質(zhì)粒分子生物學(xué)與質(zhì)粒技術(shù)

Click to edit Master title style,,Click to edit Master text styles,,Second level,,Third level,,Fourth level,,Fifth level,,*,,*,,,,,,,,,,,,,,,,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,,,,*,單擊此處編輯母版文本樣式,,第二級(jí),,第三級(jí),,第四級(jí),,第五級(jí),,質(zhì)粒分子生物學(xué)與質(zhì)粒技術(shù),,,第1講 質(zhì)粒分子生物學(xué)概論,,什么是質(zhì)粒,質(zhì)粒的復(fù)制分配和不相容性,質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移,細(xì)菌質(zhì)粒控制的表型,①抗性質(zhì)粒,②毒力質(zhì)粒,③降解質(zhì)粒,④共生質(zhì)粒,,,1 什么是質(zhì)粒,1.1 定義和命名,質(zhì)粒是染色體以外能自主復(fù)制的遺傳因子，不具有胞外期，對(duì)寄主細(xì)胞來(lái)說(shuō)是非必需的，符合這三條標(biāo)準(zhǔn)的染色體外DNA或RNA分子都可以稱為質(zhì)粒。狹義的質(zhì)粒一般是指細(xì)菌染色體外的環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒的命名：一個(gè)小寫字母 p 加 2-3 個(gè)大寫字母和數(shù)字，如 pJP4，pDTG1。,,,,1.2 細(xì)菌質(zhì)粒,細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子 (cccDNA)，其大小在1-1700 kb之間。根據(jù)質(zhì)?？刂频男誀?，可以把細(xì)菌質(zhì)粒分成抗性質(zhì)粒、降解質(zhì)粒、毒力質(zhì)粒和共生質(zhì)粒等類型。,,,1.3 真核生物的DNA質(zhì)粒,環(huán)狀DNA質(zhì)粒：酵母2,m,m質(zhì)粒，植物線立體中的環(huán)狀DNA質(zhì)粒，人和動(dòng)物的核DNA質(zhì)粒等，它們都是不知其功能的隱蔽質(zhì)粒。,線狀DNA質(zhì)粒：乳酸克魯維酵母的嗜殺線狀DNA質(zhì)粒，植物線粒體中與雄性不育有關(guān)的線狀DNA質(zhì)粒。,,,1.4 真核生物的RNA質(zhì)粒,有殼體的dsRNA質(zhì)粒：由蛋白質(zhì)殼體包裹，存在于某些真菌和植物細(xì)胞中，由于它們酷似病毒，所以也常被稱作真菌病毒和植物隱蔽病毒，或稱類病毒顆粒，典型代表是釀酒酵母的嗜殺dsRNA質(zhì)粒。與RNA病毒的主要區(qū)別是它們不具有感染性．,無(wú)殼體的dsRNA質(zhì)粒：存在于脂質(zhì)小囊中的栗疫菌減毒dsRNA質(zhì)粒，玉米線粒體中與雄性不育有關(guān)的dsRNA質(zhì)粒。,,,2 質(zhì)粒的復(fù)制、分配和不相容性,,2.1 復(fù)制 (Replication),質(zhì)粒的復(fù)制起始和拷貝數(shù)是由質(zhì)粒DNA序列控制的。質(zhì)粒分子中為質(zhì)粒復(fù)制所必需的最小區(qū)段稱為基本復(fù)制子，它由兩部分組成，一是復(fù)制原點(diǎn)(,ori,)，二是調(diào)節(jié)復(fù)制起始的基因（編碼蛋白質(zhì)或RNA)。,,,2.3 不相容性 (Incompatibility),兩種質(zhì)粒不能在同—個(gè)寄主細(xì)胞中共存的現(xiàn)象，叫質(zhì)粒的不相容性。質(zhì)粒之間的不相容性，是由于它們存在—種或幾種與質(zhì)粒復(fù)制或分配有關(guān)的相同因子，如基本復(fù)制子中的反向轉(zhuǎn)錄區(qū)(ColE1質(zhì)粒的RNAⅠ)，,ori,區(qū)中的重復(fù)子(Iteron)，與分配蛋白結(jié)合的分配位點(diǎn)。不相容性是質(zhì)粒分類的理想標(biāo)準(zhǔn)。腸道細(xì)菌質(zhì)粒分別屬于30多個(gè)不相容組，用Inc表示。,,,3,質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移,,通過細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸，使DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)細(xì)胞的現(xiàn)象叫接合(Conjugation)。這一過程由接合性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移 (,tra,) 基因區(qū)編碼。被轉(zhuǎn)移的DNA可以是接合質(zhì)粒本身，也可以是染色體或可誘動(dòng)的非接合性質(zhì)粒。得到供體DNA的受體細(xì)胞稱為接合體或接合子。每個(gè)供體細(xì)胞所產(chǎn)生的接合體數(shù)稱為接合頻率。,,,3.1 F質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移機(jī)制,F質(zhì)粒的分子大小為100 kb，編碼接合轉(zhuǎn)移功能的,tra,基因區(qū)位于遺傳和物理圖譜的66.6－100 kb 位置，編碼37個(gè)蛋白質(zhì)和1個(gè)反義RNA，這些分子分別負(fù)責(zé)性菌毛的合成和裝配，雜交對(duì)的穩(wěn)定，表面排斥，DNA轉(zhuǎn)移，以及,tra,區(qū)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。,,,圖1-10 F質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移區(qū)的結(jié)構(gòu)（66.6-100 kb區(qū)）,traA,：性菌毛亞基；,traN,和,traG,：雜交對(duì)穩(wěn)定；,traS,和,traT,：表面排斥；,traM,：轉(zhuǎn)移信號(hào)；,traY,：缺口酶；,traI,：DNA解旋酶；,traD,：驅(qū)動(dòng)單鏈DNA轉(zhuǎn)移；,traJ,、,finO,、,finP,：調(diào)節(jié)基因,,,3.2 細(xì)菌染色體的誘動(dòng),,細(xì)菌的染色體與質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移原點(diǎn),oriT,序列共價(jià)連接，染色體作為質(zhì)粒DNA的延伸部分被轉(zhuǎn)移?？梢岳眠@一功能定位染色體基因，以及獲得含有染色體片段的質(zhì)粒。,,,3.3 非接合質(zhì)粒的誘動(dòng),許多天然質(zhì)粒雖然是非接合性的，但仍然含有一個(gè),oriT,位點(diǎn)和轉(zhuǎn)移基因，當(dāng)與它共存的接合質(zhì)粒提供一個(gè)接合系統(tǒng)時(shí)，也能進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)移，稱之為誘動(dòng) (Mobilization,)。,,,4 細(xì)菌質(zhì)?？刂频谋硇?4.1 抗性質(zhì)粒,包括抗菌素抗性（R）質(zhì)粒和金屬抗性質(zhì)粒。R質(zhì)粒的進(jìn)化、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散給抗菌素治療帶來(lái)很大麻煩，是醫(yī)學(xué)所面臨的重大問題之一。R質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座子（Transposon）和整合子（Integron,）的相互作用，使細(xì)菌耐藥性問題更加嚴(yán)重。,,,4.2 毒力質(zhì)粒,許多細(xì)菌的致病力和毒性與質(zhì)粒有關(guān)，如大腸桿菌腸毒素和定居抗原，破傷風(fēng)毒素，炭疽毒素，溶血毒素，蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白，植物冠癭?。═i質(zhì)粒）和發(fā)根病（Ri質(zhì)粒）。,,,pTi-SAKURA的分子結(jié)構(gòu)（206479 bp，195 ORF）,,毒力基因（22）：,virA,,,virB1B2B3B4B5B6B7B8B9B10B11,,,virC1C2,,,,,virD1D2D3D4,,,virE1E2,,,virG,,,virH,,T-DNA基因（16）：,tms1,,,tms2,,,tmr,,,nos,,,acs,(2),,e,,,5,,,6a,,,6b,,,21-h,,,,,rolB-h,,,5-h,,,IS ORF,(2),,tiorf,174,,復(fù)制基因（3）：,repA,,,reB,,,repC,,接合基因（20）：,traCDG,,,traAFB,,,traM,,,traR,,,traI,,,trbBCDEJKLFGHI,,其它基因（50）；未鑒定的ORF（84）,引自：,K. Suzuki et al. / Gene 242 (2000) 331-336,,,,4.3 降解質(zhì)粒,許多環(huán)境污染物的降解途徑由質(zhì)粒基因編碼，降解基因組成幾個(gè)操縱子，操縱子的表達(dá)受調(diào)節(jié)基因控制。目前，已經(jīng)測(cè)定全序列并注釋基因的降解質(zhì)粒有10余種，分別是尼龍寡聚體降解質(zhì)粒pOAD2，芳香烴降解質(zhì)粒pNL1，除草劑阿特拉津降解質(zhì)粒pADP-1，甲苯降解質(zhì)粒pWWO，煙堿降解質(zhì)粒pAO1，咔唑降解質(zhì)粒pCAR1, 異丙基苯降解質(zhì)粒pBD2，鹵乙酸降解質(zhì)粒pUO1，2,4-D降解質(zhì)粒pJP4，萘降解質(zhì)粒pND6-1和pDTG1。,,,,,The catabolic plasmids that complete sequence has been determined,,,Plasmid Substrates Strain Size (bp) Catabolic References genes,,pOAD2 Nylon,Flavobacterium,K172 45519,nylA,Microbiology oligomers,nylBC,2019,141:2585,,pNL1 Biphenyl,naphthalene,Sphingomonas,184457,pbh, xyl,,J. Bacteriol.,m,-xylene,,p,-cresol,aromaticivorans,F199,nah, pch,2019,181:1585,,pADP-1 Atrazine,Pseudomonas,ADP 108845,atzA,atzB,J. Bacteriol.,atzC,atzDEF,2019,183:5684,,pWWO Xylene,Toluene,P. putida,mt-2 116580,xyl,Envi.. Microbiol. 2019,4:856,pAO1 Nicotine,Arthrobacter,165137,ndh, 6hlno,J. Bacteriol.,nicotinovorans,,kdh, dhph,2019,185:1976,,pCAR1 Carbazole,P. resinovorans,CA10 199035,carABCDEF,J. Mol. Biol.,antABC,2019,326:21,,pBD2 Isopropylbenzene,Rhodococcus,210205,ipbA1A2A3A4,J. Bacteriol.,Erythropolis,BD2 2019,185:5269,,pUO1 Haloacetates,Delfitia,67066,dehH1, dehH2,J. Bacteriol.,Acidovorans,B 2019,185:6741,,pJP4 2,4-D,Ralstonia,87688,tfdA, tfdB,Envi..Microbiol. 3-chlorobenzoate,eutropha,JMP134,tfdCDEF,2019,6:655,,pND6-1 naphthalene,Pseudomonas,ND6 101858,nah,Gene 2019,336:231,,pDTG1 naphthalene,P. putida,83042,nah,J. Mol. Biol. NCIB 9816-4 2019,341:753,,,4.4 共生質(zhì)粒,,在許多根瘤菌屬細(xì)菌中存在與結(jié)瘤和固氮有關(guān)的共生質(zhì)粒，質(zhì)粒的大小在1000 kb以上，與細(xì)菌染色體基因一起行使固氮功能。,Sinorhizobium meliloti,的豆科共生復(fù)合基因組由3部分組成：染色體為3654135 bp，pSymA為1354226 bp（結(jié)瘤和固氮），pSymB為1683333 bp。,,,中華苜蓿根瘤菌（,Sinorhizobium meliloti,）1021的基因組組成,,性質(zhì) 染色體 pSymA pSymB 基因組,長(zhǎng)度(bp) 3654135 1354226 1683333 6691694,蛋白基因 3341 1293 1570 6204,tRNA基因 51 2 1 54,rRNA操縱子 3 0 0 3,共生功能 菌毛合成 菌毛合成,表面多糖,結(jié)瘤，固氮,表面多糖,,固氮,,,,,,第2講 質(zhì)粒技術(shù),1. 質(zhì)粒的分離和純化2. 質(zhì)粒的拷貝數(shù)測(cè)定3. 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化4. 細(xì)菌雜交實(shí)驗(yàn)5. 質(zhì)粒的限制酶作圖6. 質(zhì)?；蚨ㄎ?7. 質(zhì)粒測(cè)序和基因注釋8. 質(zhì)?？寺≥d體,,,1 質(zhì)粒的分離和純化,分離： SDS溫和裂解法；堿—SDS室溫裂解法；堿—SDS加熱 (50—65℃) 裂解法；煮沸裂解法；堿—SDS—蛋白酶裂解法。,純化: CsCl—EB密度梯度離心法 (角轉(zhuǎn)頭：40000rpm, 40h；近垂直轉(zhuǎn)頭：78000rpm, 4.5h)；低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收法；凝膠凍溶法；凝膠透析袋回收法；凝膠透析膜回收法；純化kit。,,,細(xì)胞裂解物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，熒光掃描染色體DNA帶和質(zhì)粒DNA帶，根據(jù)峰面積計(jì)算質(zhì)粒占總DNA的百分?jǐn)?shù)(RP)。,RP = (1.36×質(zhì)粒峰面積)÷(染色體峰面積+1.36×質(zhì)粒峰面積),測(cè)定一個(gè)細(xì)胞中總DNA的含量 (Mc = DNA的g數(shù)／細(xì)胞數(shù))。,計(jì)算一個(gè)質(zhì)粒的質(zhì)量：,MP = 質(zhì)粒 bp 數(shù)×660×1.65×10,-24,g,計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)：CP = (MC×RP)÷MP,2 質(zhì)粒的拷貝數(shù)測(cè)定（,凝膠帶熒光光密度測(cè)定法）,,,3 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化,,質(zhì)粒轉(zhuǎn)化主要有3種方法：鈣誘導(dǎo)的感受態(tài)轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，電穿孔轉(zhuǎn)化。影響轉(zhuǎn)化的因素：質(zhì)粒的大小、純度、濃度、構(gòu)型、穩(wěn)定性和是否被修飾；受體細(xì)胞的菌齡、用量、限制-修飾系統(tǒng)和重組功能，是否有不相容性質(zhì)粒，與質(zhì)粒原來(lái)寄主的親源關(guān)系；篩選藥物的濃度。,轉(zhuǎn)化頻率（transformation frequency）：每個(gè)活細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)，測(cè)定時(shí)使用飽和DNA濃度。,轉(zhuǎn)化效率（transformation efficiency）：每,m,g DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)，測(cè)定時(shí)使用亞飽和DNA濃度。,,,4 細(xì)菌雜交實(shí)驗(yàn),濾膜雜交：混合供體和受體菌培養(yǎng)物，用孔徑為0.45,m,m的濾膜過濾，帶菌的濾膜在營(yíng)養(yǎng)平板上培養(yǎng)過夜，用無(wú)菌水洗下膜上的細(xì)菌，涂選擇平板，篩選接合體。,平板雜交：在選擇平板上涂布供體菌和受體菌的混合物或分別劃線受體菌和供體菌，培養(yǎng)過夜，長(zhǎng)出的菌落為接合體。,液體雜交：靜止培養(yǎng)供體菌和受體菌的混合物，然后涂選擇平板，篩選接合體。,例：PpG378 (Leu,-,Nah,+,) × PpG376 (Leu,+,Nah,-,),,,5 質(zhì)粒的限制酶作圖,,制作質(zhì)粒限制圖的方法主要有直接酶切法、重疊片段克隆法和測(cè)序法。直接酶切法是通過限制酶的完全消化和部分消化，確定各種限制酶切割位點(diǎn)在質(zhì)粒中的位置，適用于小質(zhì)粒；重疊片段克隆法是先進(jìn)行限制片段的克隆，確定每個(gè)克隆片段的限制酶位點(diǎn)，以及各克隆片段在質(zhì)粒中的排列順序，最后得到整個(gè)質(zhì)粒的限制圖，適合于較大的質(zhì)粒。最理想的方法是先測(cè)定質(zhì)粒的核苷酸序列，然后根據(jù)限制酶的識(shí)別序列用計(jì)算機(jī)作圖，適合于所有質(zhì)粒，特別是巨型質(zhì)粒。,,,,,,② pND1.860質(zhì)粒的限制酶作圖,（重疊片段克隆法）,作圖策略：,Hin,dⅢ、,Eco,RⅠ和,Xba,Ⅰ單酶消化：測(cè)定限制片段大小和切點(diǎn)數(shù)。,Hin,dⅢ完全消化→片段克隆→,Hin,dⅢ +,Eco,RⅠ消化：確定,Hin,dⅢ片段中的,Eco,RⅠ位點(diǎn),Hin,dⅢ部分消化→片段克?。?Hin,dⅢ消化，確定,Hin,dⅢ片段排列順序,Eco,RⅠ消化，確定,Eco,RⅠ位點(diǎn),,Eco,RⅠ+,Xba,Ⅰ消化，確定,Xba,Ⅰ位點(diǎn),,,6 質(zhì)?；蚨ㄎ唬恨D(zhuǎn)座子插入突變法,,把攜帶轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒引入含有待測(cè)質(zhì)粒的細(xì)胞中，篩選并收集含有插入突變的細(xì)胞，通過限制酶分析確定插入位點(diǎn)，然后測(cè)定含有轉(zhuǎn)座子插入的細(xì)胞其待測(cè)基因是否失活，從而確定基因的大概位置。,,,圖2-10 阿特拉津氯水解酶基因,atzA,的定位,,,,7 質(zhì)粒測(cè)序和基因注釋(annotation),,質(zhì)粒測(cè)序：用鳥槍克隆法，將純化的質(zhì)粒用超聲波打碎，用瓊脂糖凝膠電泳分離 1-２kb片段，補(bǔ)平片段末端，與平末端pUC18連接，電轉(zhuǎn)化,E. coli,DH5α，篩選有插入片段的,轉(zhuǎn)化子,，測(cè)定克隆片段的序列，根據(jù)測(cè)序結(jié)果拼接質(zhì)粒序列，空缺部分用PCR方法補(bǔ)齊并測(cè)序。,質(zhì)?；蜃⑨專合騁enBank注冊(cè)質(zhì)粒序列，報(bào)告每個(gè)編碼序列（CDS，或稱ORF）的基因名稱、位置、功能和翻譯產(chǎn)物。,,,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體,載體的類型：,① 自主復(fù)制的瞬時(shí)表達(dá)載體：帶有真核病毒復(fù)制子。,② 與寄主基因組整合的表達(dá)載體：不含病毒復(fù)制子。,,,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件：,① 原核細(xì)胞復(fù)制原點(diǎn)和篩選基因 (抗生素抗性)。,② 真核啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件。,③ 能進(jìn)行染色體外復(fù)制的病毒復(fù)制子序列。,④ 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的選擇標(biāo)記基因 (抗生素或藥物抗性)。,⑤ 終止和加poly(A)的信號(hào)序列。,⑥ 帶有剪接供體和剪接受體功能位點(diǎn)的內(nèi)含子序列 (用于mRNA剪接),⑦ 多克隆位點(diǎn)。,,,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體對(duì)克隆基因的要求：,① 一般使用cDNA。,② 克隆基因必須帶有天然的 rbs 和單一的起始密碼子AUG。,,,圖2-21 瞬時(shí)表達(dá)載體pMSG,,,,圖2-22 制備等基因表達(dá)的 Flp-In,TM,寄主細(xì)胞系 (invitrogen 公司),,,,圖2-23 制備 Flp-In,TM,表達(dá)細(xì)胞系 (invitrogen 公司),,,,