高考生物總復習 第六章第2節(jié) DNA片段的擴增 PCR技術課件 中圖版選修1

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1、第第2節(jié)節(jié)DNA片段的擴增片段的擴增PCR技術技術學習導航學習導航1.理解理解PCR擴增擴增DNA片段的原理。片段的原理。重點重點2.嘗試嘗試PCR技術的基本操作和應用。技術的基本操作和應用。 難點難點新知初探思維啟動新知初探思維啟動一、一、DNA在細胞內的復制在細胞內的復制1.所需的酶：所需的酶：_酶、酶、DNA聚合酶和聚合酶和RNA聚合酶等。聚合酶等。2.引物：引物：_。3.原料：原料：_。4.原則：原則：_。DNA解旋解旋一段一段RNA四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸堿基互補配對原則堿基互補配對原則二、二、PCR及其過程及其過程1.概念：概念：PCR即聚合酶鏈式反應，實際上是即聚合酶鏈式反應

2、，實際上是在在_模擬細胞內的模擬細胞內的_，形，形成大量成大量_的的DNA片段。片段。體外體外DNA復制過程復制過程特異性特異性2.過程過程條件條件過程過程加加樣樣室溫室溫把把PCR緩沖液緩沖液、_、一對引物、四種脫氧核苷酸、一對引物、四種脫氧核苷酸、DNA聚合酶、聚合酶、Mg2等成分加等成分加入到微量離心管中入到微量離心管中DNA模板模板氫鍵氫鍵一對引物一對引物DNA聚合聚合脫氧核苷酸脫氧核苷酸判一判判一判(1)細胞內細胞內DNA復制和復制和PCR技術所需的引物一技術所需的引物一樣，都是樣，都是RNA。()(2)經經PCR技術合成的技術合成的DNA分子中，每條單鏈分子中，每條單鏈都含有引物。

3、都含有引物。()(3)PCR實驗的原理和操作都十分復雜，不易實驗的原理和操作都十分復雜，不易于操作。于操作。()(4)經過高溫變性、低溫復性和中溫延伸三步經過高溫變性、低溫復性和中溫延伸三步操作，操作，DNA片段可呈指數(shù)增長。片段可呈指數(shù)增長。()三、實驗操作三、實驗操作1.準備準備(1)為了避免為了避免_等因素的污染，等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、吸頭、緩沖液以實驗中使用的微量離心管、吸頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行及蒸餾水等在使用前必須進行_。(2)如果沒有如果沒有PCR儀，可以設置儀，可以設置3個恒溫水浴個恒溫水浴鍋，溫度分別為鍋，溫度分別為_、_和和_，然后按要求

4、在然后按要求在3個水浴鍋中來回轉移個水浴鍋中來回轉移PCR的的微量離心管即可。微量離心管即可。外源外源DNA高壓滅菌高壓滅菌95 55 72 PCR熱循環(huán)熱循環(huán)260 nm想一想想一想決定決定PCR反應特異性的原因有哪些？反應特異性的原因有哪些？【提示提示】待擴增待擴增DNA片段的特異性。片段的特異性。要點突破講練互動要點突破講練互動要點一要點一PCR技術與體內技術與體內DNA復制的比較復制的比較細胞內復制細胞內復制PCR反應反應解旋解旋在解旋酶作用在解旋酶作用下下,細細胞提供能量，胞提供能量，部分解開部分解開加熱至加熱至90 以以上時，雙鏈全上時，雙鏈全部解開部解開酶酶DNA解旋酶、解旋酶、

5、DNA聚合酶聚合酶耐高溫的耐高溫的DNA聚合酶聚合酶引物引物一小段一小段RNA單鏈單鏈DNA細胞內復制細胞內復制PCR反應反應能量能量ATP不加不加循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)生物自身控制生物自身控制30多次多次子鏈合成子鏈合成一條鏈連續(xù)合一條鏈連續(xù)合成成,另另一條鏈不連續(xù)一條鏈不連續(xù)合成合成兩條子鏈為連續(xù)兩條子鏈為連續(xù)合合成成,溫溫度為度為72 產物產物完整完整DNADNA片段片段相同點相同點需提供需提供DNA復制的模板復制的模板四種脫氧核苷酸為原料四種脫氧核苷酸為原料堿基互補配對原則堿基互補配對原則子鏈延伸的方向都是從子鏈延伸的方向都是從5端到端到3端端特別提醒特別提醒PCR反應需要可變的溫度，而反應

6、需要可變的溫度，而體內體內DNA復制需要穩(wěn)定的溫度。復制需要穩(wěn)定的溫度。DNA解旋酶的作用是使解旋酶的作用是使DNA兩條鏈的氫鍵兩條鏈的氫鍵斷開；斷開；DNA聚合酶的作用是將單個脫氧核苷聚合酶的作用是將單個脫氧核苷酸加到已有的單鏈片段的酸加到已有的單鏈片段的3端上，需要模板端上，需要模板; DNA連接酶連接的是兩條連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，片段的缺口，不需要模板。不需要模板。 PCR過程與細胞內的過程與細胞內的DNA復制過程相復制過程相比，主要有兩點不同，它們是比，主要有兩點不同，它們是()PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈過程需要的引物是人工合成的單鏈DNAPCR過程不需要過程不

7、需要DNA聚合酶聚合酶PCR過程中過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的PCR過程中，過程中，DNA不需要解旋，直接以雙不需要解旋，直接以雙鏈鏈DNA為模板進行復制為模板進行復制例例1A BC D【解析解析】PCR過程與細胞內的過程與細胞內的DNA復制過復制過程相比較，主要有兩點不同：程相比較，主要有兩點不同：PCR過程需過程需要的引物是人工合成的單鏈要的引物是人工合成的單鏈DNA，長度通常，長度通常為為1540個核苷酸。個核苷酸。PCR過程中，過程中，DNA解解旋不依賴解旋酶，而是通過對反應溫度的控旋不依賴解旋酶，

8、而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的。制來實現(xiàn)的?！敬鸢复鸢浮緾變式訓練變式訓練(2012成都七中高二檢測成都七中高二檢測)下列關于下列關于DNA復制復制和和PCR的描述中，正確的是的描述中，正確的是()ADNA聚合酶不能從頭開始合成聚合酶不能從頭開始合成DNA，只，只能從能從5端延伸端延伸DNA鏈鏈BDNA復制不需要引物復制不需要引物C引物與引物與DNA母鏈通過堿基互補配對進行母鏈通過堿基互補配對進行結合結合DPCR擴增的對象是氨基酸序列擴增的對象是氨基酸序列解析：選解析：選C。由于。由于DNA聚合酶不能從頭開始聚合酶不能從頭開始合成合成DNA，只能從，只能從3端延伸端延伸DNA鏈，故鏈，故DN

9、A復制需要引物，而且它與復制需要引物，而且它與DNA母鏈通過堿基母鏈通過堿基互補配對結合?；パa配對結合。PCR擴增的對象是擴增的對象是DNA，而，而不是氨基酸。不是氨基酸。2.PCR擴增過程擴增過程變性變性復性復性延伸延伸預變性預變性95 ，5 min55 ，1 min72 ，1 min重復重復30次次95 ，30 s55 ，30 s72 ，1 min最后一最后一次循環(huán)次循環(huán)72 ，1 min圖示：圖示：3.DNA擴增數(shù)目的理論計算擴增數(shù)目的理論計算理論上理論上DNA擴增呈指數(shù)增長。若只有一條擴增呈指數(shù)增長。若只有一條DNA模板，則復制模板，則復制n次后有次后有2n條；若一開始條；若一開始有有

10、m條條DNA模板，則復制模板，則復制n次后有次后有m2n條；條；實際操作過程中，由于無關變量的影響，一實際操作過程中，由于無關變量的影響，一般來說實驗值要略小于理論值。般來說實驗值要略小于理論值。 近近20年來，年來，PCR技術技術(多聚酶鏈式多聚酶鏈式反應反應)成為分子生物學實驗室的一種常規(guī)實驗成為分子生物學實驗室的一種常規(guī)實驗手段，其原理是利用手段，其原理是利用DNA半保留復制，在試半保留復制，在試管中進行管中進行DNA的人工復制的人工復制(如圖如圖)，在短時間，在短時間內內,將將DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，從而擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，從而使實驗室所需要的遺傳物質不再受限于活的使實驗

11、室所需要的遺傳物質不再受限于活的生物體。生物體。例例2(1)加熱使加熱使DNA雙鏈間的雙鏈間的_鍵完全鍵完全打開，稱為打開，稱為_；而在細胞中是在；而在細胞中是在_酶的作用下進行的。酶的作用下進行的。(2)如果只需要大量克隆模板如果只需要大量克隆模板DNA中間的某中間的某個特定區(qū)段，應該加入個特定區(qū)段，應該加入_種特定的種特定的引物。當溫度降低至引物。當溫度降低至55 C時，引物與兩條時，引物與兩條“舒展舒展”的模板的特定位置結合，在的模板的特定位置結合，在DNA聚聚合酶的作用下，只能在引物的合酶的作用下，只能在引物的_端連端連接脫氧核苷酸，兩條子鏈的延伸方向都是接脫氧核苷酸，兩條子鏈的延伸方

12、向都是_。(3)PCR技術的必需條件，除了模板、原料、技術的必需條件，除了模板、原料、酶之外，至少還有三個條件，即液體環(huán)境、酶之外，至少還有三個條件，即液體環(huán)境、適宜的適宜的_和和_，前者由，前者由_自動調控，后者則靠自動調控，后者則靠_來維持。來維持。(4)通過通過PCR技術使技術使DNA分子大量復制，如果分子大量復制，如果將一個用將一個用15N標記的標記的DNA分子放入試管中，以分子放入試管中，以14N標記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復制四次標記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復制四次之后，則之后，則15N標記的標記的DNA分子占全部分子占全部DNA分分子總數(shù)的比例是子總數(shù)的比例是_?！窘馕鼋馕觥?1

13、)PCR技術利用熱變性原理使技術利用熱變性原理使DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂，稱為變性，而在雙鏈之間的氫鍵斷裂，稱為變性，而在細胞內是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂。細胞內是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂。(2)PCR分為三個基本反應步驟分為三個基本反應步驟:變性變性(95 )、復性復性(55 )、延伸、延伸(72 )，其特異性依賴于，其特異性依賴于與靶序列互補的引物，引物是兩段與待擴增與靶序列互補的引物，引物是兩段與待擴增DNA序列互補的片段，兩引物之間的距離決序列互補的片段，兩引物之間的距離決定擴增片段的長度。定擴增片段的長度。由于由于DNA聚合酶不能從頭開始合成聚合酶不能從頭開始合成DNA，只，只能

14、從引物的能從引物的3端延伸端延伸DNA鏈，則鏈，則DNA的合成的合成方向總是從子鏈的方向總是從子鏈的5端向端向3端延伸。端延伸。(3)PCR技術與細胞內的技術與細胞內的DNA復制不完全相同，除了復制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體環(huán)境環(huán)境(穩(wěn)定的緩沖液穩(wěn)定的緩沖液)，每一個步驟需要適宜，每一個步驟需要適宜的溫度和酸堿度等。的溫度和酸堿度等。(4)一個一個DNA分子連續(xù)復分子連續(xù)復制四次之后，形成制四次之后，形成16個個DNA分子，分子，15N標記標記的的DNA分子有分子有2個，則個，則15N標記的標記的DNA分子占分子占全部全部DNA

15、分子總數(shù)的比例為分子總數(shù)的比例為1/8?！敬鸢复鸢浮?1)氫氫變性變性解旋解旋(2)兩兩3從子鏈的從子鏈的5端向端向3端延伸端延伸(3)溫度溫度酸堿度酸堿度PCR儀儀緩沖液緩沖液(4)1/8互動探究互動探究(1)PCR中由堿基錯配而引起哪種變異？中由堿基錯配而引起哪種變異？(2)假設對一個假設對一個DNA進行擴增，第一次循環(huán)進行擴增，第一次循環(huán)時某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯配，則擴增若時某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯配，則擴增若干次后檢測所用干次后檢測所用DNA的擴增片段，與原的擴增片段，與原DNA相應片段相同的占多少？相應片段相同的占多少？【提示提示】(1)基因突變?；蛲蛔儭?2)50%?！菊`區(qū)警示

16、誤區(qū)警示】關于關于DNA的擴增方向容易發(fā)的擴增方向容易發(fā)生混淆，為了明確表示生混淆，為了明確表示DNA的方向，通常將的方向，通常將DNA的羥基的羥基(OH)末端稱為末端稱為3端，磷酸基團端，磷酸基團的末端稱為的末端稱為5端，子鏈從引物端，子鏈從引物3端開始延伸，端開始延伸，而子鏈的合成方向是從而子鏈的合成方向是從5端向端向3端延伸。端延伸。要點三要點三實驗操作與結果分析實驗操作與結果分析1.檢測檢測PCR擴增效果的過程擴增效果的過程2.結果分析結果分析DNA片段的擴增是否成功的判斷片段的擴增是否成功的判斷(1)對于電泳檢測的方法，可以通過在紫外線對于電泳檢測的方法，可以通過在紫外線下直接觀察下

17、直接觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。擴增的效果。(2)擴增不成功的可能原因有：擴增不成功的可能原因有：漏加了漏加了PCR的反應成分；的反應成分；各反應成分的用量不當；各反應成分的用量不當；PCR程序設置不當?shù)?。程序設置不當?shù)取?在在PCR擴增擴增DNA的實驗中，預計一的實驗中，預計一分子分子DNA經過經過30次循環(huán)后，應該得到次循環(huán)后，應該得到230個個DNA分子，但是結果只有約分子，但是結果只有約210個個DNA分子，分子，那么不是出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是那么不是出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是()ATaq DNA聚合酶的活力不夠，或活性受聚合酶的活力不夠，或活性受到抑制到

18、抑制B系統(tǒng)設計欠妥系統(tǒng)設計欠妥C循環(huán)次數(shù)不夠循環(huán)次數(shù)不夠D復性時，部分親鏈與親鏈結合復性時，部分親鏈與親鏈結合例例3【解析解析】如果如果Taq DNA聚合酶活力不夠，聚合酶活力不夠，或活性受到抑制，則導致催化效率降低，得或活性受到抑制，則導致催化效率降低，得到的產物比預期的少。如果到的產物比預期的少。如果PCR系統(tǒng)設置不系統(tǒng)設置不妥，達不到預期的結果。復性時，模板鏈既妥，達不到預期的結果。復性時，模板鏈既可以和引物結合，互補的模板鏈也可相互結可以和引物結合，互補的模板鏈也可相互結合，從而導致產物減少。合，從而導致產物減少?！敬鸢复鸢浮緾變式訓練變式訓練DNA在在_nm的紫外線波段存在一強烈的的紫外線波段存在一強烈的吸收峰，其峰值的大小與吸收峰，其峰值的大小與DNA含量有關含量有關()A220 B240C260 D280解析：選解析：選C。DNA在在260 nm的紫外線波段存的紫外線波段存在一強烈的吸收峰，其峰值的大小與在一強烈的吸收峰，其峰值的大小與DNA含含量有關。據此，可以進行量有關。據此，可以進行DNA含量的測定。含量的測定。