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1、 DNA的連接與轉化的連接與轉化1.分子的體外連接 2的轉化及轉化子的篩選的轉化及轉化子的篩選一實驗目的及背景一實驗目的及背景 當我們已經獲得目的基因片段，選擇好適當的克隆（或表達，轉化）質粒載體， 并確定重組方案后，下面要進行的就是片段之間的體外連接，從而獲得重組子。 此重組子可轉入相應的宿主菌中用于對目的基因的擴增以及目的基因表達（如現代基因工程藥物的生產），還可用于序列分析和轉基因等重要生物技術的研究中。1、分子的體外連接 分子的體外連接就是在一定條件下， 由連接酶催化兩個雙鏈片段組鄰的端磷酸與端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學過程， 分子的連接是在酶切反應獲得同種酶互補序列基礎上進行的
2、。連接反應中值得注意的幾個問題： 1.連接酶 常用的連接酶有兩種： (1)來自大腸桿菌的連接酶 (2)來自噬菌體的連接酶。 二者的作用機理類似。連接酶作用機制 連接酶作用分三步： 連接酶與輔助因子形成酶復合物。 酶復合物結合到具有磷酸基和羥基切口的上，使腺苷化。 產生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來.2.連接反應的溫度 連接酶的最適反應溫度為， 但在此溫度下， 粘性末端的氫鍵結合很不穩(wěn)定，折衷方法是過夜。3. DNA的平未端和粘性末端 由于內切酶產生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而連接反應中就有平未端連接和粘性末端連接。 二者連接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物濃度，酶濃度選擇上是有
3、差異的，4.堿性磷酸酶處理質粒載體 為了提高連接效率，一般采取提高的濃度，增加重組子比例。這樣就會出現自生連接問題， 為此通常選擇對質粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其末端的磷酸基，防止環(huán)化， 通過接反應后形成的缺口可在轉化細胞后得以修復。見下圖。5.連接反應的檢測 連接反應成功與否，最后的檢測要通過下一步實驗，轉化宿主菌， 陽性克隆的篩選來確定。 我們下面的實驗從粘性末端為例操作。 二、實驗試劑二、實驗試劑 純化后的酶切質粒載體和目的基因。 連接酶buffer 200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫芐糖醇 500l/ml BSA 連接酶 5mM ATP三
4、實驗方法三實驗方法分子的體外連接在無菌Eppendorf管中加入以下溶液：a. 0.1g質粒載體，倍分子的外源。b. 加無菌水至7.5l，于加溫分鐘使重新退火的粘端解鏈， 將混合物冷卻到。c. 加入：連接酶buffer 1l連接酶 0.1Weiss5mM ATP 1l蓋上管蓋，充分混勻，臺式離心扣上離心秒。下過夜連接反應。反應結束后于保存。四結果與分析四結果與分析 電泳檢查連接結果 如何判斷連接效果的成功性？問題與討論： 簡述連接酶作用機理。 簡述一個完整外源的克隆過程。 連接反應中應注意些什么問題及如何提高連接效率。2的轉化及轉化子的篩選的轉化及轉化子的篩選 一實驗目的及背景一實驗目的及背景
5、 體外通過基因工程手段所構建的含目的基因的重組質粒，選用轉化和篩選技術， 可獲得含重組的陽性克隆。在此陽性克隆中，可在生物體系中大量擴增，繁殖， 保存以及表達目的基因的產物，這是體外擴增所不能替代的。配合重組技術，所獲得的，不同目的需要的陽性菌株已廣泛應用于科研，醫(yī)藥生產和生物發(fā)酵等領域。本實驗由二個方面組成: 1. 質粒轉化大腸桿菌。 質粒轉化不同細菌有不同的轉化效率，轉化效率的高低與實驗的成敗直接相關， 通常轉化效率可達轉化子/g DNA。 獲得高轉化效率的關鍵是感受態(tài)體菌的制備。 所謂感受態(tài)， 就是細菌吸收轉化因子的生理狀態(tài)。 關于感受態(tài)的本質與存在，說法很多， 目前主要有兩種假說： 局
6、部原生質體化假說感受態(tài)細胞的表面形成一種能接受的酶位點， 使分子能進入細胞。制備感受態(tài)細胞 現在制備感受態(tài)細胞通常用CaCl2處理，在低溫中與外來分子相混合. 分子轉化分以下幾步: 吸附雙鏈分子吸附于受體菌表面； 轉入雙鏈分子解鏈。一條鏈進入受體菌，另一條降解； 自穩(wěn)外源質粒分子在細胞內復制成雙鏈； 表達一供體基因隨同復制子同時復制，分裂， 轉錄翻譯。2.重組子的篩選 這和受體菌：質粒的選擇相關， 原則上要注意： 受體菌必須是限制與修飾系統(tǒng)缺陷的菌株； 根據質?；蛐秃褪荏w菌基因型互補原則而定。 重組子的篩選方法常用的有兩種方法：抗生素篩選法 菌株為某種抗生缺陷型， 而質粒上帶有該抗性基因（如
7、氨芐青霉素， 卡拉霉素等）這樣只有轉化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。本實驗利用抗生篩選轉化子?；パa法 現在使用的許多載體（如系列）有含有一個大腸桿菌的短區(qū)段，其中含有半乳糖苷酸基因（lacZ）的調控序列和頭個氨基酸偏碼區(qū)。這個偏碼區(qū)中插入一個多克隆位點。 受體菌則含編碼半乳糖苷酶端的序列。當外源基因插入時，二者溶為一體后，有半乳糖苷酶表達， 在生色底物溴氯吲哚半乳糖苷（x-gal）培養(yǎng)基中形成蘭色菌落。 而當有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入失活，而使lacZ基因不表達而形成白色菌斑。 通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。二、實驗試劑二、實驗試劑 培養(yǎng)基 質粒（含Amp抗生基因），受
8、體菌 CaCl2 0.1M Amp 三實驗方法三實驗方法一、感受態(tài)細胞制備將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，培養(yǎng)小時。挑取單菌落轉入 培養(yǎng)基錐瓶中，振蕩過夜。從中取菌液轉入 培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)小時， 測達。培養(yǎng)物于冰上分鐘。轉入離心管，于下離心分鐘。棄上清，倒置離心管分鐘，流盡剩余殘液然后加入10ml用冰預冷的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上分鐘。4,000rpm 4離心分鐘，棄上清。加入2ml，0.1M CaCl2懸浮細胞，于過夜。二、轉化 在1.5ml Eppendorf管中加入l感受態(tài)細胞和l 40ng DNA溶液， 溫和混勻，于冰上分鐘。 于水浴秒。 冰浴分鐘。 加入l 液體培養(yǎng)基 分鐘。 取l涂布于含Amp(50g/ml)瓊脂糖平皿， 培養(yǎng)小時，觀察結果。四結果與分析討論四結果與分析討論 計算轉化率。 根據轉化率和陰性對照分析實驗結果。 問題與討論： 根據本實驗認為影響轉化率的因素有哪些？ 抗性法篩選和互補篩選原理是什么？
生物實驗： dna連接與轉化
