糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金快速測試卡檢測方法編制說明

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1、糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金 快速測試卡檢測方法》 編制說明 糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金 快速測試卡檢測方法》 標準起草組 2011年 11 月 《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金 快速測試卡檢測方法》 編制說明 1 ?任務來源及工作過程 國務院糧食管理流通條例和糧食衛(wèi)生標準都明確規(guī)定糧食收購要對真菌毒 素玉米赤霉烯酮進行檢驗控制，而我國標準體系中缺少嘔吐毒素快速檢測的方法 及標準因此，該項研究迫在眉睫。 我國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)產(chǎn)品種植區(qū)分布廣泛，糧食收購多集中在縣以下單位的 糧食收儲庫點。時間短，收購量大，存在很多隱患。主要集中在以下方面：一方 面糧食入庫時間短，不宜長時間

2、露天存放，因此對玉米赤霉烯酮的檢測需要快速 定性。另一方面收購企業(yè)技術(shù)力量和硬件設備不足，利用大型儀器檢測收購糧真 菌毒素無法普及。因此目前在糧食收購環(huán)節(jié)最需要解的問題就是建立高效、 快速、 低成本的定性檢測方法。 傳統(tǒng)上，真菌毒素的分析一般采用薄層色譜法 (TLC和高效液相色譜法 (HPLC) TLC雖然簡便，但靈敏度差；HPLC雖然靈敏度高，但樣品處理煩瑣，操 作復雜，儀器昂貴。這兩種方法都不適合在收購原糧時進行快速定性檢測。 因此 需要玉米赤霉烯酮快速檢測方法的研究，從源頭解決儲備糧真菌毒素污染問題。 為了確保公民的飲食安全，進一步保證產(chǎn)品質(zhì)量、規(guī)范生產(chǎn)、為市場監(jiān)督提 供依據(jù)，

3、需要制定《糧食中玉米赤霉烯酮一一膠體金快速測試卡檢測方法》 標準, 按照GB2760-2007的要求，對小麥粉及其制品中玉米赤霉烯酮的含量進行監(jiān)督。 本行業(yè)標準的制定是根據(jù)國家糧食局標準質(zhì)量中心下達的 年國家標準 制修訂任務，由北京市糧油食品檢驗所負責起草。項目編號： 2.編制過程 2.1第一階段工作 第一階段為收集國內(nèi)外玉米赤霉烯酮測試分析標準及相關(guān)資料， 了解掌握玉 米赤霉烯酮測定方法的最新技術(shù)發(fā)展情況階段。本階段查閱了大量的文獻資料， 參考國內(nèi)外玉米赤霉烯酮測定方法的國家標準和行業(yè)標準。 標準編制小組成員經(jīng) 過研究和討論一致認為， 膠體金快速檢測方法具有較好的可操作性和

4、實用性， 因 此我們參考這些先進方法和產(chǎn)品， 并根據(jù)國內(nèi)糧食行業(yè)的實際生產(chǎn)和檢測技術(shù)應 用情況，著手制定 《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金快速測試卡檢測方法》 的基 本思路和主要工作方向。 2.2 第二階段工作 第二階段為組織起草并召開標準起草組工作會議。本標準起草組在經(jīng)過收 集、整理資料和調(diào)研工作的基礎上， 提出標準提綱， 確定了標準的主要內(nèi)容和要 求。標準起草工作組成員單位進行討論、論證，形成標準初步文本；標準起草組 成員單位間通過多種形式不斷交流、 補充、 完善標準文本， 進行驗證試驗和比對 試驗，最終形成該標準征求意見稿。 本階段重點組織了玉米赤霉烯酮檢測方法的驗證試驗。 先后開展

5、了兩輪比對 試驗，針對各家分析實際操作時標準文本中存在的問題及建議， 對標準進行了修 改，得到標準起草小組的一致認可，形成該標準征求意見稿。 3 編制原則 3.1 本標準按照 GB/T 1.1-2009、GB/T 20000.2-2009 和GB/T 20001.4-2001《標 準編寫規(guī)則 第4 部分 化學分析方法》 的規(guī)定和要求編寫， 在標準框架、 結(jié)構(gòu)和 內(nèi)容等方面符合這些標準的要求。 3.2 強制性國家標準《糧食衛(wèi)生標準》規(guī)定了糧食中玉米赤霉烯酮的安全限量， 且本標準所確定的檢測方法能滿足該標準的初步篩選測定。 4. 國家標準主要內(nèi)容的論據(jù) 4.1 本標準的主要內(nèi)容 《糧食

6、中玉米赤霉烯酮——膠體金快速測試卡檢測方法》標準為推薦性標 準，其主要內(nèi)容包括： （1 ） 封面 （2） 前言 3） 標準主體內(nèi)容：范圍、規(guī)范性引用文件、原理、試劑、儀器設備、 樣品制備、樣品測定與結(jié)果判定。 4.2 主要試驗（或驗證）的分析 4.2.1 標準方法原理 玉米赤霉烯酮毒素膠體金快速測試卡檢測技術(shù)原理是基于抗原抗體反應、 免 疫金標記技術(shù)及毛細管層析技術(shù)。 以微孔膜為固相載體， 將可特異性識別玉米赤 霉烯酮的抗體標記紅色或紫紅色的膠體金顆粒， 檢測卡的膜上兩個色帶分別固定 玉米赤霉烯酮抗原， 以及抗鼠源性抗體的二抗， 根據(jù)色帶的顏色變化進行結(jié)果評 估。質(zhì)控色帶（ con

7、trol line ）不會被樣品中的玉米赤霉烯酮影響，而在每次反應 后都應出現(xiàn)，用于證明檢測條是否正常。檢測色帶（test line）在樣品中沒有玉 米赤霉烯酮或樣品中玉米赤霉烯酮的含量低于檢測限時會顯現(xiàn)； 在樣品中玉米赤 霉烯酮含量等于或高于檢測限時不出現(xiàn)。 4.2.2 驗證方案 驗證對象及驗證單位 參考糧食衛(wèi)生標準， 確定本次驗證糧種為小麥和玉米， 考慮到加標樣品的毒 素分布、均勻性等影響， 本次驗證全部采用天然陽性樣品進行驗證； 驗證毒素為 玉米赤霉烯酮（DON）;驗證用膠體金快速測試卡采用國內(nèi)二家公司提供的 DON 三批次。驗證單位為（北京）國家糧食質(zhì)量監(jiān)測中心、 （湖北）國家

8、糧食質(zhì)量監(jiān) 測中心、（遼寧）國家糧食質(zhì)量監(jiān)測中心、 （重慶）國家糧食質(zhì)量監(jiān)測中心、 （四 川）國家糧食質(zhì)量監(jiān)測中心和（廣西）國家糧食質(zhì)量監(jiān)測中心。 陽性樣品的制備 北京中心將收集到的陽性樣品粉碎，至少 80%以上通過 20 目篩，篩上和篩 下物混勻，采用免疫親和柱高效液相色譜法對制備的陽性樣品進行混合均勻度測 定，混合均勻性達到要求后將陽性樣品分發(fā)給六家國家檢測中心。 4.2.2.3 陽性樣品定值 六家國家檢測中心收到陽性樣品后， 采用免疫親和柱高效液相色譜法進行平 行試驗測定結(jié)果報送北京中心進行統(tǒng)計處理，取平均值作為理論值。 4.2.2.4 測試卡驗證 六家國家中心將分發(fā)并定值后

9、的高濃度陽性樣品與空白樣品按照各測試卡 樣品量要求分別稱取，配置所需濃度，然后按照測試卡說明書指定的方法進行測 ^定。 423結(jié)果與分析 采用兩種DON測試卡（測試卡A和測試卡B）,各三個批次，按照各自規(guī)定 的操作步驟和評定方法對玉米中 DON進行了測定。 準確性 測試卡A 根據(jù)結(jié)果，共進行21個濃度150次有效測試，共出現(xiàn)誤判21次，判定準確 率為86%,假陽誤判出現(xiàn)3次，假陰誤判出現(xiàn)18次。 具體結(jié)果見下表1： 表1玉米赤霉烯酮測試卡A誤判情況表 品種 測試次 數(shù) 誤判 次數(shù) 誤判率 % 假陰誤 判次數(shù) 假陰誤 判率% 假陽誤 判次數(shù) 假陽誤

10、 判率% 玉米 15 21 14. 18 12. 3 2.0 0 0 0 4.2.3.1.2 測試卡 B 根據(jù)結(jié)果，共進行21個濃度142次有效測試，共出現(xiàn)誤判24次，判定準確 率為83.1%，假陽誤判出現(xiàn)9次，假陰誤判出現(xiàn)15次。 具體結(jié)果見下表2： 表2玉米赤霉烯酮測試卡B誤判情況表 品種 測試次 誤判 誤判率 假陰誤 假陰誤 假陽誤 假陽誤 數(shù) 次數(shù) % 判次數(shù) 判率% 判次數(shù) 判率% 玉米 142 24 16.9 15 10.6 9 6.3 重復性 測試卡A:按照驗證方案，共進

11、行240次測試，其中有效結(jié)果為240次，共 出現(xiàn)誤判29次，判定準確率為87.9%,其中假陰性誤判次數(shù)為11次，出現(xiàn)比例 為 4.6%。 測試卡B:按照驗證方案，共進行243次測試，其中有效結(jié)果為243次，共 出現(xiàn)誤判29次，判定準確率為88.1%,其中假陰性誤判次數(shù)為20次，出現(xiàn)比例 為 8.2%。 423.3穩(wěn)定性 測試卡A 根據(jù)有效結(jié)果，按照含量為限量標準時應判定為陽性的規(guī)則， 各不同產(chǎn)品批 次測定結(jié)果如下表3： 表3測試卡A不同產(chǎn)品批次測定結(jié)果 批次 測試次數(shù) 誤判 判定準確率% 20101110 16 1 93.8 20101116 25 2 92

12、.0 20101126 24 3 87.5 20101106 15 2 86.7 批間相對偏差% 3.8 4.2.3.3.2 測試卡 B 根據(jù)有效結(jié)果，按照含量為限量標準時應判定為陽性的規(guī)則， 各不同產(chǎn)品批 次測定結(jié)果如下表4: 表4測試卡B不同產(chǎn)品批次測定結(jié)果 批次 測試次數(shù) 誤判 判定準確率% G101009301 33 0 100 G101125304 39 0 100 G101125305 29 5 82.8 批間相對偏差% 10.5 約定誤差范圍試驗 測試卡A:在40-80ppb濃度范圍內(nèi)，對玉米

13、樣本共進行12個濃度的測定， 共獲得有效結(jié)果102次，假陰出現(xiàn)16次，基本平均分布在60-80ppb濃度之間, 且110與120ppb濃度下也各出現(xiàn)1次誤判；假陽出現(xiàn)3次，分別在在55ppb濃 度2次、58ppb濃度1次，總體樣本假陽誤判率為2.9%。 測試卡B:在40-80ppb濃度范圍內(nèi)，對玉米樣本共進行12個濃度的測定， 共獲得有效結(jié)果92次，假陰出現(xiàn)14次，基本平均分布在60-80ppb濃度之間， 另外，在120ppb濃度下出現(xiàn)1次誤判；假陽出現(xiàn)9次，分別在在40ppb-58ppb 濃度之間，總體樣本假陽誤判率為 9.8%。 結(jié)論 現(xiàn)有國家標準方法中規(guī)定的ZEN測定方法精密度（見

14、表5）。 表5玉米赤霉烯酮檢測相關(guān)標準 標準號 GB/T500 9.209-20 08 GB/T 23504-200 9 SN/T 1772-2006 標準名稱 食品中玉 進出口糧谷中 米赤霉烯 玉米赤霉烯酮 酮的測定 的測定 采用方法 免疫親和層析HPLC 薄層色譜 ELISA HPLC 重復性% 15 10 10 15 / 再現(xiàn)性% / / / / / 檢出限/量 5ug/kg 20ug/kg 20 ng 0.25 ng 5ug/kg 回

15、收率% / 70-100 / / 73.7-98.2 4.2.4.2測試卡性能（見表 6）： 表6測試卡B不同產(chǎn)品批次測定結(jié)果準確率 批次 測試卡A % 測試卡B %備注 準確性 86 83.1 玉米 重復性 87.9 88.1 玉米 穩(wěn)定性 90 95.0 玉米 約定誤差范圍（50 81.2 73.3 玉米 mg/kg ?70 mg/kg） 4.243嘔吐毒素測試卡指標設定 準確性判定誤判率：結(jié)合4.241中目前國內(nèi)方法的各項指標可設定為小于 15% 重復性判定誤判

16、率：結(jié)合4.241中目前國內(nèi)方法的各項指標可設定為小于 15% 穩(wěn)定性判定誤判率：結(jié)合4.241中目前國內(nèi)方法的各項指標可設定為小于 15% 約定誤差范圍（50 mg/kg~70 mg/kg）內(nèi)判斷誤判率： 該方法中，兩種測試卡的約定誤差范圍誤判率提取機制上進一步改進， 應當 能解決誤判率告的問題，因此將該濃度范圍內(nèi)的誤判率定為小于 15% 5. 國家標準作為強制性國家標準或推薦性國家標準的建議 建議將此國家標準列為推薦性國家標準。 6. 貫徹國家標準的要求和措施建議（包括組織措施、技術(shù)措施、過度辦法等內(nèi)容） 建議職能管理機構(gòu)，指定生產(chǎn)部門，生產(chǎn)貫徹本標準以達到保護消費者權(quán)益 的

17、目的。 7. 新舊國家標準的總體對比 8. 技術(shù)經(jīng)濟論證及預期的社會經(jīng)濟效果 國際上少數(shù)國家針對糧食玉米赤霉烯酮含量的檢測制定了試行方法， 但方法 均不統(tǒng)一。我國目前還未制定相關(guān)的快速篩選方法標準。 隨著食品安全、糧食安 全戰(zhàn)略意義的不斷擴大，以及我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，加入世界貿(mào)易組織，與國際 標準接軌，必須制定相應的檢測標準進行安全控制?，F(xiàn)狀：我國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng) 產(chǎn)品種植區(qū)分布廣泛，糧食收購多集中在縣以下單位的糧食收儲庫點。時間短， 收購量大，存在很多隱患。主要集中在以下方面：一方面糧食入庫時間短，不宜 長時間露天存放，因此對玉米赤霉烯酮的檢測需要快速定性。 另一方面收購企業(yè) 技術(shù)力

18、量和硬件設備不足，利用大型儀器檢測收購糧真菌毒素無法普及。 因此目 前在糧食收購環(huán)節(jié)最需要解的問題就是建立高效、 快速、低成本的定性檢測方法。 該標準的制定有利于促進產(chǎn)業(yè)升級和產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的調(diào)整、 推動技術(shù)進步和技術(shù) 創(chuàng)新、推進與國際慣例接軌； 有利于糧食質(zhì)量標準體系的建立； 有利于公共食品 安全。 9. 參考的國際標準 無 10. 與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性標準的關(guān)系 11. 關(guān)于強制性條款 12. 貫徹國家標準的要求和措施建議 1）首先應在實施前保證文本的充足供應， 讓每個使用者都能及時得到文本。 這是保證新標準貫徹實施的基礎。 2）發(fā)布后、實施前應將信息在媒體上廣為宣傳。 3）本次修訂，不僅與生產(chǎn)廠家有關(guān)，而且與消費者有關(guān)。對于使用過程中 容易出現(xiàn)的疑問，要在媒體上撰文事先予以解釋。 4）要分別標準的不同使用對象，消費者、生產(chǎn)廠家、質(zhì)量監(jiān)管部門等，有 側(cè)重點地進行培訓、宣傳。 5）實施的過渡期宜定為 6 個月。 6）建議質(zhì)量監(jiān)督部門加強監(jiān)測。 13. 廢止現(xiàn)行有關(guān)標準的建議 無