紫花苜蓿對(duì)鉛污染土壤修復(fù)能力及其機(jī)理的研究

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1、紫花苜蓿對(duì)鉛污染土壤修復(fù)能力及其機(jī)理的研究 葉春和* Email:yechunhe@ （濟(jì)南大學(xué)地理系 250022, 濟(jì)南） 摘要 以10mmol/L Pb(NO3)2處理紫花苜蓿幼苗10d，分析了Pb在紫花苜蓿幼苗根、莖、葉中的積累情況、Pb在根表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞區(qū)域化特點(diǎn)及Pb在紫花苜蓿體內(nèi)的主要存在形式。結(jié)果表明，Pb在紫花苜蓿幼苗中積累量（M）特點(diǎn)為：M根>M莖>M葉。同時(shí)X-ray微區(qū)分析顯示，胞間隙是紫花苜蓿積累Pb濃度最高的部位，細(xì)胞壁和液泡次之，胞質(zhì)中最低。Pb的存在形式分析表明Pb在紫花苜蓿體內(nèi)主要以難溶的形式存在，另外BSO能夠加劇Pb污染對(duì)紫花苜蓿幼苗Pn和生

2、長(zhǎng)的抑制作用，表明紫花苜蓿對(duì)Pb的耐受與植物絡(luò)和素的形成有關(guān)。這些都表明紫花苜蓿對(duì)Pb具有一定的耐受機(jī)制，避免其對(duì)胞質(zhì)代謝的毒性。同時(shí)紫花苜蓿具有很高的生物量和對(duì)Pb較高的富集作用，因此是一種很有利用價(jià)值的土壤鉛污染修復(fù)植物。 關(guān)鍵詞 土壤修復(fù) 紫花苜蓿 X-ray微區(qū)分析 隨著世界人口的快速增長(zhǎng)和工業(yè)的迅猛發(fā)展，土壤這一人類賴以生存的必需資源正承受著越來越大的壓力。因受到工業(yè)三廢和農(nóng)用化學(xué)品以及礦區(qū)的污染，有相當(dāng)數(shù)量農(nóng)田的土壤質(zhì)量日趨下降。在我國由于重金屬污染而引起的糧食減產(chǎn)達(dá)1000萬噸/年，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)100多億元。在西方發(fā)達(dá)國家和其他發(fā)展中國家也存在著類似的問題。土壤修復(fù)問題受到

3、人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注，在部分西方國家土壤修復(fù)正發(fā)展成為一個(gè)新興的環(huán)境產(chǎn)業(yè)。1998年9月，第16屆國際土壤學(xué)大會(huì)在法國Motepellier召開，土壤修復(fù)問題成為大會(huì)的一個(gè)熱點(diǎn)。2000年10月第一屆土壤修復(fù)國際學(xué)術(shù)會(huì)議在中國杭州召開。 對(duì)重金屬污染土壤修復(fù)的措施主要包括物理、化學(xué)和生物學(xué)措施（bioremediation）。其中物理和化學(xué)措施主要是通過降低有重金屬（Pb、Cd、Cu、Zn等）的可溶性和生物可獲得性（bioavailability），從而減小其毒害作用。近年來，土壤修復(fù)研究中生物學(xué)措施(主要是植物修復(fù)技術(shù)：phytoremediation)以其過程簡(jiǎn)單、成本低廉和不存在安全隱患

4、等特點(diǎn)受到了人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注，在這一方面已有很多成功的例子[1、2、3]，即通過對(duì)特定重金屬具有超富集作用的植物從被污染土壤中吸?。╬hytoextract）重金屬離子從而減少其在土壤中的含量，達(dá)到土壤修復(fù)（remediation）的目的。植物修復(fù)技術(shù)是一種很有潛力、正在發(fā)展的環(huán)境修復(fù)技術(shù)，也是一門正在崛起并涉及土壤學(xué)、植物學(xué)、環(huán)境工程等多門學(xué)科的新興邊緣學(xué)科[4]。已有報(bào)道紫花苜蓿（Medicago sativa L.）對(duì)鎳和銅離子具有較高的富集作用，是一種很有應(yīng)用前景的土壤修復(fù)植物[5、6、7]。但就其對(duì)鉛的富集能力和機(jī)理問題尚缺少全面的研究，基于此，本文研究了Pb(NO3)2處理下紫花

5、苜蓿幼苗體內(nèi)鉛的積累、亞細(xì)胞分布、結(jié)合形態(tài)和Pb污染環(huán)境下BSO(buthionine sulfoximine, 一種植物絡(luò)合素的合成抑制劑)對(duì)紫花苜蓿光合作用和生長(zhǎng)的效應(yīng)，以期就紫花苜蓿對(duì)鉛的富集能力和機(jī)理進(jìn)行初步的探討。 1 材料與方法 1.1 植物材料和污染處理 將紫花苜蓿(Medicago sativa L.)種子（采自山東省陵縣）播種于裝有洗凈細(xì)砂的花盆（直徑20 cm，高25cm）中。萌發(fā)后，每天澆灌Hoagland營養(yǎng)液一次。長(zhǎng)出三個(gè)復(fù)葉后選擇生長(zhǎng)一致的健壯幼苗每盆保留10株。在第10片復(fù)葉出現(xiàn)時(shí)，用10 mmol/L Pb(NO3)2溶液處理紫花苜蓿幼苗，每天澆灌兩次，早

6、晚各一次。每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。處理10 d后，取樣測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。 1.2 試定內(nèi)容和方法 1.2.1 光合速率的測(cè)定 以美國產(chǎn)Li-6400便攜式光合儀測(cè)定紫花苜蓿幼苗葉片的凈光合速率(Pn)，光強(qiáng)為1600 Lx，溫度為32℃。 1.2.2 紫花苜蓿幼苗體不同部位Pb含量的分析 收獲整株植物，用蒸餾水沖洗干凈，以吸水紙吸干其表面水分，小心分成根、莖以及葉片三部分，放入120℃烘箱中殺青后，以85℃恒溫烘干24 h，稱重后，取少量放入馬伏爐中510℃灰化12 h，室溫冷卻后用一滴濃HNO3消化，以去離子水定容至500ml后，用日立Z-8000原子吸收光譜儀測(cè)定溶液的Pb含量。

7、 1.2.3 Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮細(xì)胞中的微區(qū)分布 將制備好的切片在配有EDAX-9100能譜儀的日立H-800型透射電鏡下進(jìn)行測(cè)定，加速電壓為150 KV，取出角為25，樣品的測(cè)量計(jì)數(shù)時(shí)間為60 s，測(cè)出的數(shù)值分別表示扣除背底后的每種元素的X-ray計(jì)數(shù)值（CPS）。在檢測(cè)時(shí)，對(duì)每一組織區(qū)域所測(cè)定的微區(qū)，至少測(cè)試30個(gè)點(diǎn)，求出其平均值[8]。 1.2.4 紫花苜蓿幼苗根和葉片中Pb的化學(xué)形態(tài)分析 用逐步提取法研究紫花苜蓿幼苗根和葉片中Pb的化學(xué)形態(tài)[9]。提取劑及提取順序?yàn)?0%乙醇、去離子水、1 mol NaCl溶液、2%醋酸、0.6 mol鹽酸。 分別稱取4.000 g紫花苜

8、蓿幼苗根和葉片新鮮樣品，剪成的碎片，置于燒杯中，加入37.5ml提取劑，在30℃恒溫箱中放置過夜，次日回收提取液，再加入同樣體積該提取液，侵取2 h后再回收提取液，重復(fù)2次，即在24 h內(nèi)提取4次，集4次提取液（共150 ml）于燒杯中。提取液經(jīng)蒸發(fā)近干后，用一定比例硝酸-高氯酸消化，用10%硝酸定容，用日立Z-8000原子吸收光譜儀測(cè)定溶液中Pb的含量。 80%乙醇提取以硝酸鹽、氯化物為主的無機(jī)鹽以及氨基酸鹽等;去離子水提取水溶性有機(jī)酸鹽、重金屬的一代磷酸鹽等;1mol NaCl 溶液提取果膠酸鹽、與蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)或吸著態(tài)的重金屬等;2%醋酸提取難溶性的重金屬磷酸鹽等;0.6 mol鹽酸提取

9、草酸鹽等。 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.1 Pb污染對(duì)紫花苜蓿幼苗體內(nèi)Pb水平的影響 紫花苜蓿幼苗在以含有10mmol/LPb(NO3)2的Hoagland培養(yǎng)液處理10 d后，其根、莖以及葉片內(nèi)的Pb水平極顯著升高，而根部比其它部位積累的多，具體地說，根中Pb水平分別是莖的22.43倍，葉片的35.466倍。（表1） 表1. Pb在紫花苜蓿幼苗不同部位中的含量 Table 1. Pb contents in different parts of M. sativa seedlings 處理 紫花苜蓿不同部位中的Pb含量（μg/g DW） 根

10、 莖 葉 對(duì)照 15.31 20.34 16.17 10mmol/LPb 12134.21 541.08 342.17 2.2 Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮細(xì)胞中的微區(qū)分布 用X-ray分別測(cè)定了紫花苜蓿幼苗根表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)、液泡以及細(xì)胞間隙中的Pb相對(duì)含量。結(jié)果表明，對(duì)照植株根細(xì)胞及細(xì)胞間隙中的Pb含量可能太低而沒有測(cè)出。但是Pb處理的紫花苜蓿幼苗根細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)、液泡和細(xì)胞間隙中積累了大量的Pb，

11、其中細(xì)胞間隙中Pb含量最高，細(xì)胞壁和液泡次之，細(xì)胞質(zhì)中的最低，具體來講，細(xì)胞間隙、細(xì)胞壁和液泡中的Pb含量分別是細(xì)胞質(zhì)中的3.19、2.47和1.70倍（圖1，表2）。 表2. Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮細(xì)胞中的區(qū)域化 Table 2. Compartmentation of Pb in root epidermal cells of M. sativa seedlings determined with X-ray microanalysis 處理 紫花苜蓿幼苗根表皮細(xì)胞不同部位中的Pb含量（CPS） 細(xì)胞壁 細(xì)胞質(zhì) 液泡 細(xì)胞間隙 對(duì)照 0 0 0 0 10mmo

12、l/LPb 69.99 28.31 48.26 90.33 *表中數(shù)據(jù)由圖1.中的能譜計(jì)算而得 CPS（count per second）：X-ray計(jì)數(shù)單位 圖1. Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮細(xì)胞中微區(qū)分布的能譜圖 A 細(xì)胞間隙（處理）B液泡（處理）C細(xì)胞質(zhì)（處理）D液泡（對(duì)照） 2.3紫花苜蓿幼苗根和葉片中Pb的化學(xué)形態(tài) 紫花苜蓿幼苗根和葉片內(nèi)Pb化學(xué)形態(tài)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Pb污染下，Pb的醋酸（HAc）提取態(tài)和鹽酸（HCl）提取態(tài)是紫花苜蓿幼苗根內(nèi)Pb的主要化學(xué)形態(tài)，它們分別占根中總含Pb量的36%和33%左右。其它形態(tài)的含量相對(duì)較低，它們的大小順序?yàn)椋篎HAc>F

13、HCl>FEthanol（12.6%）> FNaCl（9.9%）> FWater（7.7%）> FResidue（0.2%）。在葉片中Pb的主要提取形態(tài)與根中的相似，HCl提取態(tài)和HAc提取態(tài)是主要形態(tài)，它們大約分別占葉片中總含Pb量的41%和20%（表3）。 表3. 紫花苜蓿幼苗根和葉片內(nèi)Pb化學(xué)形態(tài)的含量 Table 3. The contents of various Pb forms in leaves and roots of M. sativa seedlings（F: form） 器官 處理 不同Pb 化學(xué)形態(tài)的含量 (μg/g DW) FEthanol FWat

14、er FNaCl FHAc FHCl FResidue 根 對(duì)照 1.84 1.47 2.56 4.89 2.37 4.91 10mmol/LPb 1541.11 943.66 1208.43 4431.34 4105.47 26.88 葉 對(duì)照 1.05 1.81 2.21 1.41 2.41 0.92 10mmol/LPb 60.72 40.21 44.75 88.23 182.46 26.37 2.4 BSO對(duì)Pb污染下紫花苜蓿幼苗光合作用和生長(zhǎng)的影響 從圖2和表4可以看出，1.0 mmol/L Pb處理后，

15、紫花苜蓿幼苗光合速率和生長(zhǎng)下降。BSO對(duì)對(duì)照紫花苜蓿幼苗的光合作用和生長(zhǎng)沒有影響，而對(duì)Pb污染紫花苜蓿幼苗光合作用和生長(zhǎng)的影響較明顯（不加BSO幼苗的Pn和干重分別是加BSO幼苗的1.5和1.2倍）。 圖2. BSO對(duì)Pb污染和對(duì)照組紫花苜蓿幼苗光合作用的影響 Fig2. Effect of BSO on photosynthesis of M. sativa seedlings with and without Pb contamination 表4. BSO對(duì)Pb污染和對(duì)照組紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響 Table4. Effect of BSO on the growth of M

16、. sativa seedlings with or without Pb contamination 不同處理?xiàng)l件下每株紫花苜蓿的干重（g/plant） 0mmol/L Pb 0mmol/L Pb+BSO 1.0mmol/L Pb 1.0mmol/LPb+BSO 0.52 0.53 0.48 0.40 *處理10d后的數(shù)據(jù) 3討論 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，在Pb污染環(huán)境下，進(jìn)入紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的絕大部分Pb被富集在根部，而遷移至其它部位的較少。這支持Ye的結(jié)果[10]。由于大部分Pb積累在紫花苜蓿根部，從而減輕了地上部分各器官的毒害作用，一定程度上提高了紫花苜蓿對(duì)Pb的耐性

17、。紫花苜蓿根部富集Pb的機(jī)理可能涉及到植物體能限制Pb從根部運(yùn)輸?shù)街仓昵o、葉部分；紫花苜蓿根部具有積累Pb的能力；地上部分具有一定拒Pb的能力或地上部分能把吸收到的Pb重新運(yùn)回根部等。但是至今還沒有一個(gè)較合理地解釋紫花苜蓿吸收或運(yùn)輸Pb的機(jī)理。 從X-ray微區(qū)分析結(jié)果可以看出，Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮細(xì)胞內(nèi)的微區(qū)分布明顯不同。絕大部分Pb都沉積在細(xì)胞間隙（質(zhì)外體）中，這與前人以其它植物為材料的研究結(jié)果是一致的[10、11、12、13]。說明在Pb污染下，植物根部細(xì)胞的質(zhì)外體可視為重要的Pb離子貯存場(chǎng)所。Pb被局限在代謝活性較低的區(qū)域（質(zhì)外體、細(xì)胞壁和液泡），從而阻止過多的Pb進(jìn)入原生質(zhì)體，

18、這樣，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一些重要物質(zhì)和代謝活動(dòng)在一定程度上可免受Pb毒害，使紫花苜蓿對(duì)Pb表現(xiàn)出一定的耐性。 化學(xué)存在形式分析表明紫花苜蓿幼苗體內(nèi)Pb的存在，無論在根部或葉片內(nèi)，都是以HAc和HCl 提取態(tài)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，也就是說，進(jìn)入紫花苜蓿體內(nèi)的Pb多與一些物質(zhì)結(jié)合形成毒性較低的難溶性化合物，而自由態(tài)的Pb含量相對(duì)較低，以致它的毒害作用也比較小[14]。所以紫花苜蓿對(duì)Pb的耐性在一定程度上是由于Pb在其體內(nèi)的存在形式造成的。另外，由于富集在紫花苜蓿根部的Pb是以難溶的HAc和HCL提取態(tài)占優(yōu)勢(shì)，所以它就不容易由根部向地上部分遷移。另外BSO能夠加劇Pb污染對(duì)紫花苜蓿幼苗Pn和生長(zhǎng)的抑制作用，表明紫花

19、苜蓿對(duì)Pb的耐受與植物絡(luò)和素的形成有關(guān)。 綜上所述，紫花苜蓿對(duì)Pb的耐受機(jī)理在整體水平上表現(xiàn)為把Pb的積累局限于根部，從而避免對(duì)地上部分的毒害；在亞細(xì)胞水平上，將Pb區(qū)域化于細(xì)胞間隙、細(xì)胞壁及液泡等微區(qū)內(nèi)，從而避免了Pb在胞質(zhì)中的過度積累和對(duì)代謝酶的抑制作用。同時(shí)進(jìn)入紫花苜蓿植株體內(nèi)的Pb主要以難溶性的化合物形式存在，一方面阻止了Pb向植株地上部分的運(yùn)輸；另一方面造成其在胞間隙和細(xì)胞壁的沉積，減少了其進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)會(huì)和降低了Pb本身的毒性。由于紫花苜蓿具有很高的生物量（biomass），而且其對(duì)Pb具有較高的富集作用（表1），所以是一種很有開發(fā)和利用價(jià)值的土壤污染修復(fù)植物，值得深入研究。

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29、ots, stems and leaves) of the plant, subcellular compartmentation of Pb in the epidermal cells in roots by X-ray microanalysis and the main chemical forms of Pb in the plant body. Results showed that the trait of Pb accumulation (M) in alfalfa seedlings was Mroot>Mstem>Mleaf. At the same time X-ray

30、microanalysis indicated that Pb relative content in the intercellular space was the highest, followed by that in cell wall and vacuoles and the lowest Pb concentration was recorded in the cytoplasma. The determination of Pb chemical forms demonstrated that Pb was accumulated in alfalfa seedlings mai

31、nly in insoluble forms. All of this indicated that he plant was competent to stand Pb contamination to some degree and avoid its toxicity with the certain mechanisms. At the same time alfalfa had a very high biomass and was able to accumulate relatively high Pb content in its body, indicating that the plant may be valuable in the phytoremediation of Pb-contaminated soil. Keywords Phytoremediation; Alfalfa; X-ray microanalysis 8