熒光熒光顏色顏色應(yīng)用應(yīng)用 FITC490495520530 黃綠色黃綠色FAT、熒光偏振免疫測(cè)定流式細(xì)胞、熒光偏振免疫測(cè)定流式細(xì)胞術(shù)術(shù)RB200570 595600 桔紅色桔紅色FITC的襯比染色或雙標(biāo)記的襯比染色或雙標(biāo)記FATTRITC550 620 橙紅色橙紅色FITC的襯比
6、染色或雙標(biāo)記的襯比染色或雙標(biāo)記FAT，也可單獨(dú)采用也可單獨(dú)采用PE488、532575 紅色紅色可與可與FITC共用共用488nm激發(fā)光雙標(biāo)激發(fā)光雙標(biāo)記記FAT、流式細(xì)胞術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)ECD488620桔紅色桔紅色流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)PeCy5488、532670紅色紅色流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)PeCy7488、532755深紅色深紅色流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)PI488620橙紅色橙紅色DNA染色染色APC633670紅色紅色雙激光管的儀器分析雙激光管的儀器分析Eu3+螯合物螯合物340 613 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定表表8-1 8-1 常用熒光物質(zhì)的熒光特點(diǎn)常用熒光物質(zhì)的熒光特點(diǎn)第
7、八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)FITCTRITC第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)二、熒光抗體的制備二、熒光抗體的制備（一）熒光素標(biāo)記物的制備（一）熒光素標(biāo)記物的制備1. 抗體的要求：抗體的要求：抗體應(yīng)具有高特異性、高純度和抗體應(yīng)具有高特異性、高純度和高親和力，經(jīng)純化后標(biāo)記。高親和力，經(jīng)純化后標(biāo)記。2. 2. 熒光素要求：熒光素要求：結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的易于去除，結(jié)合后仍保持較高的熒光效率和易于去除，結(jié)合后仍保持較高的熒光效率和不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)，熒光不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)，熒光色澤與背景色澤對(duì)比鮮明，結(jié)合物穩(wěn)定，安色澤與背景色
8、澤對(duì)比鮮明，結(jié)合物穩(wěn)定，安全無毒，易于保存。全無毒，易于保存。第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)標(biāo)記方法標(biāo)記方法方法學(xué)評(píng)價(jià)方法學(xué)評(píng)價(jià)攪攪拌拌法法待標(biāo)記的蛋白質(zhì)在磁待標(biāo)記的蛋白質(zhì)在磁力攪拌下加入力攪拌下加入FITC溶液溶液標(biāo)記體積大、蛋白含量高的抗體標(biāo)記體積大、蛋白含量高的抗體，標(biāo)記時(shí)間短，熒光素用量少，標(biāo)記時(shí)間短，熒光素用量少，但影響因素多，易引起非特異性但影響因素多，易引起非特異性染色。染色。透透析析法法待標(biāo)記的蛋白質(zhì)裝入待標(biāo)記的蛋白質(zhì)裝入透析袋后置于透析袋后置于FITC的緩沖液中過夜的緩沖液中過夜標(biāo)記樣品量少、蛋白含量低的抗標(biāo)記樣品量少、蛋白含量低的抗體溶液，標(biāo)記均勻，非特異性熒體溶液
9、，標(biāo)記均勻，非特異性熒光染色弱，但熒光素用量較大。光染色弱，但熒光素用量較大。3. 3. 熒光素標(biāo)記抗體的方法：見表熒光素標(biāo)記抗體的方法：見表8-28-2。第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)(1)(1)去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物：透析或凝膠過濾去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物：透析或凝膠過濾; ;(2)(2)去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過度的抗體：陰離子交去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過度的抗體：陰離子交換層析法換層析法; ;(3)(3)去除交叉反應(yīng)或非期望抗體：動(dòng)物肝粉吸收或固去除交叉反應(yīng)或非期望抗體：動(dòng)物肝粉吸收或固相抗原吸收。相抗原吸收。4. 4. 熒光素標(biāo)記抗體的純化熒光素標(biāo)記抗體的純化第八章第八章
10、熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 熒光素與蛋白結(jié)合率、抗體效價(jià)、抗體特?zé)晒馑嘏c蛋白結(jié)合率、抗體效價(jià)、抗體特異性、抗體抗體特異性染色滴度。異性、抗體抗體特異性染色滴度。 加入加入0.1%NaN3或或0.01%硫柳汞防腐，避免硫柳汞防腐，避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融，-20凍存可保存凍存可保存12年，真空干燥年，真空干燥后可長期保存。稀釋后的抗體不宜長時(shí)間保存。后可長期保存。稀釋后的抗體不宜長時(shí)間保存。5. 5. 熒光素標(biāo)記抗體的鑒定熒光素標(biāo)記抗體的鑒定6. 6. 熒光記抗體的保存熒光記抗體的保存第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)（二）鑭系元素標(biāo)記物的制備（二）鑭系元素標(biāo)記物的制備 1.1.鑭系元素標(biāo)記物：
11、鑭系元素標(biāo)記物：銪（銪（Eu3+3+）、釤（）、釤（Sm3+3+）、）、 鋱（鋱（Tb3+3+）、釹（）、釹（Nd3+3+）和鏑（）和鏑（Dy3+3+）。）。 2.2.標(biāo)記方法：標(biāo)記方法：一步法、二步法。一步法、二步法。第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)三、熒光免疫技術(shù)的原理及類型三、熒光免疫技術(shù)的原理及類型 用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，讓其與相應(yīng)抗用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，讓其與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，借熒光檢測(cè)儀檢測(cè)抗原抗體原或抗體結(jié)合后，借熒光檢測(cè)儀檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物中特異性熒光的存在情況及其存在的部復(fù)合物中特異性熒光的存在情況及其存在的部位和強(qiáng)度，以判斷抗原或抗體存在的位置、分位和強(qiáng)度
12、，以判斷抗原或抗體存在的位置、分布和含量。布和含量。第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)（一）（一）熒光免疫顯微技術(shù)：熒光免疫顯微技術(shù)：用熒光素標(biāo)記抗體與組用熒光素標(biāo)記抗體與組織切片或細(xì)胞表面的抗原反應(yīng)，洗滌除去游離的織切片或細(xì)胞表面的抗原反應(yīng)，洗滌除去游離的熒光抗體后，在熒光顯微鏡下直接觀察特異性熒熒光抗體后，在熒光顯微鏡下直接觀察特異性熒光。光。（二）（二）熒光免疫測(cè)定技術(shù)：熒光免疫測(cè)定技術(shù)：以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體或以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合，用熒光檢測(cè)儀檢抗原，與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合，用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物中特異性熒光強(qiáng)度，對(duì)固體或測(cè)抗原抗體復(fù)合物中特異性熒光強(qiáng)度
13、，對(duì)固體或液體標(biāo)本中微量物質(zhì)定量測(cè)定。液體標(biāo)本中微量物質(zhì)定量測(cè)定。返回章目錄返回章目錄技術(shù)類型技術(shù)類型第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 熒光免疫顯微技術(shù)熒光免疫顯微技術(shù) 以熒光顯微鏡為檢測(cè)工具，用熒光素標(biāo)記抗以熒光顯微鏡為檢測(cè)工具，用熒光素標(biāo)記抗體或抗抗體，檢測(cè)組織切片中的細(xì)胞抗原或血清體或抗抗體，檢測(cè)組織切片中的細(xì)胞抗原或血清中的抗體，觀察特異性熒光，用于樣本的定性和中的抗體，觀察特異性熒光，用于樣本的定性和定位檢查。定位檢查。 第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)一、標(biāo)本的制作一、標(biāo)本的制作1.1.抗原在染色、洗滌和封埋過程中應(yīng)保持抗原的抗原在染色、洗滌和封埋過程中應(yīng)保
14、持抗原的完整性。完整性。2.2.標(biāo)本切片要求薄。標(biāo)本切片要求薄。3.3.常見的臨床標(biāo)本有組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類，常見的臨床標(biāo)本有組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類，可制作成涂片、印片或切片?？芍谱鞒赏科?、印片或切片。 4.4.除活細(xì)胞外，其他標(biāo)本片應(yīng)固定。除活細(xì)胞外，其他標(biāo)本片應(yīng)固定。第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)（一）直接法（一）直接法熒光素標(biāo)記抗體熒光素標(biāo)記抗體F FF F抗原抗原二、熒光抗體染色的技術(shù)類型二、熒光抗體染色的技術(shù)類型第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)（二）間接法（二）間接法F FF F熒光素標(biāo)熒光素標(biāo)記抗體記抗體抗原抗原抗體抗體第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)（1）抗
15、原間接定位法）抗原間接定位法熒光標(biāo)記的第二抗體熒光標(biāo)記的第二抗體 （二抗）（二抗）組織中的抗原組織中的抗原第一抗體（一抗）第一抗體（一抗）第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)（2）抗體間接定位法）抗體間接定位法熒光標(biāo)記抗體熒光標(biāo)記抗體組織中的抗體組織中的抗體抗原抗原 第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 用兩種熒光素分別標(biāo)記兩種不同的特用兩種熒光素分別標(biāo)記兩種不同的特異性抗體，對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行熒光染色，異性抗體，對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行熒光染色，洗滌后在熒光顯微鏡下用兩種不同的激洗滌后在熒光顯微鏡下用兩種不同的激發(fā)光激發(fā)，若有兩種抗原存在，可顯示發(fā)光激發(fā)，若有兩種抗原存在，可顯示兩種顏色的熒光。兩種顏
16、色的熒光。 （三）雙標(biāo)記法（三）雙標(biāo)記法第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)（1）直接法）直接法A熒光標(biāo)記的熒光標(biāo)記的抗甲抗原抗體抗甲抗原抗體B熒光標(biāo)記的熒光標(biāo)記的抗乙抗原抗體抗乙抗原抗體甲甲抗原抗原乙乙抗原抗原第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)抗甲抗原抗體抗甲抗原抗體抗乙抗原抗體抗乙抗原抗體甲抗原甲抗原乙抗原乙抗原（2）間接法）間接法乙熒光標(biāo)乙熒光標(biāo)記二抗記二抗甲熒光標(biāo)甲熒光標(biāo)記二抗記二抗第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)三、熒光顯微鏡三、熒光顯微鏡第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)操作操作特異性特異性非特異性非特異性敏感性敏感性臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用直接法直接法簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便強(qiáng)強(qiáng)少少偏低
17、偏低測(cè)一種抗原測(cè)一種抗原間接法間接法復(fù)雜復(fù)雜強(qiáng)強(qiáng)易出現(xiàn)易出現(xiàn)高高檢測(cè)多種抗原或抗檢測(cè)多種抗原或抗體體補(bǔ)體法補(bǔ)體法復(fù)雜復(fù)雜強(qiáng)強(qiáng)易出現(xiàn)易出現(xiàn)高高檢測(cè)多種抗原或抗檢測(cè)多種抗原或抗體體雙標(biāo)記法雙標(biāo)記法較簡(jiǎn)便較簡(jiǎn)便強(qiáng)強(qiáng)少少較高較高測(cè)兩種抗原測(cè)兩種抗原表表8-3 8-3 不同熒光免疫顯微技術(shù)的比較不同熒光免疫顯微技術(shù)的比較第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 陽性細(xì)胞顯色有均質(zhì)型、核膜型、斑點(diǎn)型核仁陽性細(xì)胞顯色有均質(zhì)型、核膜型、斑點(diǎn)型核仁型，顯色深淺可作為抗原定性、定位和定量依據(jù)。型，顯色深淺可作為抗原定性、定位和定量依據(jù)。 “-”-”為無或僅見極微弱熒光；為無或僅見極微弱熒光； “ “+”+”為熒光較
18、弱但清楚可見；為熒光較弱但清楚可見； “ “2+”2+”為熒光明亮；為熒光明亮； “ “3+”3+”為耀眼的強(qiáng)熒光。為耀眼的強(qiáng)熒光。“2+”2+”以上判定為陽性，對(duì)照光應(yīng)呈以上判定為陽性，對(duì)照光應(yīng)呈“-”-”或或“”。 結(jié)果判定結(jié)果判定第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 標(biāo)本應(yīng)新鮮，立即處理或及時(shí)冷藏，力求保標(biāo)本應(yīng)新鮮，立即處理或及時(shí)冷藏，力求保持抗原性和組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。持抗原性和組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。 陳舊標(biāo)本的自身熒光和非特異性吸附的熒光陳舊標(biāo)本的自身熒光和非特異性吸附的熒光將會(huì)增強(qiáng)，影響熒光免疫檢測(cè)結(jié)果和靈敏度。將會(huì)增強(qiáng)，影響熒光免疫檢測(cè)結(jié)果和靈敏度。 第八章第八章
19、熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)1.1.血清中自身抗體的檢測(cè)；血清中自身抗體的檢測(cè)；2.2.病原體快速鑒定及血清中抗體檢測(cè)；病原體快速鑒定及血清中抗體檢測(cè)；3.3.免疫病理組織中免疫球蛋白、補(bǔ)體和抗原抗免疫病理組織中免疫球蛋白、補(bǔ)體和抗原抗體復(fù)合物的檢測(cè)；體復(fù)合物的檢測(cè)；4.4.惡性腫瘤組織中腫瘤特異性抗原的鑒定；惡性腫瘤組織中腫瘤特異性抗原的鑒定；5.5.細(xì)胞表面抗原和受體檢測(cè)；細(xì)胞表面抗原和受體檢測(cè)；6.6.鑒定和計(jì)數(shù)鑒定和計(jì)數(shù)T T、B B細(xì)胞及其亞群。細(xì)胞及其亞群。返回章目錄返回章目錄 臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 用激光作掃描光源，用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面
20、快逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。物點(diǎn)。第三節(jié)第三節(jié) 共聚焦顯微技術(shù)共聚焦顯微技術(shù)第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)一、一、CLSM的工作原理的工作原理 激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源，對(duì)標(biāo)本內(nèi)焦激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源，對(duì)標(biāo)本內(nèi)焦平面上的每一點(diǎn)掃描，標(biāo)本上的被照射點(diǎn)，在探平面上的每一點(diǎn)掃描，標(biāo)本上的被照射點(diǎn)，在探測(cè)針孔處成像，由探測(cè)針孔后的光電倍增管逐點(diǎn)測(cè)針孔處成像，由探測(cè)針孔后的光電倍增管逐點(diǎn)或逐線接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)
21、視器屏幕上形成熒或逐線接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。光圖像。第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)二、二、CLSM的參數(shù)的參數(shù) 儀器的參數(shù)有：物鏡；激光功率；儀器的參數(shù)有：物鏡；激光功率；激光掃描程度；探測(cè)針孔；光電倍增激光掃描程度；探測(cè)針孔；光電倍增管；掃描速度；重復(fù)掃描次數(shù)。管；掃描速度；重復(fù)掃描次數(shù)。第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)三、共聚焦顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)三、共聚焦顯微鏡的優(yōu)點(diǎn) CLSM具有圖像靜態(tài)采集和動(dòng)態(tài)掃描功能。具有圖像靜態(tài)采集和動(dòng)態(tài)掃描功能。 1. 1. 高分辨率；高分辨率； 2 2斷層掃描；斷層掃描； 3 3共扼顯像；共扼顯像； 4 4微分干涉成像；微分干涉成
22、像； 5 5三維重建；三維重建； 6 6熒光的半定量和絕對(duì)定量。熒光的半定量和絕對(duì)定量。 第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)四、四、CLSM的臨床應(yīng)用的臨床應(yīng)用共聚焦顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用共聚焦顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用細(xì)胞器的研究；細(xì)胞器的研究；細(xì)胞間通訊的研究；細(xì)胞間通訊的研究；用于分層掃描、三維重建生物結(jié)構(gòu)的分析；用于分層掃描、三維重建生物結(jié)構(gòu)的分析；免疫熒光定量、定位測(cè)定；免疫熒光定量、定位測(cè)定；細(xì)胞內(nèi)離子測(cè)定；細(xì)胞內(nèi)離子測(cè)定；細(xì)胞膜流動(dòng)性分析。細(xì)胞膜流動(dòng)性分析。 第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 1. 1.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察：激光掃描共聚焦顯微鏡觀察：
23、兩種熒光素標(biāo)記抗體，顯示含有不同成分的兩種細(xì)胞兩種熒光素標(biāo)記抗體，顯示含有不同成分的兩種細(xì)胞在同一區(qū)域的定位模式。在同一區(qū)域的定位模式。第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 2.2.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察：激光掃描共聚焦顯微鏡觀察：不同的熒光素標(biāo)記兩種抗體，定位同一細(xì)胞內(nèi)存在不同的熒光素標(biāo)記兩種抗體，定位同一細(xì)胞內(nèi)存在的兩種不同成分。的兩種不同成分。返回章目錄返回章目錄第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)第四節(jié)第四節(jié) 熒光免疫測(cè)定技術(shù)熒光免疫測(cè)定技術(shù)熒光抗熒光抗體技術(shù)體技術(shù)熒光免熒光免疫測(cè)定疫測(cè)定非均相熒光非均相熒光免疫測(cè)定免疫測(cè)定 熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒熒光免疫技術(shù)是
24、將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性相結(jié)合，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性、光技術(shù)的敏感性相結(jié)合，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)。定位或定量檢測(cè)。時(shí)間分辨熒光時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定免疫測(cè)定熒光酶免疫測(cè)定熒光酶免疫測(cè)定-熒光偏振免疫測(cè)定熒光偏振免疫測(cè)定熒光免熒光免疫技術(shù)疫技術(shù)均相熒光均相熒光免疫測(cè)定免疫測(cè)定第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 根據(jù)熒光素標(biāo)記抗原與其抗原抗體復(fù)合物之間根據(jù)熒光素標(biāo)記抗原與其抗原抗體復(fù)合物之間熒光偏振程度的差異，測(cè)定液體中小分子物質(zhì)的含熒光偏振程度的差異，測(cè)定液體中小分子物質(zhì)的含量。量。 一、熒光偏振免疫測(cè)定一、熒光偏振免疫測(cè)定熒光偏振免疫測(cè)定原理示意圖熒光偏振免疫
25、測(cè)定原理示意圖 返回章目錄返回章目錄第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)第五節(jié)第五節(jié) 免疫芯片技術(shù)免疫芯片技術(shù)一、免疫芯片的檢測(cè)原理一、免疫芯片的檢測(cè)原理 將幾個(gè)、幾十個(gè)，甚至幾萬個(gè)或更高數(shù)量的抗原將幾個(gè)、幾十個(gè)，甚至幾萬個(gè)或更高數(shù)量的抗原( (或抗體或抗體) )高密度排列在固相載體上，形成高密度抗原高密度排列在固相載體上，形成高密度抗原或抗體微點(diǎn)陣的免疫芯片，與少量待檢樣品或生物標(biāo)或抗體微點(diǎn)陣的免疫芯片，與少量待檢樣品或生物標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)，可一次獲得芯片中所有本同時(shí)進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)，可一次獲得芯片中所有已知抗原已知抗原( (或抗體或抗體) )的檢測(cè)結(jié)果。的檢測(cè)結(jié)果。第八章第八
26、章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)免疫芯片的檢測(cè)原理圖免疫芯片的檢測(cè)原理圖第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)1.1.芯片陣列項(xiàng)目要求合理組合芯片陣列項(xiàng)目要求合理組合2.2.設(shè)計(jì)陣列組合中的抗體要配齊，有陣列抗體庫設(shè)計(jì)陣列組合中的抗體要配齊，有陣列抗體庫3.3.微陣列點(diǎn)樣制備系統(tǒng)將抗體或抗原固化微陣列點(diǎn)樣制備系統(tǒng)將抗體或抗原固化4.4.所有抗原抗體集中在同一張芯片的微細(xì)結(jié)構(gòu)內(nèi)反應(yīng)所有抗原抗體集中在同一張芯片的微細(xì)結(jié)構(gòu)內(nèi)反應(yīng)5.5.用同位素、熒光、化學(xué)發(fā)光、酶的成色反應(yīng)等顯示用同位素、熒光、化學(xué)發(fā)光、酶的成色反應(yīng)等顯示結(jié)果，通過掃描儀或結(jié)果，通過掃描儀或CCD攝像技術(shù)記錄和計(jì)算機(jī)軟攝像技術(shù)記錄和計(jì)算
27、機(jī)軟件分析綜合成可讀的生物樣品信息件分析綜合成可讀的生物樣品信息二、免疫芯片的關(guān)鍵技術(shù)二、免疫芯片的關(guān)鍵技術(shù)第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)三、免疫芯片的分類三、免疫芯片的分類1. 根據(jù)載體分為根據(jù)載體分為 平板芯片（或固相芯片）、微球芯平板芯片（或固相芯片）、微球芯片（或液體芯片）；片（或液體芯片）；2. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理分為根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理分為 雙抗體夾心法免疫芯片、間接雙抗體夾心法免疫芯片、間接法免疫芯片、競(jìng)爭(zhēng)法免疫芯片、免疫法免疫芯片、競(jìng)爭(zhēng)法免疫芯片、免疫-PCR 芯片；芯片；3. 根據(jù)檢測(cè)方法分為根據(jù)檢測(cè)方法分為 酶標(biāo)法免疫芯片、放射性同位酶標(biāo)法免疫芯片、放射性同位素法免疫芯片、熒光法
28、免疫芯片、金標(biāo)法免疫芯片素法免疫芯片、熒光法免疫芯片、金標(biāo)法免疫芯片以及生物素、抗生物素蛋白法免疫芯片、細(xì)胞免疫以及生物素、抗生物素蛋白法免疫芯片、細(xì)胞免疫芯片。芯片。 第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 一種免疫芯片與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)。一種免疫芯片與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)。將微小的乳膠顆粒（將微小的乳膠顆粒（5.6um）用熒光染色的方法）用熒光染色的方法進(jìn)行編碼，每種顏色的微粒代表一種檢測(cè)標(biāo)志物，進(jìn)行編碼，每種顏色的微粒代表一種檢測(cè)標(biāo)志物，把針對(duì)不同檢測(cè)物的彩色編碼微?；旌虾蠹尤胛厌槍?duì)不同檢測(cè)物的彩色編碼微?；旌虾蠹尤胛⒘坎∪藰?biāo)本，在懸液中靶分子與微粒進(jìn)行特異性量病人標(biāo)本，在
29、懸液中靶分子與微粒進(jìn)行特異性地結(jié)合，通過激光流式儀判定后由電腦以數(shù)據(jù)信地結(jié)合，通過激光流式儀判定后由電腦以數(shù)據(jù)信息的形式記錄下來。息的形式記錄下來。 1.1.液體芯片液體芯片第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 用于研究抗體的芯片，芯片上排列著多種已知用于研究抗體的芯片，芯片上排列著多種已知單克隆抗體，其對(duì)應(yīng)的抗原都是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能單克隆抗體，其對(duì)應(yīng)的抗原都是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能上重要的蛋白質(zhì)，涉及信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤、細(xì)胞周上重要的蛋白質(zhì)，涉及信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)期調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域。通過一張芯片，能比較幾百種蛋白質(zhì)的表達(dá)域。通過一張
30、芯片，能比較幾百種蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。變化。2.2.抗體芯片抗體芯片第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)抗體芯片的整個(gè)操作流程圖抗體芯片的整個(gè)操作流程圖第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)抗體芯片檢測(cè)多種蛋白質(zhì)的表達(dá)情況抗體芯片檢測(cè)多種蛋白質(zhì)的表達(dá)情況第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 以細(xì)胞為研究對(duì)象以細(xì)胞為研究對(duì)象, , 利用免疫學(xué)原理和微型利用免疫學(xué)原理和微型化操作方法化操作方法, , 實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞樣品的快速檢測(cè)和分析。實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞樣品的快速檢測(cè)和分析。利用細(xì)胞表面抗原與抗體特異性結(jié)合原理，通過利用細(xì)胞表面抗原與抗體特異性結(jié)合原理，通過抗體微陣列和細(xì)胞懸液樣品的反應(yīng)，捕獲待測(cè)目抗體微陣
31、列和細(xì)胞懸液樣品的反應(yīng)，捕獲待測(cè)目的細(xì)胞，結(jié)合在不同抗體點(diǎn)上的細(xì)胞代表了不同的細(xì)胞，結(jié)合在不同抗體點(diǎn)上的細(xì)胞代表了不同的細(xì)胞免疫表型。的細(xì)胞免疫表型。3.3.細(xì)胞免疫芯片細(xì)胞免疫芯片第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)四、免疫芯片的應(yīng)用四、免疫芯片的應(yīng)用 腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè) 感染性疾病的檢測(cè)感染性疾病的檢測(cè) 心血管疾病和自身免疫性疾病的檢測(cè)心血管疾病和自身免疫性疾病的檢測(cè) 細(xì)胞膜表面抗原的檢測(cè)細(xì)胞膜表面抗原的檢測(cè) 細(xì)胞因子的檢測(cè)細(xì)胞因子的檢測(cè) 興奮劑的檢查興奮劑的檢查返回章目錄返回章目錄第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 熒光免疫技術(shù)：熒光免疫技術(shù)：是將抗原抗體反應(yīng)的特異性
32、與熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合，對(duì)抗原定性、定位或定量檢測(cè)。的敏感性結(jié)合，對(duì)抗原定性、定位或定量檢測(cè)。 熒光抗體技術(shù)熒光抗體技術(shù)：熒光素標(biāo)記抗體與抗原反應(yīng)：熒光素標(biāo)記抗體與抗原反應(yīng), , 在熒光顯在熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復(fù)合物微鏡下觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復(fù)合物, ,分為直接法、分為直接法、間接法和雙標(biāo)記法等。間接法和雙標(biāo)記法等。 免疫芯片技術(shù)免疫芯片技術(shù)：將較多數(shù)量的抗原將較多數(shù)量的抗原( (或抗體或抗體) )高密度排列高密度排列在固相載體上，形成微點(diǎn)陣的免疫芯片，與少量待檢樣在固相載體上，形成微點(diǎn)陣的免疫芯片，與少量待檢樣品同時(shí)進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)，可一次獲得芯片中所有已品同時(shí)進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)，可一次獲得芯片中所有已知抗原知抗原( (或抗體或抗體) )的檢測(cè)結(jié)果。的檢測(cè)結(jié)果。 小小 結(jié)結(jié)返回章目錄返回章目錄第八章第八章 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)THANK YOU FOR YOUR ATTENTION!返回總目錄返回總目錄
08第八章熒光免疫技術(shù)
