《血紅蛋白的提取和分離》學(xué)案

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1、精品文檔，僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除 《血紅蛋白的提取和分離》學(xué)案 張建尚 江蘇省贛榆高級(jí)中學(xué) 【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 1.嘗試對(duì)血液中血紅蛋白的提取和分離，體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過(guò)程和方法。 2.了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。 【重點(diǎn)和難點(diǎn)】 重點(diǎn): 凝膠色譜法的原理和方法。 難點(diǎn): 樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。 【課前預(yù)習(xí)】 1.不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量 ① 的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程 ② ，移動(dòng)速度 ③ ，而相對(duì)分子質(zhì)量 ④ 的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在

2、 ⑤ 移動(dòng)，路程 ⑥ ，移動(dòng)速度 ⑦ ，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。 1.①較?、谳^長(zhǎng)③較慢④較大⑤凝膠外部⑥較短⑦較快 2.在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液抵制外界的????①?? 對(duì)溶液pH的影響，維持pH??②?? 。電泳是利用了待分離樣品中各種分子 ③ 以及分子本身的 ④ 、 ⑤ 的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的 ⑥ ，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 2.①酸或堿②基本不變③帶電性質(zhì)的差異④大?、菪螤睥捱w移速度 3.采用?? ?①??? 的方法分離紅細(xì)胞。紅細(xì)胞洗滌的目的是?? ?②? ??，以利于后

3、續(xù)步驟的分離純化。在洗滌好的紅細(xì)胞中加入??????③??? ，充分?jǐn)嚢韬蠹t細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。血紅蛋白溶液經(jīng)離心后，明顯分為4層，從上到下的主要成分分別是?? ?? ④???? ??????? 。對(duì)血紅蛋白溶液進(jìn)行透析的目的是去除?? ⑤??? ?。 3.①低速短離心②去除雜蛋白③蒸餾水和甲苯④甲苯、脂溶性物質(zhì)、血紅蛋白和沉淀物⑤分子量較小的雜質(zhì) 4.制作凝膠色譜柱的材料有??? ① ?????????????。 裝填凝膠色譜柱的材料是??? ②???，裝填時(shí)要???③?

4、??緩慢倒人色譜柱內(nèi)，不能有??④? 存在。裝填完后，用20mmol/L的 ⑤ 充分洗滌平衡凝膠12h。加樣時(shí)用吸管小心地將1mL透析后的樣品加到?? ⑥? ? 的頂端，注意不要破壞????⑦??? 。 4.①玻璃管、橡皮塞、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)②凝膠③一次性④氣泡⑤磷酸緩沖液⑥凝膠色譜柱的頂端⑦凝膠面 【課堂探究】 一、基礎(chǔ)知識(shí) 1.下圖是凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理，據(jù)圖分析： 凝膠顆粒 蛋白質(zhì)a 蛋白質(zhì)b A （1） （2） （3） （4） （5） B 多孔板 （1）圖A中蛋白質(zhì)a能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而蛋白質(zhì)b被排阻在

5、凝膠顆粒外面的原因是 ① 。所以蛋白質(zhì) ② 在圖B中的路程就短，移動(dòng)速度 ③ ，當(dāng)它從凝膠柱中洗脫出來(lái)時(shí)，蛋白質(zhì) ④ 還在行進(jìn)中。 （2）除了上述原理外，還可以利用哪些原理分離蛋白質(zhì)？ ① 。 一、1.（1）①蛋白質(zhì)a的相對(duì)分子質(zhì)量較小，蛋白質(zhì)b的相對(duì)分子質(zhì)量較大②b③較快④a（2）①蛋白質(zhì)的形狀、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力 2.人體血漿中的H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等的作用是

6、① ，體內(nèi)細(xì)胞或物質(zhì)在體外是否需要與體內(nèi)一樣的環(huán)境條件才能保持原有的生物活性？ ② 。怎樣使其保持與體內(nèi)一樣的酸堿度呢？ ③ 。 2.①緩沖酸和堿對(duì)血漿pH的影響，維持血漿pH基本不變②是③利用配制的緩沖溶液模擬體內(nèi)的pH環(huán)境 3.電泳時(shí)，帶正電和負(fù)電的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移方向是 ① ；若蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)和數(shù)量相同，但蛋白質(zhì)的分子大小不同，則蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移情況是 ② 。葉綠體色素分離使用的支持物是

7、 ③ ，電泳分離蛋白質(zhì)使用的支持物是 ④ 。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的遷移率完全取決于 ⑤ 。 3.①帶正電的蛋白質(zhì)向陰極遷移，帶負(fù)電的蛋白質(zhì)向陽(yáng)極遷移②向同一極遷移，但分子大遷移慢，分子小的遷移快③濾紙④凝膠⑤分子的大小 二、實(shí)驗(yàn)操作 1.分析與樣品處理有關(guān)的問(wèn)題： ① ② ③ ④ （1）分離紅細(xì)胞離心速度不能過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的原因是 ① 。洗滌紅細(xì)胞的目的是 ② 。用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞的原因是

8、 ③ 。洗滌次數(shù)不能過(guò)少的原因是 ④ 。洗滌成功的標(biāo)志是 ⑤ 。 （2）在紅細(xì)胞液中加入蒸餾水的目的是 ① ，甲苯的作用是 ② ，充分?jǐn)嚢璧哪康氖? ③ 。 透析袋 A B （3）將血紅蛋白從混合液中分離出來(lái)所使用的方法是 ① 。右圖是分離結(jié)果示意圖，圖中①②③④的物理性質(zhì)分別是 ② ，主要成分分別是

9、 ③ 。將血紅蛋白從中分離出來(lái)要經(jīng)過(guò) ④ 過(guò)濾和 ⑤ 分離兩步。 （4）右圖裝置用于 ① ，其目的是 ② 。若B是血紅蛋白溶液，則A是 ③ 。 1.（1）①離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離效果②去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化③生理鹽水是等滲溶液，能夠維持紅細(xì)胞正常的形態(tài)④洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法除去血漿蛋白⑤上清液中沒(méi)有黃色（2）①讓紅細(xì)胞吸水脹破②瓦解細(xì)胞膜③加速紅細(xì)胞破裂（3）①離心②無(wú)色透明液體、白色薄層固

10、體、紅色透明液體、暗紅色沉淀物③甲苯、脂溶性物質(zhì)、血紅蛋白、紅細(xì)胞破碎物④濾紙⑤分液漏斗（4）①血紅蛋白的粗分離②除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)③20mol/L的磷酸緩沖液 打孔 安裝 玻璃管 挖出凹穴 a b c d e f 2.以下是凝膠色譜柱的制作過(guò)程圖解，正確的順序是 ① 。 2.①aebdcf 3.右圖是裝填的凝膠色譜柱，據(jù)圖分析： a SephadexG-75 （1）圖中“G”表示 ① ，75表示

11、 ② 。加入前需放在洗脫液中膨脹，為了加速膨脹，可用沸水浴加熱，這樣不但可以節(jié)約時(shí)間，而且可以 ③ 。 （2）裝填凝膠時(shí)要先打開(kāi)[a ] ① ，然后一次性倒入并輕輕敲動(dòng)色譜柱，目的是 ② 。裝填過(guò)程中若發(fā)現(xiàn)有氣泡存在，必須重裝，因?yàn)闅馀輹?huì) ③ ，降低分離效果。 （3）裝填完后，為了使凝膠裝填緊密，還需使用 ① 充分洗滌平衡凝膠12h。該過(guò)程中出現(xiàn)何種現(xiàn)象需要重新裝填凝膠色譜柱？ 3.（1）①凝膠的交聯(lián)程

12、度，膨脹程度及分離范圍②凝膠得水值③除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)的空氣（2）①螺旋夾②使凝膠裝填均勻③攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序（3）①20mmol/L的磷酸緩沖液②洗脫液流干，露出凝膠顆粒 a b c d 樣品 樣品 A B 操作壓 e 4.下圖A是樣品的加入示意圖，圖B是洗脫示意圖。 （1）加樣前需先讓凝膠面上的緩沖液下降至與凝膠面平齊，操作方法是 ① 。加樣時(shí)正確的操作次序是 ② 。 （2）洗脫

13、液e是 ① ，洗脫時(shí)要打開(kāi) ② ，待 ③ 接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液。 （3）如何確定色譜柱的制作是成功的？ ① 。 5.（1）①打開(kāi)色譜柱下端的流出口②bcad（2）①20mmol/L的磷酸緩沖液②色譜柱下端的流出口③紅色的蛋白質(zhì)（1）①紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng) 【課堂鞏固】 1.下列有關(guān)血紅蛋白提取和分離實(shí)驗(yàn)的敘述錯(cuò)誤的是（ ） A.樣品的處理就是通過(guò)一系列操作收集到血紅蛋白溶液 B.通過(guò)透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取 C.通過(guò)凝膠色譜法

14、可除去雜質(zhì)蛋白，即樣品的純化 D.可通過(guò)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度 1.B 【解析】血紅蛋白提取和分離的程序可以分為四大步，即樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，此為樣品的處理，A項(xiàng)正確；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，此為樣品的粗分離，B項(xiàng)錯(cuò)誤；通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大于或小于血紅蛋白的雜質(zhì)蛋白除去，此為樣品的純化，C項(xiàng)正確；經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定，D項(xiàng)正確。 a c b d ○ ○ ○○ ○··· ○·○ ··· 2.

15、凝膠色譜法是一種快速而又簡(jiǎn)單的分離技術(shù)，請(qǐng)據(jù)圖回答相關(guān)問(wèn)題： （1）a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來(lái)的是 ，原因是 。 （2）自己制作凝膠色譜柱時(shí)，在色譜柱底部d位置相當(dāng)于多孔板的結(jié)構(gòu)可由 替代。 （3）凝膠色譜柱的直徑大小會(huì)影響分離的效果嗎? 。圖中a和b的分離度與凝膠色譜柱的高度有關(guān)嗎? 。 （4）在哪些情況下需要重裝凝膠色譜柱？ 。 （5）洗

16、脫用的液體應(yīng)盡量與浸泡凝膠所用的液體???????? ?(填“相同”或“不同”)，洗脫時(shí)，對(duì)洗脫液的流速要求是?????????????????? 。 （6）對(duì)樣品進(jìn)行粗分離的方法是 ，純化的方法是 。判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純化的鑒定。在鑒定的方法中使用最多的是 凝膠電泳。 2.（1）a；a相對(duì)分子質(zhì)量大，無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快（2）尼龍網(wǎng)和尼龍紗（3）不影響（4）有關(guān)（4）產(chǎn)生氣泡、洗脫液流干，露出凝膠顆粒（5）相同；保持穩(wěn)定（6）透析；凝膠色譜法；SDS-聚丙烯酰胺 【精品文檔】第 3 頁(yè)