基因工程 復(fù)習(xí)總結(jié)

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1、總結(jié) 第一章 1. 簡述基因操作、基因重組和基因工程的關(guān)系。 基因操作: 對(duì)基因進(jìn)行分離、分析、改造、檢測、表達(dá)、重組和轉(zhuǎn)移等操作的總稱。 基因工程:專指為實(shí)踐應(yīng)用而進(jìn)行的基因重組事件，產(chǎn)生的基因工程體可以用作生物反應(yīng)器，或改變了生物性狀的工程體等。 基因工程（基因操作）：主要是利用DNA 重組技術(shù)，將生物的某個(gè)基因或一個(gè)DNA片段通過基因載體（DNA載體）運(yùn)送到另一生物的活性細(xì)胞中，然后經(jīng)過克?。╟lone）和行使正常功能（表達(dá)），從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學(xué)分子技術(shù)（從細(xì)菌到高等生物）。 2. 為什么說基因工程是生物學(xué)和遺傳學(xué)發(fā)展的必然產(chǎn)物？ （1）基因的提出與基因和D

2、NA關(guān)系的建立，為基因重組打下物質(zhì)基礎(chǔ) （2）DNA結(jié)構(gòu)的闡明和DNA在生命活動(dòng)中作用的認(rèn)識(shí)，為基因操作打下了理論基礎(chǔ) （3）基因操作技術(shù)的發(fā)展直接導(dǎo)致基因工程的誕生和發(fā)展 （4）人們研究的熱情和對(duì)基因工程產(chǎn)品的迫切需求，進(jìn)一步推動(dòng)了基因工程的快速發(fā)展 3. 簡述基因的結(jié)構(gòu)組成對(duì)基因操作的影響。 (1)．基因及其產(chǎn)物的共線性 (2)．基因及其產(chǎn)物的非共線性 (3)．基因的重疊與基因的可變性 (4)．啟動(dòng)子和終止子 4. 重組DNA技術(shù)包括哪些步驟 分---分離制備目的基因 切---切割目的基因和載體 接---目的基因與載體連接 轉(zhuǎn)---將重組DNA

3、導(dǎo)入宿主細(xì)胞 篩---篩選并檢定含有重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆 表---克隆基因在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與表達(dá) 5. 基因工程的流程 目的基因的分離制備→與載體體外重組→遺傳轉(zhuǎn)化→轉(zhuǎn)化子篩選→提取目的基因→測序 ↓ 獲得優(yōu)良品種 ←表達(dá)特定蛋白產(chǎn)物←導(dǎo)入宿主細(xì)胞←將目的基因克隆到表達(dá)載體 6.基因工程中所用酶類及作用特點(diǎn) (1)限制性核酸內(nèi)切酶：在DNA分子內(nèi)部的特異性的堿基序列內(nèi)部進(jìn)行切割 (2)DNA連接酶：將兩條以上的線性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯鍵連接成一個(gè)整體

4、(3)DNA聚合酶I：通過向3’端逐一增加核苷酸以填補(bǔ)雙鏈DNA分子上的單鏈裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性與3’→5’及5’→3’外切酶活性 (4) Klenow DNA聚合酶:是從全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影響。 (5)反轉(zhuǎn)錄酶:以RNA或DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的cDNA鏈 (6)DNA末端轉(zhuǎn)移酶:將寡聚物尾巴加到了線性雙鏈或單鏈DNA分子的3’－OH末端或DNA的3’－末端 (7)堿性磷酸酶:去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基團(tuán) (8)降解酶S1:降解單鏈DNA或RNA,產(chǎn)生帶5’磷酸的單核苷酸或寡聚核苷酸，同時(shí)

5、也可切割雙鏈核酸分子的單鏈 (9)Taq DNA 聚合酶：能在高溫（72℃）下以單鏈DNA為模板，從5’→3’方向合成新的互補(bǔ)鏈。 （10）多核苷酸激酶：催化將把一個(gè)磷酸分子加到多核苷酸鏈的5’－OH末端上 （11）核酸外切酶III:降解DNA3’－OH末端的核苷酸殘基 （12）脫氧核糖核酸酶：內(nèi)切核酸酶，水解單鏈或雙鏈DNA 7. 常用的目的基因的獲取方法 構(gòu)建基因組文庫；構(gòu)建cDNA文庫；人工合成DNA技術(shù)；PCR擴(kuò)增 8. 堿裂解法提取質(zhì)粒原理 高pH使質(zhì)粒DNA和染色體DNA變性，同時(shí)沉淀蛋白質(zhì)。再將pH值調(diào)至中性，質(zhì)粒DNA較小，很容易復(fù)性成雙鏈。而染色體DNA較大

6、，不會(huì)復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀不溶物質(zhì)，從而可以通過離心除去。 9. 常用的目的基因與載體的連接方法 （1）黏性末端連接：將靶基因DNA片段和載體DNA經(jīng)過相同的限制酶進(jìn)行切割，使他們兩端產(chǎn)生相同的黏性末端，然后經(jīng)黏性末端堿基配對(duì)和DNA連接酶的作用，共價(jià)連接成為新的重組DNA分子。 （2）平頭末端連接:將平末端的DNA分子在T4連接酶的作用下，催化DNA5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵相互連接。 （3）人工接頭法：利用人工接頭加在平端的DNA片段的兩端，然后用相應(yīng)的限制酶切割人工接頭以產(chǎn)生黏性末端，再與帶有相同黏性末端的載體進(jìn)行連接。 （4）同源多聚尾連接法：在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催

7、化下，在線性載體分子的兩端加上單一核苷酸如dG組成的多聚尾，而在目的基因的分子兩端加上dC多聚尾，兩者混合退火，然后經(jīng)DNA聚合酶I或) Klenow DNA聚合酶填補(bǔ)裂口處缺失的核苷酸，再通過DNA連接酶修復(fù)成環(huán)狀的雙鏈DNA。 第二章 1. 什么是細(xì)菌的限制－修飾系統(tǒng)，其功能是什么？ 細(xì)胞中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異性甲基化酶，即細(xì)胞中有限制—修飾系統(tǒng)(R-MRestriction-modification system)。R-M系統(tǒng)是細(xì)菌安內(nèi)御外的積極措施。 限制作用就是限制酶降解外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定性的機(jī)制。 甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤A 成為N6 甲基-腺膘

8、呤，胞嘧啶C 成為5‘ 甲基胞 嘧啶。修飾作用是通過甲基化酶來的甲基化作用，是宿主細(xì)胞能識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的機(jī)制。 2. 說明限制性內(nèi)切核酸酶命名原則（舉例）。 3. 限制內(nèi)切核酸酶的星活性是指什么？ 星星活性（star activity）:在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星星活性。星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn)。 4. T4 DNA ligase 和E.coli ligase 有什么異同？ 同：(1)催化DNA5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵。 (2)反應(yīng)底物為粘

9、端、切口、平端的RNA或DNA。 (3)低濃度的聚乙二醇PEG（一般為10%）和單價(jià)陽離子（150-200 mM NaCl）可以提高平端連接速率。 (4)連接反應(yīng)需要ATP.若在16℃反應(yīng)，大約需4小時(shí)；若在4℃反應(yīng)，則需反應(yīng)過夜。 不同：E.coli ligase需NAD+參與，且其平端連接效率低，常用于置換合成法合成cDNA。作cDNA克隆時(shí)，不會(huì)將RNA連接到DNA，不連接RNA。 5. 連接酶的反應(yīng)溫度如何選擇，為什么？ 連接酶最適的反應(yīng)溫度應(yīng)是37℃。但在這一溫度下粘性末端的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定，溫度過高，雖然酶反應(yīng)速度快，但是連接-斷開是雙向的，動(dòng)態(tài)平衡，可能由于熱運(yùn)動(dòng)的關(guān)系，

10、斷開速度也快，溫度過低，連接速度太慢。4度過夜也是有很高的連接效率。因此連接反應(yīng)常采用的最佳溫度一般在4-16℃間，通常多選用12-16℃ 30分鐘到16小時(shí)。 6. 什么是Klenow酶？有什么作用？ Klenow DNA聚合酶:是從全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影響。也稱為Klenow片段（Klenow frgment），或E.coli DNA聚合酶Ⅰ大片段（E.coli DNA polymeraseⅠlargefragment）。 Klenow DNA聚合酶作用 ① 補(bǔ)平3′凹端，如果使用帶標(biāo)記的dNTP，則可對(duì)DNA進(jìn)行末端

11、標(biāo)記。 ② 抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性 ③ 通過置換反應(yīng)對(duì)DNA進(jìn)行末端標(biāo)記 ④ 在cDNA克隆中合成第二鏈 ⑤ 隨機(jī)引物標(biāo)記 ⑥ 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA 7. 分子克隆的基本流程 8. 什么是限制性內(nèi)切酶？可劃為哪幾個(gè)類型？識(shí)別序列有結(jié)構(gòu)特點(diǎn)？ 限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的一類能夠特異性識(shí)別雙鏈DNA的特定堿基序列，并且能在識(shí)別位點(diǎn)切割磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。 限制酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)序列的長度一般為4-8個(gè)堿基，最常見的為6個(gè)堿基，且具有回文序列的DNA片段，主要產(chǎn)生5'、3'突出的黏性末端或平末端。當(dāng)一個(gè)樣本DNA被一個(gè)特定的限

12、制酶切割后，可以產(chǎn)生一批相同的堿基序列的DNA片段，進(jìn)而可以被用于基因重組、克隆、核酸分子雜交和序列分析等。 10. 簡述質(zhì)粒的基本性質(zhì)？ （1）質(zhì)粒的復(fù)制：質(zhì)粒含有復(fù)制起始區(qū)和復(fù)制調(diào)控原件?？蓪?shí)現(xiàn)自主復(fù)制 （2）質(zhì)粒的拷貝數(shù)：質(zhì)粒分為嚴(yán)謹(jǐn)性和松弛型，因而拷貝數(shù)不同 （3）質(zhì)粒的不相容性：兩個(gè)質(zhì)粒不能共存于同一個(gè)宿主細(xì)胞 （4）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性：通過細(xì)菌的接合作用，質(zhì)粒可以被轉(zhuǎn)移到新宿主細(xì)胞中 11. DNA聚合酶有哪些種類？各有什么活性？ 大腸桿菌DNA聚合酶I: 5‘--3’ DNA 聚合酶活性 5‘--3' DNA外切核酸酶活性 3'--5' DNA外切酶活性 Klenow酶

13、:5‘--3’ DNA 聚合酶活性 3'--5' DNA外切酶活性 T4 DNA聚合酶:3’-5’DNA外切酶活性 T7 DNA聚合酶:5‘--3’ DNA 聚合酶活性 3'--5' DNA外切酶活性（強(qiáng)） 反轉(zhuǎn)錄酶:5’→3’ DNA聚合酶活性5‘--3' RNA外切核酸酶活性 3'--5'RNA外切酶活性 12. 什么是重組子篩選？有哪些方法？ 重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞后，檢測目的基因是否表達(dá)的第一個(gè)步驟就是篩選。 方法：（1）抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法 （2）b-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 第三章 1. 作為一個(gè)最基本的載體，它必須具備哪些功能元件？ (1

14、) 具有復(fù)制起點(diǎn)，可在宿主細(xì)胞中進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制。 (2) 具有抗菌素抗性基因，便于篩選。 (3) 具若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)，可以進(jìn)行特異性酶切。 (4) 具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)，便于制備。 2. 何為α-互補(bǔ)，其基本原理是什么？在載體構(gòu)建中有何作用？ α-互補(bǔ)（α-complementation）：是指lacZ基因上缺失近操作子基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操作子基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶基因的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。 α-互補(bǔ)是基于在兩個(gè)不同的缺陷β-半乳糖苷酶之間可實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)而建立的。 在lacZ ’ 編碼區(qū)上游插入一小段DNA 片段（如51 個(gè)堿基對(duì)的多克隆位點(diǎn)），不影響

15、β-半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補(bǔ)。若在該DNA 小片段中再插入一個(gè)大片段，導(dǎo)致產(chǎn)生無α-互補(bǔ)能力的β-半乳糖苷酶片段。利用這一互補(bǔ)性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。 3. 藍(lán)白斑篩選的原理 大腸桿菌的乳糖lac 操縱子中的lacZ 基因編碼β-半乳糖苷酶。 lacZ△M15 基因是編碼缺失了β-半乳糖苷酶中第11-41 個(gè)氨基酸的lacZ 基因無酶學(xué)活性。對(duì)于只編碼N-端140 個(gè)氨基酸的lacZ 基因（稱為lacZ′) ，其產(chǎn)物也沒有酶學(xué)活性。 這兩個(gè)無酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時(shí)，可恢復(fù)β-半乳糖苷酶的活性，實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)。在lacZ ’ 編碼區(qū)上游插入一小段DNA 片段（

16、如51 個(gè)堿基對(duì)的多克隆位點(diǎn)），不影響β-半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補(bǔ)。 若在該DNA 小片段中再插入一個(gè)大片段，導(dǎo)致產(chǎn)生無α-互補(bǔ)能力的β-半乳糖苷酶片段。 利用這一互補(bǔ)性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。 在相應(yīng)的載體系統(tǒng)中，lacZ△M15 放在F 質(zhì)粒上,隨宿主傳代； lacZ ’放在載體上, 作為篩選標(biāo)記。 4. 絲狀噬菌體載體克隆中經(jīng)常遇到哪些問題？ (1)較大的外源DNA片段被克隆以后，在噬菌體擴(kuò)增過程中往往不穩(wěn)定，很容易發(fā)生缺失的現(xiàn)象，這可能是由于感染較短的噬菌體比長的噬菌體更具競爭優(yōu)勢(shì)所致。 (2)單鏈載體分子感染的細(xì)胞中往往單雙鏈混雜，純化某種類型的分子

17、(尤其是雙鏈分子)比較費(fèi)力，同時(shí)由于重組DNA容易產(chǎn)生缺失，培養(yǎng)時(shí)間不能長，故所得DNA的量有限。 (3)重組中，經(jīng)常出現(xiàn)一些能以兩種可能方向插入的載體卻僅以一種特定方向插入外源DNA片段的情況，這是因?yàn)橥庠碊NA反向鏈的序列，在不同程度上干擾了載體基因間區(qū)域的功能所致。 5. 解釋下列名詞: 基因工程載體：將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞(host cell)的工具.載體是基因工程技術(shù)的核心細(xì)菌的質(zhì)粒、酵母的質(zhì)粒、噬菌體、病毒DNA的衍生物等，經(jīng)過改造都可以成為載體。 插入失活：通過插入失活進(jìn)行篩選的質(zhì)粒主要有pBR322 ，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因

18、（ampr）兩種抗性標(biāo)記。當(dāng)外源DNA 片段插入tetr 基因后，導(dǎo)致tetr 基tet tet 因失活，變成只對(duì)氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過對(duì)抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。 琥珀突變：在基因的編碼區(qū)中，若某個(gè)密碼子發(fā)生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的突變?yōu)轸魇蛔儯ㄍ蛔優(yōu)閁AA），或琥珀突變（突變?yōu)閁AG），或乳白突變（突變?yōu)閁GA）。 噬菌粒: 在質(zhì)粒中插入絲狀噬菌體的主要基因區(qū)域(1.3kb)，構(gòu)成一種特殊的質(zhì)粒載體，其基因區(qū)包括： a.噬菌體DNA合成起始和終止區(qū)。b.絲狀噬菌體顆粒裝配所需的序列c.帶有E.coli的復(fù)制點(diǎn)(ori)，因此可像質(zhì)粒一樣擴(kuò)增

19、。 6.簡述M13KO7輔助噬菌體的遺傳學(xué)特性和生物學(xué)功能？ 遺傳學(xué)特性：基因II基因突變，由G變?yōu)門。突變的基因II產(chǎn)物減弱了與自身攜帶的噬菌體復(fù)制起點(diǎn)的作用。 生物學(xué)功能：當(dāng)與噬菌粒載體共同存在于宿主細(xì)胞時(shí)M13KO7表達(dá)后的基因產(chǎn)物優(yōu)先作用于噬菌粒，使其進(jìn)行單鏈復(fù)制。 第四章 1. 大容量克隆載體有哪些種類，各有何特點(diǎn)？ 黏粒載體（cosmid）；酵母人工染色體載體（YAC）；細(xì)菌人工染色體載體(BAC)； P1噬菌體載體(P1)；P1人工染色體載體(PAC) 2. 簡述黏粒、YAC、BAC克隆載體基本構(gòu)成元件。 黏粒：質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（ColE1）、抗性標(biāo)記（ampr）、c

20、os位點(diǎn)。 YAC：自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒（centromere, CEN）和兩個(gè)端粒（TEL）。 BAC：復(fù)制單元的特殊性:來自F質(zhì)粒，包括嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制區(qū)oriS，啟動(dòng)DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動(dòng)的解旋酶（RepE）以及3個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座（parA、parB和parC）。低拷貝性可以減小外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作用。標(biāo)記基因:氯霉素抗性基因 3. 黏粒載體具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？ 優(yōu)（1）同時(shí)具有λ噬菌體和質(zhì)粒載體的特性 （2）具有高容量的克隆能力

21、 缺（1）兩個(gè)粘粒之間，當(dāng)存在同源序列時(shí)，可能會(huì)發(fā)生重組，結(jié)果使克隆的外源DNA片段重排或丟失。 （2）含不同重組DNA的菌落生長速度不一。當(dāng)柯斯質(zhì)粒文庫復(fù)制擴(kuò)增時(shí)，由于不同的插入片段對(duì)宿主細(xì)胞作用的情況不同，結(jié)果會(huì)出現(xiàn)各種外源DNA片段間的比例失調(diào)。另外不同重組柯斯質(zhì)粒的產(chǎn)量相差懸殊。 （3）包裝蛋白制備過程較復(fù)雜，每批包裝蛋白的包裝效率不穩(wěn)定。而且，購買包裝蛋白的費(fèi)用較高。 5. 簡述P1噬菌體載體的基本構(gòu)成元件。 ⑴ 復(fù)制元件：質(zhì)粒復(fù)制子和裂解性復(fù)制子 ⑵ 環(huán)化和包裝信號(hào)：2個(gè)loxP重組位點(diǎn)和包裝識(shí)別位點(diǎn)pac,用于體外包裝 ⑶ 標(biāo)記基因：kanr;果聚糖蔗糖酶基因sacB

22、，含sacB的大腸桿菌在蔗糖培養(yǎng)基上不能存活，用于插入失活篩選重組子。 ⑷ 克隆位點(diǎn)： sacB內(nèi)部 ⑸ 填充片段：11kb腺病毒，作為填充物彌補(bǔ)外源DNA片段長度。 第五章 1. 以大腸桿菌為例，表達(dá)載體比克隆載體多了哪些功能元件，各有什么生物學(xué)功能？ ⑴ 啟動(dòng)子：轉(zhuǎn)錄是由RNA聚合酶在啟動(dòng)子部位啟動(dòng)RNA轉(zhuǎn)錄的過程。當(dāng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)以后，RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子下游要轉(zhuǎn)錄的序列是無法識(shí)別的，這就為利用強(qiáng)啟動(dòng)子來表達(dá)目的基因提供了可能。 ⑵ 終止子：轉(zhuǎn)錄會(huì)受到模板RNA序列結(jié)構(gòu)的影響，當(dāng)遇到頸環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)轉(zhuǎn)錄便會(huì)停止，或遇到ρ因子介導(dǎo)的終止信號(hào)轉(zhuǎn)錄也會(huì)停止。 ⑶ 核糖體結(jié)合位點(diǎn)： 細(xì)胞中的核

23、糖體必須在mRNA上找到有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）以及其中的Shine-Dalgarno序列（SD序列），從而啟動(dòng)鄰近其下游的翻譯起始密碼子的蛋白質(zhì)翻譯。 2. 簡述表達(dá)載體構(gòu)建的一般原則。 表達(dá)載體實(shí)際上是在克隆載體的基礎(chǔ)上增加了表達(dá)所需的元件，當(dāng)外源基因被接入合適的位點(diǎn)后，在宿主中啟動(dòng)表達(dá)，因此表達(dá)載體的構(gòu)建原則主要體現(xiàn)在表達(dá)元件的選擇和利用。 （1）啟動(dòng)子選擇 A.超量表達(dá)：以獲得最大限度的目的產(chǎn)物，則選擇高強(qiáng)啟動(dòng)子，在適當(dāng)條件下可使外源基因高水平表達(dá)，如大腸桿菌的Plac。 B.使某關(guān)鍵基因表達(dá)：使宿主表現(xiàn)出一種特殊性或啟動(dòng)其他產(chǎn)物合成。可使用基因自身啟動(dòng)子或宿主相關(guān)性狀

24、基因的啟動(dòng)子。 （2）轉(zhuǎn)錄有效性 A.在載體上設(shè)法除去衰減序列或插入轉(zhuǎn)錄終止序列，以防止轉(zhuǎn)錄提前終止。 B.在終止密碼子之后增加終止序列，使轉(zhuǎn)錄確有效終止。 （3）翻譯的有效性 A.選用最佳密碼子AUG B.SD序列相似或相同 C.采用UAA終止密碼子 3. 何為穿梭載體，在遺傳結(jié)構(gòu)上有何特點(diǎn)？ 穿梭載體（shuttle vector）是能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體，如有些載體既能在原核細(xì)胞中復(fù)制又能在真核細(xì)胞中復(fù)制，或能在E.coli中復(fù)制又能在革蘭氏陽性細(xì)菌中復(fù)制。這類載體主要是質(zhì)粒載體。大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體，含有分別來自大腸桿菌和釀酒酵母的復(fù)制起

25、點(diǎn)與選擇標(biāo)記，另有一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)。此類型的載體既可在大腸桿菌細(xì)胞和釀酒酵母細(xì)胞中復(fù)制，可實(shí)現(xiàn)在兩種不同的寄主細(xì)胞之間來回轉(zhuǎn)移基因，并單獨(dú)或同時(shí)在兩種宿主細(xì)胞中研究目的基因的表達(dá)活性及其它的調(diào)節(jié)功能。 4. 將人的某個(gè)基因在大腸桿菌中表達(dá)應(yīng)注意哪些問題？ （1）序列為去掉內(nèi)含子的cDNA序列 （2）要用原核啟動(dòng)子。檢查真核基因密碼子偏好是否存在原核表達(dá)系統(tǒng)的稀有密碼子。稀有密碼子的地方會(huì)成為表達(dá)瓶頸，對(duì)其進(jìn)行點(diǎn)突變。 （3）若單獨(dú)的蛋白無活性，考慮是否統(tǒng)一起到克服分子伴侶的基因 （4）控制表達(dá)條件，盡量不要形成包涵體 5.利用原核細(xì)胞表達(dá)真核基因的難點(diǎn)在哪？ （1）真核基因含有內(nèi)

26、含子序列，原核細(xì)胞中無法切除內(nèi)含子，從而無法表達(dá)蛋白產(chǎn)物。 （2）細(xì)菌的RNA聚合酶無法識(shí)別真核啟動(dòng)子。 （3）表達(dá)出的真核蛋白產(chǎn)物易被細(xì)菌的蛋白酶降解。 （4）在原核細(xì)胞中，真核基因所表達(dá)出的蛋白往往不能進(jìn)行正常的折疊，而形成沒有活性的包涵體。 6.分離純化RNA應(yīng)注意什么？ （1）由于RNA是單鏈，易受到核酸酶的攻擊，應(yīng)盡量避免RNA的降解。 （2）盡量簡化操作步驟，縮短時(shí)間。 （3）防止機(jī)械剪切和高溫對(duì)RNA的傷害，剪切和高溫可能會(huì)導(dǎo)致降解。 （4）維持pH4—10，防止核酸在堿性條件下降解。 7. 簡述PET表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)及工作原理 特點(diǎn)：表達(dá)載體pET-5a是典型

27、的pET載體，含T7噬菌體啟動(dòng)子序列，當(dāng)外源基因插入其下游的幾個(gè)酶切位點(diǎn)后，就可在特定的宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。 （1）T7噬菌體啟動(dòng)子只能由T7噬菌體的RNA聚合酶識(shí)別并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，而大腸桿菌的RNA聚合酶不能作用于T7噬菌體啟動(dòng)子。 （2）用于表達(dá)的宿主細(xì)胞必須能表達(dá)T7噬菌體的RNA聚合酶。 （3）大腸桿菌BL21（DE3）是常用的pET表達(dá)載體的宿主菌，該菌對(duì)T7 RNA聚合酶和目的基因的轉(zhuǎn)錄實(shí)行多層次的調(diào)控。 （4）控制外源基因嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)的2個(gè)系統(tǒng) A.通過宿主控制T7 RNA聚合酶的量來實(shí)現(xiàn)的 在宿主細(xì)胞中引入一個(gè)帶有T7噬菌體的溶菌酶編碼基因的質(zhì)粒，它們表達(dá)T7噬菌體的溶菌酶

28、。該溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性，從而減少在未誘導(dǎo)情況下外源基因的表達(dá)。 B.使啟動(dòng)子的控制效應(yīng)更嚴(yán)謹(jǐn)。 在pET載體上裝載lacⅠ基因，提高阻抑物的濃度。也可利用T7-lac啟動(dòng)子。在當(dāng)阻抑物結(jié)合在lacO位點(diǎn)時(shí)，即使存在T7 RNA聚合酶，外源基因也無法表達(dá)。只有當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，才能解開T7 RNA聚合酶基因和外源基因表達(dá)的雙重阻遏。 工作原理：pET載體進(jìn)入大腸桿菌BL21（DE3）中后，由于宿主細(xì)胞的的lac I基因表達(dá)產(chǎn)生阻遏物，從而抑制T7 RNA聚合酶基因的表達(dá)，在載體上的目的基因也無法表達(dá)，當(dāng)IPTG誘導(dǎo)物加入時(shí)，使阻遏物失去抑制作用，T7 RNA聚合酶基因可以表

29、達(dá)，從而啟動(dòng)T7啟動(dòng)子控制外源基因的表達(dá)。 8.簡述利用T7噬菌體啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)調(diào)控模式。 （1）在表達(dá)載體上使用T7啟動(dòng)子，在宿主細(xì)胞中表達(dá)T7 RNA聚合酶，構(gòu)成了表達(dá)系統(tǒng)。 （2）T7啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性和宿主T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性均受IPTG的誘導(dǎo)、 第八章 1. 簡述PCR擴(kuò)增的原理和過程？如果要擴(kuò)增某基因，需要知道什么信息? 原理：利用生物體內(nèi)DNA的半保留復(fù)制原理。在體外采用變性、退火、延伸過程，以含有目的片段的DNA為模板，根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物，在DNA聚合酶作用下實(shí)現(xiàn)目的基因擴(kuò)增。 目的基因的基本信息：片段大小、序列和堿基特點(diǎn)等。據(jù)此來決定PCR策

30、略。如果是已知序列，可設(shè)計(jì)引物，直接從含有目的基因序列的DNA中擴(kuò)增；知道部分序列的，先PCR獲得該序列，再采用RACE或反向PCR等技術(shù)獲得全長序列。 過程：（1）變性（denaturation）：將模板DNA置于92-96℃，使dsDNA在高溫下解鏈成為ssDNA，且熱變性不改變其化學(xué)性質(zhì) （2）退火（annealing）：將溫度降至37-72℃，使引物與模板的互補(bǔ)區(qū)相結(jié)合 （3）延伸（extension）：在72℃條件下，DNA聚合酶將dNTP連續(xù)加到引物的3‘-OH端，合成DNA。 這三個(gè)熱反應(yīng)過程的重復(fù)稱為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)過20-40個(gè)循環(huán)可擴(kuò)增得到大量位于兩條引物之間序列的DN

31、A片段。 2. T/A克隆的基本原理是什么？ Tap DNA聚合酶有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，可在DNA片段的3’末端添加一個(gè)核苷酸，通常為A。因此，Tap DNA聚合酶擴(kuò)增的產(chǎn)物可與T-載體進(jìn)行黏端互補(bǔ)連接，達(dá)到高效克隆的目的。 3. PCR技術(shù)有哪些應(yīng)用？ 4. PCR引物有哪些基本要求？ ① 長度：至少16 bp，通常為18-30 bp，更短的引物一般會(huì)降低擴(kuò)增的特異性，但會(huì)提高擴(kuò)增的有效性。 ② 解鏈溫度（Tm值）：兩個(gè)引物之間的Tm值差異最好在2-5℃。 ③ 避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補(bǔ)序列（3個(gè)堿基） ④ G＋C含量盡量控制在40%-60%之間，4種堿基的分布應(yīng)盡可能均勻

32、。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及T在3′末端的重復(fù)排列。 ⑤ 引物的3′末端最好是G或C，但不要GC連排。 第九章 1. 簡述化學(xué)降解法測序的基本原理以及主要應(yīng)用范圍。 原理：將待測DNA片段的5‘端磷酸基團(tuán)作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法對(duì)特定堿基進(jìn)行化學(xué)修飾并在該位置打斷核酸鏈，從而產(chǎn)生一系列長度不一且分別以不同堿基結(jié)尾的DNA片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過并列點(diǎn)樣（lane-bylane）的方式用凝膠電泳進(jìn)行分離，再經(jīng)放射自顯影，即可讀出目的DNA的堿基序列。 核心原理:特定化學(xué)試劑可對(duì)不同堿基進(jìn)行特異性修飾并在被修飾的堿基處（5′或3′）打斷磷酸二酯鍵，從而達(dá)

33、到識(shí)別不同堿基種類的目的。 應(yīng)用: Maxam-Gilbert化學(xué)降解測序法不需要進(jìn)行酶催化反應(yīng)，因此不會(huì)產(chǎn)生由于酶催化反應(yīng)而帶來的誤差；對(duì)未經(jīng)克隆的DNA片段可以直接測序?；瘜W(xué)降解測序法特別適用于測定含有如5-甲基腺嘌呤、G＋C含量較高的DNA片段以及短鏈的寡核苷酸片段的序列。 測定長度大約250個(gè)堿基。 2. 簡述Sanger雙脫氧鏈終止法測序的原理。 雙脫氧核苷酸分子的脫氧核糖的3‘位置的-OH缺失，致使下位核苷酸的5‘磷酸基團(tuán)無法與之結(jié)合。一旦雙脫氧核苷酸整合到正在合成的DNA鏈中，該股DNA的合成就到此終止。 第十一章 1. 基因組DNA文庫有哪些類型？其相關(guān)的特點(diǎn)是什么？

34、 ⑴ 質(zhì)粒文庫 質(zhì)粒載體所容納的外源DNA片段一般在10kb以內(nèi)。這類基因組DNA文庫一般應(yīng)用于“鳥槍法”全基因組測序研究和用于構(gòu)建亞克隆文庫或亞基因組文庫。 ⑵ 噬菌體文庫 噬菌體文庫是以細(xì)菌噬菌體基因組衍生的一系列載體系統(tǒng)構(gòu)建的，常用的有l(wèi)噬菌體載體、M13單鏈?zhǔn)删w載體、P1噬菌體載體及由噬菌體衍生的質(zhì)粒載體。 M13載體所容納的外源片段較小，一般用于構(gòu)建cDNA文庫或BAC和PAC亞克隆文庫。 噬菌體文庫中應(yīng)用最廣泛的是l噬菌體。由于其有利于利用分子雜交的方法進(jìn)行篩選，用l噬菌體構(gòu)建的基因組DNA文庫在小基因組物種的基因克隆中起著重要作用。 ⑶ 黏粒文庫 黏粒又稱柯斯質(zhì)粒

35、，是由l噬菌體的cos序列、質(zhì)粒的復(fù)制序列及抗生素抗性基因構(gòu)建而成的一類特殊的質(zhì)粒載體。黏粒載體和噬菌體載體類似，主要用于構(gòu)建小基因組物種的基因組DNA文庫。利用它們?cè)诤Y選上的優(yōu)勢(shì)來分離單個(gè)基因或構(gòu)建一定區(qū)間范圍的亞基因組DNA文庫等。 ⑷ 人工染色體文庫 包括酵母人工染色體文庫、細(xì)菌人工染色體文庫和P1人工染色體文庫，也稱為大片段基因組DNA文庫，容納的外源DNA片段為100 kb-1 Mb。主要用于大基因組物種的基因克隆、物理圖譜構(gòu)建和基因組測序等，在基因組研究中應(yīng)用越來越廣泛。 ⑸ 亞基因組文庫 亞基因組文庫是相對(duì)于基因組文庫提出的，文庫的對(duì)象不是全基因組范圍，而是基因組的某一區(qū)

36、段，如基因組DNA某一特定大小酶切片段的組合、一條染色體或更小的區(qū)段（如一個(gè)YAC或BAC克隆等）。 2. 均一化cDNA文庫構(gòu)建的基本原理是什么？ 兩種方法：基因組DNA飽和雜交法和基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理的均一化方法 基因組DNA飽和雜交法:原理是不同表達(dá)水平的基因?qū)?yīng)的基因組拷貝數(shù)相同 基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理的均一化方法：高豐度cDNA復(fù)性所需時(shí)間短，低豐度cDNA復(fù)性所需時(shí)間長。羥基磷石灰柱可將單鏈與雙鏈DNA分開。 3. 扣除cDNA的基本原理是什么？ 將含目的基因的組織或器官的mRNA群體作為待測樣本（tester），將基因表達(dá)譜相似或相近但不含目的基因的組織或器官的mRNA群體

37、作為對(duì)照樣本（driver）。將tester和driver的cDNA進(jìn)行多次雜交，去掉在二者之間都表達(dá)的基因，而保留兩者之間差異表達(dá)的基因，使低豐度基因在文庫中的比例大大提高，篩選到差異表達(dá)的基因的可能性也大大提高。 4. 如何構(gòu)建全長cDNA文庫 有三種方法：SMART法，cap-trapper法，TAP（煙草酸焦磷酸酶）法 SMART法：利用反轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在第一鏈cDNA3’末端加上幾個(gè)dC。加入帶有幾個(gè)dG的特異性引物,該引物會(huì)與第一鏈互補(bǔ)結(jié)合，再繼續(xù)合成第二鏈。利用接頭錨定的方法提高了全長DNA的比例。 第十三章 1. 植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)具備的條件？ （1）較

38、高的遺傳穩(wěn)定性 （2）具有穩(wěn)定的外植體來源 （3）對(duì)選擇抗生素敏感 （4）對(duì)農(nóng)桿菌有敏感性 （5）是否具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值或有潛在的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值 2. 植物基因工程常用的受體系統(tǒng)有哪些？ (1)愈傷組織再生系統(tǒng) (2)直接分化再生系統(tǒng) (3)原生質(zhì)體再生系統(tǒng) (4)生殖細(xì)胞受體系統(tǒng) 3. 植物基因轉(zhuǎn)化方法有哪些？ (1)原生質(zhì)體介導(dǎo)法: PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化，脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化，電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化， 顯微注射介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化，激光微束介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 (2)基因槍法 (3)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 4. 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的基本原理及分子機(jī)理？ 在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)有一個(gè)大的致瘤質(zhì)粒（t

39、umor inducing plasmid），簡稱Ti質(zhì)粒。 當(dāng)根癌農(nóng)桿菌感染植物的時(shí)候，菌體本身并不進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，而僅是Ti質(zhì)粒中的一部分稱之為“T-DNA”的DNA片段進(jìn)入寄主細(xì)胞并插入基因組中，T-DNA中的基因利用植物的酶系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，其表達(dá)產(chǎn)物可誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。 Ti質(zhì)粒有兩個(gè)區(qū)域：T-DNA區(qū)（是質(zhì)粒上能夠轉(zhuǎn)移整合入植物受體基因組并能在植物細(xì)胞中表達(dá)從而導(dǎo)致冠癭瘤的發(fā)生，且可通過減數(shù)分裂傳遞給子代的區(qū)域）和Vir區(qū)（編碼能夠?qū)崿F(xiàn)T-DNA轉(zhuǎn)移的蛋白）。 Vir區(qū)位于T-DNA以外的一個(gè)35 kb 內(nèi)，其產(chǎn)物對(duì)T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合必不可少。 農(nóng)桿菌侵染植物首先是吸

40、附于植物表面?zhèn)?，受傷植物分泌的酚類小分子化合物可以誘導(dǎo)Vir基因的表達(dá)。Vir產(chǎn)物能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒產(chǎn)生一條新的T-DNA單鏈分子。此單鏈分子從Ti質(zhì)粒上脫離后，可以與Vir產(chǎn)物VIRD 2 蛋白共價(jià)結(jié)合，并在VIRD 4和VIRB等蛋白的幫助下從農(nóng)桿菌進(jìn)入植物細(xì)胞的染色體中。 5. 什么是二元載體？和一元載體比有什么優(yōu)點(diǎn)？ 雙元載體(binary vector)系統(tǒng)是指由兩個(gè)分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng)，也因?yàn)槠銽-DNA與Vir基因在兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒上，通過反式激活T-DNA轉(zhuǎn)移故稱之為反式載體(trans vector) 優(yōu)點(diǎn)：首先，二元載體的構(gòu)建較為方便

41、；而一元載體還需在根癌農(nóng)桿菌中進(jìn)行共整合，構(gòu)建效率相對(duì)較低。其次，二元載體的外源基因的轉(zhuǎn)化效率要高于一元載體。 6. 植物轉(zhuǎn)化常用的選擇基因和報(bào)告基因有哪些？報(bào)告基因有什么特點(diǎn)？ 選擇基因：新霉素抗性基因（neor）、慶大霉素抗性基因（gentr）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPT）基因（hpt），以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar） 報(bào)告基因：β-葡萄糖甘酸酶基因（gus）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）熒光素酶基因（luc） 綠色熒光蛋白（GFP）基因（gfp） 特點(diǎn)：① 報(bào)告分子不存在于宿主中或易于與內(nèi)源性基因相區(qū)別 ② 應(yīng)有一個(gè)簡單、快捷、靈敏及經(jīng)濟(jì)的分析方法 ③ 報(bào)告基因的分析結(jié)

42、果應(yīng)具有很強(qiáng)的線性范圍，便于分析啟動(dòng)子活性的大小變化 ④ 報(bào)告基因的表達(dá)必須不改變受體細(xì)胞或生物體生理活動(dòng) 7. 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定方法有哪些？ 鑒定：1. PCR檢測外源基因的整合 2. Southern 雜交檢測外源基因的整合 3. RT-PCR 檢測外源基因的表達(dá) 4. Northern雜交檢測外源基因的表達(dá) 5. Western雜交檢測外源基因表達(dá)的產(chǎn)物 8. 簡述建立植物轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的主要考慮因素 影響基因受體選擇的因素包括基因轉(zhuǎn)化方法、受體的再生能力、受體材料的生理狀態(tài)和再生途徑，以及體細(xì)胞無性系變異的發(fā)生等。其中限制基因轉(zhuǎn)移的首要因素當(dāng)屬受體的再生能力，因?yàn)榻⒏?/p>

43、頻植株再生體系是植物基因轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要條件，但是其他因素在不同程度上和以不同方式影響植物基因轉(zhuǎn)化的有效性。 第十四章 1. 簡述反轉(zhuǎn)錄病毒在動(dòng)物基因工程中的作用。 反轉(zhuǎn)錄病毒基因組整合到宿主細(xì)胞基因組后，其DNA隨宿主DNA的復(fù)制而復(fù)制并由5‘-LTR中的一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出病毒RNA鏈，它既是病毒基因組，同時(shí)又具有mRNA模板活性，翻譯出結(jié)構(gòu)。蛋白和反轉(zhuǎn)錄酶。在宿主細(xì)胞質(zhì)中，兩條相同的RNA鏈和反轉(zhuǎn)錄酶被包裝于內(nèi)殼中，形成的成熟病毒顆粒以芽殖方式分泌至細(xì)胞外，但通常不致死宿主細(xì)胞 2. 動(dòng)物基因工程中載體的類型及功能 類型：1.質(zhì)粒載體 2.病毒載體：腺病毒，與腺病毒相

44、關(guān)病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒 3.定向打靶載體 功能：1.將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞 2.讓外源基因整合進(jìn)入基因組中 3.介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移與表達(dá) 3. 簡述基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞的方法 向真核細(xì)胞轉(zhuǎn)移外源基因的方法大致可分為下面3類： (1)．物理轉(zhuǎn)染法：電擊法、顯微注射法、基因槍法、超聲波法 (2)．化學(xué)轉(zhuǎn)染法：磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、原生質(zhì)體融合法 (3)．病毒感染法 制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物常用的方法： 常用的有顯微注射法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法和核移植法。 顯微注射法（microinjection）是利用玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的

45、重組（rearrangement）、缺失（deletion）、復(fù)制（duplication）或易位（translocation）等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)。 胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法是將外源基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞，然后將轉(zhuǎn)基因的胚胎干細(xì)胞注射入受體動(dòng)物胚胎后，可參與宿主的胚胎構(gòu)成，形成嵌合體，直至達(dá)到種系嵌合。 核移植法是將供體細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)精子穿透等有性過程即可被激活、分裂并發(fā)育，讓核供體的基因得到完全復(fù)制。培養(yǎng)一段時(shí)間后，在把發(fā)育中的卵母細(xì)胞移植到人或動(dòng)物體內(nèi)的方法。 4. 簡述轉(zhuǎn)基因小鼠的制備過程。 DNA顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠 ⑴ 超數(shù)排卵 對(duì)年輕、

46、健康未孕母鼠（4-5周齡）注射促性腺激素，誘導(dǎo)超數(shù)排卵，與種公鼠合籠交配，從輸卵管的壺腹部收集原核期受精卵。 ⑵ 基因準(zhǔn)備 從整合率上看線形DNA分子要好于環(huán)形DNA，而環(huán)形DNA在細(xì)胞內(nèi)的半衰期較長，適用于瞬間表達(dá)與基因治療。盡管載體DNA序列不影響外源DNA的整合效率，但載體序列能抑制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，因此應(yīng)盡量去除轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)中的載體部分。 ⑶ 顯微注射 （1）外源DNA進(jìn)入原核 （2）培養(yǎng)液中培養(yǎng) （3）進(jìn)行冷凍保存，或直接用于移植，或繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)育到囊胚后再移植。 ⑷ 胚胎移植 胚胎:囊胚期或囊胚期之前的胚胎，可依據(jù)早期胚胎的發(fā)育階段和物種的不同決定移植的部位。注射后的單細(xì)胞

47、至桑葚期的胚胎應(yīng)移植到0.5d假孕鼠的輸卵管內(nèi)，而達(dá)到囊胚期的胚胎則須轉(zhuǎn)移至2.5 d假孕鼠子宮內(nèi)。未經(jīng)注射的新鮮胚胎的移植成功率為50%-70%，注射胚胎移植后的受胎率有所下降，僅為10%-30%。 ⑸ 轉(zhuǎn)基因個(gè)體鑒定 接受胚胎移植的假孕鼠產(chǎn)下的幼鼠是否含有外源基因？ （1）分子鑒定，判定其基因組內(nèi)是否整合了外源基因 （2）目的蛋白表達(dá)與否和表達(dá)水平測定 （3）產(chǎn)物的分離純化及生物活性檢測 胚胎干細(xì)胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠 5. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定方法有哪些？ （1）標(biāo)記篩選法利用正負(fù)篩選標(biāo)記 （2）分子鑒定法：PCR擴(kuò)增、斑點(diǎn)雜交、Southern雜交、熒光原位雜交 （3）

48、表達(dá)水平檢測：報(bào)告基因檢測、Northern雜交、RT-PCR、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western雜交、目的蛋白的生物活性檢測 6.報(bào)告基因 報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定、常用于判斷外源基因是否成功地導(dǎo)入受體細(xì)胞（器官或組織），是否啟動(dòng)表達(dá)的一類特殊用途的基因。 7. 什么是定向打靶技術(shù)和定向打靶載體？如何確保外源基因的定向整合？ 基因打靶是通過外源基因與靶細(xì)胞染色體上的同源序列間的同源重組，將外源基因定點(diǎn)整合到靶細(xì)胞特定位置上，而使某一個(gè)特定位點(diǎn)上的基因發(fā)生定點(diǎn)突變的技術(shù)。 定向打靶載體：將正向選擇標(biāo)記（如neor）基因置于發(fā)生同源交換的序列中間，同源臂外側(cè)為真核細(xì)胞的負(fù)選擇

49、標(biāo)記（如TK基因）以及在原核細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和篩選的載體。 確保整合：通過對(duì)新霉素抗性篩選獲得整合外源基因的細(xì)胞，通過添加丙氧鳥苷（GANC）到細(xì)胞，剔除隨機(jī)整合的細(xì)胞，獲得定點(diǎn)整合的細(xì)胞克隆。 8.如何獲得人生長因子？ 尋找人生長因子含量豐富的細(xì)胞，從中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR獲取目的基因。 第十五章 1. 舉例說明酵母基因工程相對(duì)于大腸桿菌基因工程的優(yōu)勢(shì)與不足。 優(yōu)點(diǎn) ① 是真核生物，大多具有較高的安全性 ② 繁殖速度快，能大規(guī)模生產(chǎn)，具有降低基因工程產(chǎn)品成本的潛力 ③ 將原核生物中已知的分子和基因操作技術(shù)與真核生物中復(fù)雜的轉(zhuǎn)譯后修飾能力相結(jié)合，能方便地用于

50、外源基因的操作 ④ 采用高表達(dá)啟動(dòng)子，可高效表達(dá)目的基因，而且可誘導(dǎo)調(diào)控 ⑤ 提供了翻譯后加工和分泌的環(huán)境，使得產(chǎn)物與天然蛋白一樣或類似 ⑥ 酵母菌可將表達(dá)的外源蛋白與末端前導(dǎo)肽融合，指導(dǎo)新生肽分泌，同時(shí)在分泌過程中可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化修飾 ⑦ 不會(huì)形成不溶性的包涵體，易于分離提純 ⑧ 移去起始甲硫氨酸，避免了在作為藥物使用中引起免疫反應(yīng)的問題 ⑨ 酵母菌（主要是釀酒酵母）已完成全基因組測序，它具有比大腸桿菌更完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾及分泌能力 ⑩ 酵母可進(jìn)行蛋白的N-乙?；-甲基化，對(duì)定向到膜的胞內(nèi)表達(dá)蛋白具有重要作用。 不足 (1)較難進(jìn)行高密

51、度發(fā)酵：乙醇的產(chǎn)生和影響 (2)蛋白質(zhì)的分泌能力較差 (3)過度糖基化修飾，平均50-150個(gè)甘露糖殘基 2. 作為一個(gè)酵母表達(dá)載體，包括那些基本元件？ ①啟動(dòng)子：最常用的啟動(dòng)子是基因AOX1的啟動(dòng)子 ② 選擇標(biāo)記：常用HIS4，以及ARG4、TRP1或URA3作選擇標(biāo)記的載體。 ③ 信號(hào)肽序列 3. 酵母雙雜交的基本原理？ （1）來自酵母轉(zhuǎn)錄激活因子（transcriptionalactivator）GAL4是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，有兩個(gè)功能域: 一是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain, BD）靠近羧基端,含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可與DNA序列中半乳糖苷酶的上

52、游激活序列（upstream activating sequence, UAS）結(jié)合； 二是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain, AD，可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFII相互作用，提高RNA聚合酶的活性。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能是獨(dú)立的。 （2）酵母雙雜交系統(tǒng)利用融合蛋白的策略，將要篩選的“探針”蛋白X與BD融合為BD-X（通常稱為誘餌， bait） （3）將所要篩選的對(duì)象Y與AD構(gòu)建成融合蛋白的AD-YcDNA文庫（即將目的cDNA與AD基因構(gòu)建融合基因文庫），通常稱AD-Y為獵物（prey） （4）將它們導(dǎo)入酵母細(xì)胞中共表達(dá)，如果X與Y相互作用，則會(huì)導(dǎo)致BD和AD在空間上接近形成一個(gè)有功能的轉(zhuǎn)錄激活因子，激活下游報(bào)告基因的表達(dá)。 4. 如何提高基因在染色體上的拷貝數(shù)來提高異源基因的表達(dá)量？ ① 不同轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)致產(chǎn)生天然高拷貝轉(zhuǎn)化子； ② 體外在載體上多次插入目的基因片段； ③ 將載體中目的基因兩端連上來自宿主rDNA或其他非必須高重復(fù)的基因片段，通過同源重組而達(dá)到高拷貝整合； ④ 利用基因的功能篩選高拷貝整合。