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1、
植物的組織培養(yǎng)
在《生物技術實踐》模塊課程標準中,植物組織培養(yǎng)的具體要求是“嘗試植物的組織培養(yǎng)”。嘗試是技能性目標中的模仿水平,即學生仿照教師的示范性動作完成對實驗對象的操作。
植物組織培養(yǎng)是一項操作復雜而精細,操作難度較大的實踐活動,其操作流程包括:配制母液、培養(yǎng)基配制與滅菌、外植體選擇和消毒、接種、形成愈傷組織、誘導叢芽和生根、組培苗移栽等操作環(huán)節(jié)。從操作的持續(xù)時間看,完成前四項活動需要一天,后三項活動需要1~2個月。為了確保在有限的時間內(nèi)順利地展開實驗教學,需要確定學生動手操作的一些重要環(huán)節(jié)和步驟,并針對這些環(huán)節(jié)和步驟提前做好實驗準備。
本實驗需要作好三項實驗準備:
2、一是提前配制各種母液;二是提前準備MS培養(yǎng)基;三是選擇外植體并實行預處理。
1.1 配制母液
母液中含有大量元素、微量元素、激素(植物生物調(diào)節(jié)劑)和維生素等有機成分,母液濃度是實際溶液濃度的5~10倍。配制母液花費時間多,需要用到溶量瓶、移液管等精密儀器,無法由每位學生親自操作,教師可帶領部分學生在課外實行。母液的類型和配制順序如下:
配制母液的注意事項:⑴自來水或河水中含有大量的礦質元素,勿用配制母液;⑵配制大量元素和微量元素母液時,應將每種化合物單獨溶解后,再一一混合,同時還應用適量的蒸餾水清洗燒杯內(nèi)壁,并將清洗后的蒸餾水倒入混合溶液中,這樣能夠保證每種元素的濃度,混合時
3、要按照教材附表中的順序實行,最后加入的是氯化鈣溶液,這樣能夠避免發(fā)生沉淀;⑶配制好的母液要先倒入1 000 ml燒杯中,再由燒杯轉入1 000 ml細口瓶中,不可由容量瓶直接倒入細口瓶中;⑷注意觀察母液中是否有絮狀物,出現(xiàn)絮狀物表明離子之間發(fā)生反應,需要重新配制母液;⑸植物生長調(diào)節(jié)劑難溶于水,需要堿或酸助溶,一般生長素類物質用堿(0.1 mol/LNaOH1~3 ml)或酒精(75~95%的酒精1~3ml)助溶,細胞分裂素類物質一般用酸(0.1 mol/LHCL1~3 ml)助溶,加入蒸餾水定溶時要緩慢,也可用水浴法助溶;⑹用棕色細口瓶盛裝有機物母液和植物生長調(diào)節(jié)劑母液,避免透射光損害母液中的
4、有機成分;⑺在瓶壁上貼好各種母液的標簽(下圖所示);⑻將配制好的母液放入冰箱中或陰涼處保存。
MS是穆拉希吉(Murashige)和斯庫克(Skoog)兩位科學家第一個字母的縮寫,他們于1962年為培養(yǎng)煙草而設計了一種培養(yǎng)基,這就是組培使用中最為廣泛的MS培養(yǎng)基;標簽中間一行的數(shù)字及單位表示的意義如下,例如,100ml/L,即配制1升培養(yǎng)基只需從母液中提取100ml即可;50mg/100ml,表明100ml母液中含有50mg萘乙酸,如取4mg的萘乙酸,只需提取8ml母液。
除母液需提前配制好外,消毒液也需要提前配制好。外植體消毒一般采用75%的酒精、2~10%的次氯
5、酸鈉溶液等。
1.2 培養(yǎng)基的配制與滅菌
培養(yǎng)基的類型有很多種,通常采用MS培養(yǎng)基。配制培養(yǎng)基的流程如下:
上述的培養(yǎng)基配制流程中,加入各種母液的時間是在瓊脂溶化之后,這樣既可避免加熱使母液中的各種離子發(fā)生反應,又可避免有機物母液和植物生長調(diào)節(jié)劑因高溫受到損害。將母液加入培養(yǎng)基的順序是:先提取大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物母液,后提取植物生長調(diào)節(jié)劑母液,切勿先提取植物生長調(diào)節(jié)劑母液,這是因為該溶液中含有酸或堿,容易與其他元素形成沉淀而失敗。
培養(yǎng)基通常采用高壓蒸
6、汽滅菌,滅菌時間一般為15~20min,滅好菌的培養(yǎng)基不易保存過長時間,通常是現(xiàn)用現(xiàn)配。在對培養(yǎng)基滅菌的同時,也要對解剖刀、鑷子、燒杯、錐形瓶、牛皮紙等必要的儀器設備實行滅菌。
1.3 外植體的選擇和預處理
根據(jù)植物細胞的全能性原理,選擇任何活的植物體都能培養(yǎng)出組培苗,但不同植物的各種組織和器官的分裂水平不同,同時還要考慮消毒處理的特殊情況,所以,選擇恰當?shù)耐庵搀w實行接種既有利于消毒,避免污染,又有利于在較短時間內(nèi)形成組培苗,從而提升組培成功率。下面是選擇外植體時需要考慮的一些因素及說明。
考慮的因素
說 明
7、外植體的年齡
一般情況外植體的年齡越小,分化的水準越小,組培的成功率就越高,所以,盡量選擇幼嫩的植物組織或器官作為外植體
外植體的大小
外植體很小和很大都不合適,很小的外植體極容易死亡,很大的外植體不容易消毒,所以,要選擇大小適中的外植體。例如,如果用菊花的芽實行組培,選擇的芽可為3mm左右
外植體所在的部位
一般選擇植物的芽尖、根尖或幼嫩的莖作為外植體,這些部位的組織分裂水平強,容易形成愈傷組織
外植體的外觀形態(tài)
因為外植體的消毒工作非常重要,所以,要選擇哪些表面相對光滑容易消毒的外植體較好
選擇好外植體后教師還要做一些預處理,以便學生進一步消毒時能有效地殺死外植體表面的微生
8、物。預處理包括:用清水沖洗;用洗滌靈或洗衣粉清洗;芽作為外植體時要放在錐形瓶中加清水反復振蕩,如果芽中有很多凹陷,還需要用毛刷輕刷;用自來水細流沖洗2~4小時左右。組培室要進行紫外線消毒,或用化學藥劑如甲醛和高錳酸鉀進行蒸汽消毒。操作臺、接種器械、工作服等都要提前進行消毒,等等。
2 教學建議
2.1 重視實驗原理的學習,幫助學生形成網(wǎng)絡化的知識結構
組培的原理及過程是教學中的重點,對于學生理解組培在生產(chǎn)實踐中的重要性具有十分積極的現(xiàn)實意義,同時,有助于學生理解生命的本質,以及人類對生命現(xiàn)象進行干預的意義。組培的原理、過程及作用可用下面的圖示表示。
9、;為幫助學生理解組培的原理、操作和過程,教學時可引導學生討論下列問題:⑴滅菌和消毒的區(qū)別以及在組培中是如何應用的?⑵在脫分化和再分化過程中怎樣使用植物生長調(diào)節(jié)劑? ⑶組培過程中有時需要換瓶操作,這是為什么(改變培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度比例)? ⑷組培過程中的每一步都需要光照嗎(愈傷組織的形成不一定需要光照,但叢芽和根的形成需要光照)?⑸組培中用的蔗糖作為能源和原料物質,用葡萄糖行不行(使用蔗糖主要是考慮經(jīng)濟因素,也可用葡萄糖或果糖替代)?⑹花藥離體培養(yǎng)獲得的植物幼苗都是單倍體嗎(不是,也有正常的植物體)?等等。
2.2 合理安排時間,確保學生動手操作關鍵的步驟
既然我們不
10、可能讓每一位學生都經(jīng)歷組培的全過程,但又要讓學生實踐操作,因此,選擇什么樣的操作環(huán)節(jié)讓學生實踐就顯得尤為重要。以下的幾種方案供參考和借鑒。
方案1:學生完成外植物體的消毒和接種工作。外植體的消毒工作至關重要,需要那些操作認真、細致的學生才能夠很好地完成,因此這種方案要求學生具備一定的操作技能,并且做到耐心、細致。外植體的消毒流程如下。
上述流程中,酒精起到表面消毒的作用,次氯酸鈉溶液的消毒作用更強。這兩種消毒劑的使用時間可根據(jù)外植體的種類決定,一般而言,芽尖等相對幼嫩的組織消毒的時間要短些,而莖、根的消毒時間可用時長一些??偟脑瓌t是,既要殺滅外植體表面的全部微生物,又要避免損害和殺死外植體
11、本身。除上述的消毒劑外,過氧化氫溶液(10%,5~15min)和氯化汞溶液(0.1~0.5%,2~7min)也是極好的消毒劑。通過以上操作學生能體會到無菌對于組織培養(yǎng)成功的重要作用,從而提高他們的實驗操作技能、嚴謹認真的科學精神和態(tài)度。
方案2:學生完成愈傷組織的繼代培養(yǎng)或分化換瓶。由于減少了外植體消毒這一重要的環(huán)節(jié),操作相對簡單,成功率很高,學生容易獲得成功的滿足感。因此,這種方案是針對那些實踐操作能力一般的學生而設置的。一方面可以讓學生體驗組培接種的操作過程,另一方面保證了實驗的成功率,節(jié)約了實驗時間。
方案3:探討植物生長調(diào)節(jié)劑的不同濃度對組培的影響。為強凋不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑在
12、誘導愈傷組織分化形成叢芽或生根中的作用,可配制植物生長調(diào)節(jié)劑不同濃度的培養(yǎng)基,然后讓學生根據(jù)自己的意愿選擇這些培養(yǎng)基進行換瓶操作。當學生看到植物生長調(diào)節(jié)劑的神奇作用時,一定能夠深刻地理解激素對植物生長的重要作用,從而激發(fā)學生濃厚的探究興趣。下表為組培中常用的植物生長調(diào)節(jié)劑的類型及作用。
調(diào)節(jié)劑
名稱
濃度范圍
作用
生長素類
2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)等
0.01~5mg/L
促進細胞的伸長和分裂,促進愈傷組織和根的形成
細胞分裂素類
激動素(KT)、6-芐基腺嘌呤(BA或6-BA)、玉米素(ZT)等
0.5~10
13、mg/L
促進細胞的橫向生長和分裂,促進芽的分化和形成
誘導外植體形成不定芽時,一般用細胞分裂素類物質的濃度較高,生長素類物質的濃度較低;如果這兩類物質的濃度相同,則有利于形成愈傷組織;如果其比值小于1,則有利于生根。教學中可選擇不同的配比濃度,探討哪種配比濃度更有利于芽的形成,哪種配比濃度更有利于根的形成。
2.3 成立課外活動小組,培養(yǎng)學生中的積極分子
組培實驗的操作繁多而復雜,需要教師提前做好大量的準備工作,因此,成立活動小組,培養(yǎng)學生中的積極分子十分重要?;顒有〗M主要完成以下工作:(1)幫助老師完成實驗室的前期準備,如各種母液的配制、各種培養(yǎng)基的配制和滅菌,等等;(2)做好接種的示范操作,并拍成錄像,提供給其他學生借鑒;(3)接種后的觀察和記錄;(4)進行繼代培養(yǎng)和分化轉瓶;(5)幼苗的移栽及管理;(6)進行課題延伸項目的研究,等等。