園林植物快繁技術(shù)

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1、園林植物快繁技術(shù) 導(dǎo)言 1. 課程的性質(zhì)和地位 園林抗物快繁技術(shù)是林業(yè)及園林高新技術(shù)管理專業(yè)必考的重要專業(yè)課程，是一門實踐性，綜合性很強的技術(shù)學(xué)科。與植物生理學(xué)、園林植物栽培學(xué)、苗圃學(xué)、市場學(xué)、管理學(xué)等學(xué)科有著密切的關(guān)系；與此同時，它也有自身學(xué)科的性質(zhì)，特點，內(nèi)容及其內(nèi)在結(jié)構(gòu)，如園林植物快繁的基本概念，基本理論，基本技術(shù)構(gòu)成和應(yīng)用領(lǐng)域等一系列內(nèi)容。因此，在學(xué)習(xí)本課程時要注意力量放在基礎(chǔ)知識的學(xué)習(xí)和應(yīng)用上，緊密聯(lián)系實際和有關(guān)學(xué)科的基礎(chǔ)知識，掌握正確的分析問題，解決問題的方法。 撫育管理 苗木繁殖 苗木繁殖 園林植物培育 有性繁殖 天性繁殖 嫁接繁殖 白根繁殖 快速

2、繁殖 ...... 種質(zhì)貯藏 人工種質(zhì) 快速繁殖 基因工程 細(xì)胞工程 酶工程 發(fā)酵工程 生物技術(shù) 本課程和其他課程的關(guān)系 2．使用教材 （1）.指定教材 陳振光主編 園藝植物離體培育學(xué) 中國農(nóng)業(yè)出版社 1991 (2) .參考書籍 白寶璋 葉尚紅 王玉國主編 植物生理學(xué) 中國農(nóng)業(yè)出版社 1996 陳正峰 木本植物組織極其應(yīng)用 高等教育出版社 1986 曹孜義 劉國民主編 實用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程 甘肅科學(xué)技術(shù)出版社 2001 2. 教

3、材體系 根據(jù)教材內(nèi)在的結(jié)構(gòu)和便于學(xué)員學(xué)習(xí)的需要，本教材分為六部分： 緒論 第一章 離體培養(yǎng)的基本操作方法 第二章到第五章 根據(jù)外植體差異而劃分的離體培養(yǎng)技術(shù)體系 第六章到第九章 離體培養(yǎng)的基本概論和原理 第十章到第二十五章 各論部分 主要介紹一些有代表性的園藝植物種類離體培養(yǎng)，連同書本附表作為資料供學(xué)員參考 緒 論 通過本部分學(xué)習(xí)，了解植物離體培養(yǎng)學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展，理解其與其它學(xué)科和園藝（園林植物）生產(chǎn)的關(guān)系，掌握植物離體培養(yǎng)學(xué)的含義。 一、 園藝植物離體培養(yǎng)學(xué)的基本含義 1. 植物離體培養(yǎng) 指通過無菌操作，使植物體的各類結(jié)構(gòu)材料（外植體）接種于人工配制的培養(yǎng)基上

4、，在人工控制的環(huán)境條件下，進行離體培養(yǎng)的一套技術(shù)與方法，通常稱之為植物組織培養(yǎng)式植物的細(xì)胞與組織培養(yǎng)。 2. 離體培養(yǎng)技術(shù)體系 胚胎培養(yǎng)及以胚胎為基礎(chǔ)的培養(yǎng)技術(shù) 器官及器官原基培養(yǎng) 組織培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng) 原生質(zhì)培養(yǎng)及以原生質(zhì)體為基礎(chǔ)的培養(yǎng)技術(shù) 3. 離體培養(yǎng)的應(yīng)用 多種的繁育與脫毒 種質(zhì)資源的貯存 細(xì)胞次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn) 細(xì)胞工程和基因工程的生物技術(shù)育種 遺傳學(xué)和生物學(xué)基礎(chǔ)的研究 二、 園藝植物離體培養(yǎng)學(xué)的形成與發(fā)展 （一）、植物離體培養(yǎng)的淵源及其早期的實踐 1902年、Haber landt提出了細(xì)胞全能性的觀點，并首次進行植物細(xì)胞培養(yǎng)實驗。 （二

5、）、植物離體培養(yǎng)基本技術(shù)體系的形成 1934年White首次建立了番茄的無性繁殖系 1937年White發(fā)現(xiàn)B族微生物素和吲保乙酸對離體培養(yǎng)的作用 1934—1939年White等人初步建立起植物離體培養(yǎng)的基本方法 1943年White發(fā)表了第一部植物離體培養(yǎng)專著《植物組織培養(yǎng)手冊》又重新提出了細(xì)胞全能性。 1957年skaog建立了器官分化的激素配比模式。 1953年Muir報道了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法。 （三） 園林植物離體培養(yǎng)學(xué)科的建立 1、完善離體培養(yǎng)技術(shù)、探索理論基礎(chǔ)

6、 1964—1966年誘殺未成熟花粉形成單位體植株。 1960年分離番茄動根原生質(zhì)體獲得成功， 1978年首先獲得了體細(xì)胞雜種——“potamato”. 植物細(xì)胞全能性為基因轉(zhuǎn)化提供方便。 2、開拓應(yīng)用研究 生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛，最成功的領(lǐng)域是離體快速繁殖。 三、 植物離體培養(yǎng)學(xué)與園藝科學(xué)的關(guān)系 （一）、離體培養(yǎng)與園藝植物良種繁育學(xué) （二）、離體培養(yǎng)與園藝植物育種學(xué) （三）、離體培養(yǎng)與園藝植物基礎(chǔ)學(xué)科 第一章 離體培養(yǎng)的基本操作方法 通過學(xué)習(xí)，理解和掌握離體培養(yǎng)的基本操作方法包括：一般的材

7、料選取、無菌技術(shù)、培養(yǎng)基配置和環(huán)境條件調(diào)控為園林植物快繁技術(shù)打下基礎(chǔ)。 第一節(jié) 外植體的選擇與處理 外植體 植物離體培養(yǎng)中的各種接種材料，包括植物體各個器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。 （一） 外植體的選擇 1、 選擇優(yōu)良的種質(zhì) 主要的園藝植物 選取性優(yōu)良的種質(zhì)先特殊的基因型 要有明確目的 具有一定的代表性 2、 選擇建壯的植株 生長建壯的無病蟲害的植株 正常的器官和組織 多年生植物應(yīng)從成年樹上取材 3、 選擇外植體的大小 對植體太大易污染 太小多形成愈傷組織 外植體大小在0.5——1.0cm。 4、 選

8、取對植體的時期 一般按照植物生長的最適時期取材 含酚類物特多的植物，應(yīng)在酚類物含量低的季節(jié)取材 從種苗圃推算苗期，增殖代數(shù)等因數(shù)，確定選取外植體的合適時期。 5、 選擇細(xì)胞[培養(yǎng)材料 通常根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的目的 選擇細(xì)胞培養(yǎng)材料 多數(shù)采用莖類分生組織和胚胎培養(yǎng)的愈傷組織作為細(xì)胞培養(yǎng)的起始材料。 為了生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物，則選取某次生物質(zhì)含量高的特定器官或組織。 （二）、培養(yǎng)材料的處理 1、母株的預(yù)處理 促使母株的生長帶謝活躍 方便取材 容易滅菌 降低污染

9、率 2、外植體休眠期的處理 通常采用低溫或者赤霉藥劑進行處理 ， 3、外植體的滅菌 進行嚴(yán)格的滅菌 林料來源 取材部位 取材季節(jié) 第 二節(jié) 培養(yǎng)莖的制備 一、 培養(yǎng)莖的種類及組成 1. 培養(yǎng)莖 外植體生長的營養(yǎng)物質(zhì)，通常有兩個水平，一是基本培養(yǎng)莖包括大量元素和微量元素，維生素和氨基酸，還有糖和水。二是完全培養(yǎng)莖，即在基本培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，根據(jù)各種不同實驗要求，附加一些物質(zhì)，如各種植物生長調(diào)節(jié)

10、劑以及其它的復(fù)雜有機附加物，外植體生長的營養(yǎng)物質(zhì)。 基本培養(yǎng)莖 大量元素+微量元素+維生素+氨基酸+糖+水 完全培養(yǎng)莖 基本培養(yǎng)莖+植物生長調(diào)節(jié)劑（有機附加物） 2. 固體培養(yǎng)莖和液體培養(yǎng)莖的比較 固體培養(yǎng)莖 設(shè)備簡單 使用方便 充分利用培養(yǎng)容器中的養(yǎng)分 易選成自我毒害 液體培養(yǎng)莖 需要一定的設(shè)備 有利于外植株的生長 避免上述固體培養(yǎng)莖的缺點 3. 常見培養(yǎng)莖配方 （參見教材附錄2） 二、 配制培養(yǎng)莖的準(zhǔn)備工作 （一）、器皿和用具的準(zhǔn)備 主要器具：燒杯、容量瓶、移液管、滴管、試管 器具的準(zhǔn)備： 清潔

11、 烘干 （二）、水和藥品 水原則上用純水，一般用蒸餾水即可 化學(xué)藥品用分析，純或化學(xué)純 （三）、貯備液的配制 1.貯備液的類型 大量元素 擴大10—50倍 微量元素 擴大100倍 鐵鹽 擴大100倍（FeSO4.7H2O+Na2—EDTA） 植物生長調(diào)節(jié)劑 0.5mg/ml 2.貯備液的配制 分別稱量 溶解 混合 儲存 三、配制培養(yǎng)莖的方法 少量蒸餾水溶解蔗糖倒入1000ml容量瓶 吸取各種貯備液放入容量瓶 定容 轉(zhuǎn)移

12、到大燒杯與瓊脂加熱溶解 PH調(diào)整 分袋 滅菌 保存?zhèn)溆? 第二節(jié) 無菌技術(shù) （一）、無菌室 無菌室的組成：包括無菌操作室和無菌培養(yǎng)室 無菌室的要求：墻壁光滑 地面平坦 門窗密閉 無菌室的滅菌：2％新潔爾滅擦洗 75％乙醇噴霧 紫外燈照射： 定期使用甲醛和高錳酸鉀熏蒸 （二）、試材和器具的滅菌 1.培養(yǎng)莖的滅菌 采用高溫高壓滅菌鍋 工作壓力為1.1kg/c㎡（120℃）保質(zhì)15—20min 注意排盡冷空氣 滅菌完畢 冷卻 備用 2.特殊藥品的滅菌 高溫下易分解和變質(zhì)

13、的藥品 過濾除菌：溶液通過孔徑為0.20—0.45um的過濾網(wǎng) 抽濾除菌：用真空泵產(chǎn)生抽力，使溶液通過過濾網(wǎng) 3.器皿（具）滅菌 常用干熱滅菌法 工作條件為160℃/hr 注意用牛皮紙等包扎好器皿（具） 4.外植體的滅菌 （1）75％乙醇 潤浸和殺菌作用 30s （2）氯化汞 濃度為0.1％ 5—10min，無菌水沖洗3—5次 （3）次氯酸鈉 濃度2—10％ 15—30min ，無菌水沖洗3—5次 （三）無菌操作 1. 無菌操作前10min先使超凈工作臺處于工作狀態(tài)。 2. 穿戴好工作衣帽后，用70％酒精檫拭雙手個工作臺面

14、。操作期間，也應(yīng)在檫拭數(shù)次。 3. 撥塞前，要用火焰灼熱瓶口，用硫酸紙等做瓶蓋的，應(yīng)在火焰附近打開蓋子。 4. 操作時，試管口應(yīng)略略向下，避免塵埃殺菌落入管內(nèi)，又便于操作。 第四節(jié) 環(huán)境條件的操作 （一）光照 1. 光照時間：12—16hr 2. 光照強度：1000—5000/x 3. 光照長短（光源）：日光燈 （二）溫度 一般控制在25±2℃恒溫條件下培養(yǎng) （三）濕度 瓶內(nèi)一般可達到100％，避免環(huán)境濕度過小，防改瓶內(nèi)失水 （四）汽體 避免培養(yǎng)室內(nèi)存在有氨氣體 第二章 胚胎培養(yǎng)和離體受精 通過學(xué)習(xí)，了解胚珠和子房培養(yǎng)，離體受精的胚胎培養(yǎng)技術(shù)，理解和掌握胚

15、培養(yǎng)，胚乳培養(yǎng)的胚胎培養(yǎng)技術(shù)。 第一節(jié) 離體胚培養(yǎng) （一）胚培養(yǎng)的意義 1. 促使發(fā)育不良或中途敗育的胚發(fā)育成熟 分離發(fā)育不良的種子或即將敗育前的種胚進行培養(yǎng)，促使胚繼續(xù)發(fā)育至成熟，使雜交育種或遠保雜交獲得成功，特別對于敗育胚進行早期離體培養(yǎng)，在遺傳和育種上均具有重要意義。 2.打破休眠期促進胚萌發(fā) 對于有休眠期的種子，可通過胚培養(yǎng)。促使休眠種子提早萌發(fā)成苗，縮短育種周期或加速繁育良種。 3.克服多胚品種珠心胚的干擾 具有多胚發(fā)育受阻，其珠心胚可以侵入胚囊，使合子胚發(fā)育受阻影響雜交育種工作。利用胚胎培養(yǎng)技術(shù)，早期分離合子胚培養(yǎng)，排除珠心胚干擾，獲得雜種胚。 4. 快速繁殖良

16、種胚末 5. 誘導(dǎo)胚性愈傷組織 離體胚培養(yǎng)的發(fā)育途徑： 按正常胚胎發(fā)育途徑形成植株 合子 球形胚 心形胚 魚雷形胚 子葉形胚 再生植株 胚胎脫分化形成愈傷組織 胚“早期萌發(fā)” 成熟胚的培養(yǎng)：材料的消毒與接種，培養(yǎng)莖，種胚培養(yǎng)的外界條件 原胚培養(yǎng)： 基本培養(yǎng)莖：MS改良White培養(yǎng)莖；培養(yǎng)莖的滲透應(yīng)用蔗糖調(diào)整，用量在8—10％ 生長調(diào)節(jié)：及其它附加物的影響 生長調(diào)節(jié)：種類、濃度、比例 附加物：天然提取物 第二節(jié) 胚乳培養(yǎng) 一、 胚乳培養(yǎng)的用途 1. 誘導(dǎo)分化植株，證明細(xì)胞全能性的理論。 2. 研究胚與胚乳的相生關(guān)系，胚乳組織的功能。

17、3. 再生的植株多為三倍體，有可能產(chǎn)生無籽果實。 4. 育種和性狀遺傳規(guī)律研究。 二、 胚乳培養(yǎng)材料的選擇：細(xì)胞型期 三、 胚乳愈傷組織的誘導(dǎo) 四、 器官分化再生植株 五、 胚乳再生植株的染色體胚性 第三章 器官和組織培養(yǎng) 器官培養(yǎng)：是植株物某一器官的全部或部分或器官原基的培養(yǎng) 組織培養(yǎng)： 廣義：各種類型外植株的培養(yǎng)。 狹義：各種器官組織，以及其培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織的培養(yǎng) 第一節(jié) 莖尖培養(yǎng) 莖尖培養(yǎng)：此概念應(yīng)注意莖尖的含義。 一、 建立無菌材料 二、 莖尖的發(fā)育方向及調(diào)節(jié) 1.腋芽萌芽 2.脫分化后產(chǎn)生胚狀體 3.脫分化后直接產(chǎn)生不定器官

18、4.脫分化形成愈傷組織 三、 生根成苗及移栽 促進生根的措施：①降低基本培養(yǎng)培養(yǎng)基無機莖濃度 ②調(diào)節(jié)生長素濃度 ③添加吸附劑 ④減少瓊脂用量 第三節(jié) 固相化細(xì)胞培養(yǎng) 固相化細(xì)胞：把細(xì)胞固定在一種惰性基質(zhì)，如瓊脂、藻酸鹽、纖維或膜上面或里面、細(xì)胞不能運動，而營養(yǎng)液可以在細(xì)胞間流動，供應(yīng)其營養(yǎng)。 一、 固相化細(xì)胞培養(yǎng)的特點 二、 固相化細(xì)胞系統(tǒng) 第三節(jié) 單細(xì)胞培養(yǎng) 單細(xì)胞培養(yǎng)：也稱單細(xì)胞可隆技術(shù)，它不是指培養(yǎng)的只有單個細(xì)胞，而是指接種的細(xì)胞群體中，不存在懸浮培養(yǎng)中所可能存在的小細(xì)胞團。而是純碎的單細(xì)胞。個單離細(xì)胞不僅僅只是在增殖階段，它可被誘導(dǎo)再分化，形成完整

19、植株。 一、 單離細(xì)胞的方法 二、 單離細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)方法 三、 培養(yǎng)細(xì)胞的密度及生活率的測定 第五章 原生質(zhì)培養(yǎng)與融合 第一節(jié) 原生質(zhì)體分離 一、 用以游離原生質(zhì)的材料來源 二、 酶混合液 三、 游離原生質(zhì)體的一般技術(shù)程序 四、 花粉原生質(zhì)體的分離 第二節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng) 一、 培養(yǎng)莖 二、 培養(yǎng)方法 三、 原生質(zhì)體的培養(yǎng)結(jié)果及其觀察 第二節(jié) 原生質(zhì)體融合： 原生質(zhì)體融合：也稱體細(xì)胞雜交，就是使分離下來的不同親本的原生質(zhì)體之間在人工控制的條件下，象形細(xì)胞受精作用那樣及相融合為一體。 無機鹽誘導(dǎo)融合 聚乙二（PEG）與PH的Ca＋＋相結(jié)合的誘導(dǎo)融合方

20、法 電融合技術(shù) 雜種細(xì)胞的選擇和體細(xì)胞雜種的鑒定 第 六 章 細(xì)胞全能性及其營養(yǎng)代謝 第一節(jié) 植物細(xì)胞全能性 一、 植物細(xì)胞全能性：植物細(xì)胞具有該植物有機體的全部遺傳信息，并具有形成植物有機體所有細(xì)胞類型，自然發(fā)育成完整植株的能力。 二、 植物細(xì)胞全能性的展觀和利用 外植體在腋芽萌發(fā)等情況下直接發(fā)育成苗，還克以在異養(yǎng)條件下脫分化，形成愈傷組織，愈傷組織可以再分化，也可以游離原生質(zhì)體。用以遺傳操作，或游離細(xì)胞用以次生物質(zhì)生產(chǎn) 操作的原生質(zhì)體和細(xì)胞均可象愈傷組織一樣，實現(xiàn)再分化，再分化可以是胚狀體途徑。也可是不定器官途徑，前者可以用以制備人工種子。胚狀體和不定器官均可以種

21、質(zhì)保存，也均可形成試管苗，用以快速無性繁殖。試管苗方式培育成為進行植物生命周期一樣的成年植株，開花結(jié)果，完成離體培養(yǎng)周期。 第 二 節(jié) 培養(yǎng)物的營養(yǎng) 一、 碳源 碳源物質(zhì)以糖類物質(zhì)最重要。一般的說，蔗糖是最好的糖源，其次是葡萄糖，果糖。糖的濃度一般為2—4℅ 二、 氯源 硝態(tài)氮 銨態(tài)氮 氨基酸 有機復(fù)合物 三、無機營養(yǎng) 大量元素和微量元素 四、維生素 VB1 VB6 五、生長調(diào)節(jié)劑 生長素類：1AA 1BA NAA 2，4—D 細(xì)胞分裂素類： 6—BA KT ZT ZIP 第三節(jié) 培

22、養(yǎng)物的次級代謝 一、 次級代謝概況及生物轉(zhuǎn)化舉例 二、 次級代謝的調(diào)節(jié) 1. 初級代謝對此基代謝的調(diào)節(jié) 2. 次級代謝的酶促調(diào)節(jié) 3. 環(huán)境因素對次級代謝的調(diào)節(jié) 第七章 外植體的脫分化與生長 第一節(jié) 外植體脫分化 一、 誘導(dǎo)期間的細(xì)胞生物質(zhì)變化 1.氣體變換率的增加， 2.RNA隨體的合成 3.過氧化物酶的增加 4.蛋白質(zhì)的活躍合成 5.酚類物質(zhì)的增加 6.乙烯增加 第 二節(jié) 愈傷組織的生長 第三節(jié) 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長 一、 成批培養(yǎng)的細(xì)胞生長動態(tài) 1. 生長周期 2. 生長周期中指數(shù)生長的數(shù)字表述 3. 生長周期中的不平衡

23、生長 二、連續(xù)培養(yǎng)下的細(xì)胞生長 1長動力學(xué)描述 2學(xué)恒定與濃度恒定 三、 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞周期 第八章 培養(yǎng)物再分化 再分化：是指離體培養(yǎng)物由脫分狀態(tài)再度分化。再分化可在細(xì)胞水平，組織水平和器官水平遞進地進行，最后再生完整植株。培養(yǎng)物的再分化，通過胚胎發(fā)生和直接分化器官再形成植株這兩個途徑實現(xiàn)。 第一節(jié) 細(xì)胞分化和組織分化 一、 細(xì)胞分化 1. 導(dǎo)管分子的分化及其影響因素 （1）生長調(diào)節(jié)劑 ①生長素 ②細(xì)胞分裂素 ③其它生長調(diào)節(jié)劑 （2）糖類物質(zhì) （3）其它理化因子 ①光的效應(yīng) ②溫度的效應(yīng) ③PH 2. 細(xì)胞分化過程及其機理 二、 組

24、織分化 1. 擬分組織：是指培養(yǎng)物中出現(xiàn)的類擬分生組織的細(xì)胞群，它是脫分化后的培養(yǎng)物發(fā)生的一系列細(xì)胞分裂而產(chǎn)生的一團小型、薄壁、液泡小、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色較深的細(xì)胞組成，它具分化上的可塑性。 2. 維管組織結(jié)節(jié)：是一個區(qū)域的愈傷組織轉(zhuǎn)化為韌皮分子和木質(zhì)分子的混合體結(jié)構(gòu)，這樣的形成層狀的細(xì)胞向外延伸與擬分生組織連接，形成根原基或牙原基。可以認(rèn)為維管結(jié)節(jié)是試管植株的維管束的前力。 3. 擬分生組織和維管組織是連接細(xì)胞分化和器官分化的“橋梁” 第二節(jié) 器官分化和植株形成 一、 莖、根器官的分化 1. 器官分化的調(diào)控 （1） 控制器官分化的激素模式——生長素/激動素，生長素/激動素的

25、相對高水平，有利于根的形成，反之，有利于地上部的形成。在使用中注意二者的種類，濃度及其比例。 （2） 培養(yǎng)基組分和附加物的作用 提高無機P含量促進器官分化，糖的平衡可逆轉(zhuǎn)生長素/激動素的比例；不加還原氮利于根的形成。一些生理活性物質(zhì)下可促進培養(yǎng)物的器官發(fā)生。 （3） 物理環(huán)境：一般固態(tài)培養(yǎng)基有利于器官變化。光對器官分化有重要影響。1000—15000lx是許多培養(yǎng)物的合適光照。16hr光照符合器官發(fā)生要求，連紫外線和藍光刺激芽的發(fā)生，而紅光顯著地促進長根，一般日光燈提供光源，一般25℃左右的培養(yǎng)溫度。 2. 器官分化過程中的生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)變化 二、 植株的形成 體

26、 發(fā)育為植株 具根莖兩極器官 植株 外植體脫分化 不定器官 單極器官 光莖后根 植株 先根后莖 植株 第三節(jié) 離體胚胎發(fā)生 一、 各種培養(yǎng)類型的離體胚發(fā)生 1. 對植體直接發(fā)生二倍體胚 2. 愈傷組織產(chǎn)生胚狀體 3. 懸浮細(xì)胞產(chǎn)生胚 4. 單倍體胚胎發(fā)生 二、 影響離體胚胎發(fā)生的因素 1. 外部因素 （1）生長調(diào)節(jié)劑的作用 （2）氮源 （3）其它因子 2. 內(nèi)部因素 （1）細(xì)胞的隔離 （2）遺傳基因

27、型的影響 （3）外植體來源和年齡 （4） 其它因素 三、 離體胚胎發(fā)生的機制 第九章 培養(yǎng)物的遺傳與變異 第一節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞變異 一、 培養(yǎng)細(xì)胞高頻率變異的起因 1. 原來具不同檢型的細(xì)胞杯誘導(dǎo)分裂 2. 培養(yǎng)條件引起新的異樣 二、 培養(yǎng)細(xì)胞變異的遺傳機理 1. 染色體斷裂，染色體數(shù)增加 2. 染色體斷裂，染色體數(shù)減少 3. 染色體斷裂，并引起染色體數(shù)改變 4. 染色體斷裂，但并不引起染色體數(shù)目的變化 5. 體細(xì)胞核內(nèi)再復(fù)制 6. 單個核基因的突變 7. 轉(zhuǎn)座子的作用 第二節(jié) 花粉植株的遺傳變異 一、 花粉植株的遺傳穩(wěn)定性問題 二、 花粉植株的變異

28、 三、 單倍體植株的減數(shù)分裂分析 第三節(jié) 體細(xì)胞融合體的遺傳變異 一、 異核體的和染色體形成 1. 核分裂同步、核融合，且親本的染色體未出觀不親和觀象 2. 核分裂同步（相同或互影響后同步）核融合，但在不同培養(yǎng)期發(fā)生染色體變化（染色體重組或丟失）。 3. 核不融合，且兩個核間重又產(chǎn)生新膜、兩個子細(xì)胞的以后各自分裂。 4. 核不融合，形成多核細(xì)胞。細(xì)胞周期混亂 二、 胞質(zhì)基因組的分裂與重組 第十章 離體培養(yǎng) 離體繁殖：也稱微型繁殖或快速無性繁殖，是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重要組成之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的一個領(lǐng)域。 第一節(jié) 離體繁殖的特點及其應(yīng)用 （一）離體繁殖的特點

29、1．繁殖速度快 2. 占用空間小 3. 便于種質(zhì)貯存和交換 4. ]離體繁殖誘變 5. 培育無病毒苗 （二） 離體繁殖在園藝上的應(yīng)用 第二節(jié) 外植株的類型與發(fā)育途徑 （一） 外植體的類型 傳統(tǒng)的良種繁殖器官組織 （二） 外植體發(fā)育的途徑 1.腋芽的萌發(fā) 外植體培養(yǎng)中最普遍的是誘發(fā)腋芽萌發(fā)生長。腋芽的繁殖系數(shù)不僅受腋芽萌發(fā)數(shù)目限制，同時與續(xù)代培養(yǎng)的時間長短有關(guān)。續(xù)代時間短、繁殖系數(shù)則高。 2、不定芽的產(chǎn)生 不定芽來自原基或分生組織等，直接分化成芽苗。 3.離體胚胎發(fā)生 胚狀體具有胚芽和胚根的兩極原基。胚胎發(fā)育可形成完整植株，因此是最快的植株再生途徑，也是外植體增

30、殖系數(shù)最大的發(fā)育途徑。 第三節(jié) 離體繁殖的技術(shù)與方法 一、 無菌材料的建立 （一）材料的選取 1.必須選取優(yōu)良的母株 2.種源可靠 3.性狀穩(wěn)定 4.生長健壯 5.成年的母株，切忌用實生苗繁殖良種 （二）材料的滅菌 1.消毒前，去掉外植體表面帶菌鱗片及過多的枝葉，然后用肥皂水沖洗 2.采用水培材料 3二次消毒法即材料用消毒劑處理后，用清水沖洗再用低濃度次氯酸鈉沖洗一次立即接種 4. 添加抗菌劑或吸殺菌劑進行消毒 5. 還應(yīng)注意防治褐變 （三）培養(yǎng)莖 一般建立無菌株原的培養(yǎng)基多采用White或MS培養(yǎng)基，并附加低濃度的生長素或細(xì)胞分裂素，誘導(dǎo)無菌材料建立繁

31、殖系，初步續(xù)代培養(yǎng)，擴大繁殖材料 二、培養(yǎng)材料的增殖 是良種無性快繁的重要環(huán)節(jié)。增殖的結(jié)果要求提供大量的遺傳性穩(wěn)定，整齊一效的種苗。因此，須考慮以下幾個因素 （一）增殖的方式 增殖的方式有四種途徑，即腋芽的萌發(fā)，產(chǎn)生不定根和胚胎發(fā)生以及原球莖增殖途徑 （二）增殖的培養(yǎng)基及附加物 1.增殖的基本培養(yǎng)莖 2.植物生長調(diào)節(jié)劑 （三）增殖培養(yǎng)的其它因素 1.增殖體的大小與續(xù)代培養(yǎng)的間隔 2培養(yǎng)的光照與溫度：溫度為25℃左右 光照為12hr 四、增殖培養(yǎng)注意事項 1.芽苗的變異 2.玻璃苗的控制 ①提高瓊脂的濃度②降低細(xì)胞分裂素濃度③培養(yǎng)基添加低濃度多效唑 三、苗芽生

32、根培養(yǎng) （一）基本培養(yǎng)基 誘導(dǎo)生根的基本培養(yǎng)基，需降低無機鹽濃度，有利于根的分化，一般用1/2或1/4MS 培養(yǎng)的大量元素 （二）生長調(diào)節(jié)劑 通常不用細(xì)胞分裂素，添加低濃度的生長素。 （三）其他附加物 1.添加活性炭有利于生根，2.間苯三酚等有利于生根，3.生根培養(yǎng)的溫度一般要比芽增殖所需溫度略低一些。 四、小苗移馴化 試管苗的移植是從“異養(yǎng)”到“自養(yǎng)”的轉(zhuǎn)變，需要有一個逐步適應(yīng)的過程。移植之前，試管苗必須提高光強進行煉苗，同時進一步將瓶口包扎物打開進行煉苗。移植時，首先把附著干根部的瓊脂沖洗干凈，同時注意避免根莖部破傷。移

33、苗的土壤要求保水，透氣，以利小苗生長。移植的小苗注意溫度和光照的馴化，即溫度逐漸降低，光照強度逐步加強。 第四節(jié) 人工種子的研制 一、 研制人工種子的意義 （一） 概念 狹義：將植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體，包裹在含有養(yǎng)分和具有保護功能的種皮中，在適宜條件下能夠發(fā)芽出苗的顆粒體。 廣義：人工種子包括胚狀體、芽體及小鱗莖，用凝膠包裹成球體或塊狀或其他形狀的種物。 （二） 意義 三、 人工種子制作方法及其程序 （一） 研制流程 體細(xì)胞胚胎發(fā)生→體細(xì)胞胚胎同步化→體細(xì)胞胚分選→體細(xì)胞胚包裹人工胚乳→包裹外膜→種子貯存→種子播種萌發(fā)。 （二） 體細(xì)胞胚的發(fā)生系統(tǒng) 1.人工種

34、子對胚狀體的要求 2.胚狀體的發(fā)生與同步化的篩選 ① 控制培養(yǎng)莖成分及激素；②密度梯度離心法進行大小胚分離篩選；③過濾分選或儀器分選法等等。 （三） 人工種皮 一般是指人工種子中胚狀體及其類似物以為的部分的統(tǒng)稱。 以海藻酸鈉、明膠、樹膠、Gelrite為最佳，包制人工種子的方法有：干燥法、離子交換法和冷卻法。 （四） 人工種子貯存 第十一章 離體培育無病毒苗 第一節(jié) 培育無病毒苗的意義 一、 園藝植物病毒病的嚴(yán)重性 二、 脫出病毒的研究概況 １. 化學(xué)殺菌劑?。?種子繁殖　３.熱處理 三、 離體培養(yǎng)脫毒的意義 離體培養(yǎng)脫毒是園藝植物生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)，是常規(guī)良種繁

35、殖的一個重要程序。 第二節(jié)　脫除病毒的方法 一、 莖尖分生組織脫毒原理 １. 莖尖培育脫毒原理 病毒在植株上的分布是不均一的，在幼嫩的組織比成熟的組織含量低。莖尖分生組織幾乎不帶毒。其原因為： ⑴. 分生組織的細(xì)胞生長速度快，病毒在植物體內(nèi)繁殖的速度相對較慢； ⑵. 病毒的傳播是靠篩管組織進行轉(zhuǎn)移。或通過細(xì)胞間連續(xù)傳遞給其他細(xì)胞，因此病毒的傳遞擴散也受到一定影響。 ２. 莖尖脫毒的方法 關(guān)鍵是莖尖的大小，即要考慮脫毒效果，又要注意莖尖離體培養(yǎng)的成活率。一般切取0.2—0.5mm，帶1—2個葉原基的莖尖作材料。為了提高效率，可與熱處理結(jié)合使用。 第三節(jié) 脫毒菌的鑒定 一、 無

36、病毒株原的鑒定 １. 指示植物鑒定法 ２. 抗血清鑒定法 ３. 電子顯微鏡檢查法 二、 脫毒苗農(nóng)藝性狀鑒定 １. 通過不同途徑脫毒處理，可能導(dǎo)致良種種性的改變。 ２. 無病毒鑒定后，必須進行田間農(nóng)藝性狀鑒定，才能應(yīng)用。 ３. 脫毒苗的農(nóng)藝性狀鑒定必須在隔離的環(huán)境條件下進行。 ４. 脫毒苗鑒定圖的任務(wù)： ⑴. 選擇與親本相同的優(yōu)良經(jīng)濟性狀的植株 ⑵. 淘汰非親本性狀的劣質(zhì)植株 ⑶. 發(fā)現(xiàn)不同于親本的優(yōu)良性狀的突變系。 ５. 對可脫毒苗后代新生系的選擇材料，還有必要作進一步的抗性鑒定等等。 第四節(jié) 無病毒原種的保存和應(yīng)用 一、 無病毒原種的保存 １. 隔離種植保存

37、⑴. 自然環(huán)境進行隔離種植保存 ⑵. 采用隔風(fēng)網(wǎng)室（300目沙網(wǎng)）種植保存。 ２. 離體保存 二、 無病毒原種的應(yīng)用 １. 無病毒原種的繁殖：建立嚴(yán)格的原種繁育制度，防治病毒在感染。 ２. 無病毒原種的推廣 可以參照新品種反之推廣制度，特別注意采取嚴(yán)密的防止病毒重復(fù)翻然的有關(guān)措施，才能取設(shè)預(yù)期的效果。 第十二章 離體保存種質(zhì)資源 第一節(jié) 離體保存種質(zhì)的意義 一、 種子（種植）保存法的局限性 １. 種子的生活力隨貯存物的延長逐漸喪失； ２. 無性繁殖的植物難以用種子保存； ３. 種子貯存易遭受自然災(zāi)害而丟失； ４. 種植保存需大量土地，花費巨大的人力、物力進行管理，

38、但易受病蟲害而毀壞，也不便于種質(zhì)交換 二、 試管保存的優(yōu)點 １. 試管內(nèi)保存無性系，占用空間小，可貯存大量種質(zhì)資源； ２. 可以排除病蟲，便于國際種質(zhì)交流 ３. 生產(chǎn)上需要可立即進行快速大量繁殖 ４. 保存費用低廉。 第二節(jié) 限制生長保存方法 一、 培養(yǎng)基添加生長抑制劑 二、 提高培養(yǎng)基滲透區(qū) 三、 降低培養(yǎng)瓶內(nèi)氧分區(qū) 四、 培養(yǎng)物干燥保存 第三節(jié) 中低溫調(diào)控生長保存 一般用1—9℃低溫保存外體或結(jié)合提交培養(yǎng)基滲透區(qū)。該方法是用于保存中短期的種植材料。 第四節(jié) 超低溫保存種質(zhì) 一、 超低溫保存的基本原理和主要環(huán)節(jié) 液氮中幾乎所有細(xì)胞的代謝活動，生長過程停止了，僅保

39、存細(xì)胞的活動和形態(tài)發(fā)生的潛能，排除細(xì)胞的遺傳變異。 二、 超低溫保存技術(shù) １. 保存材料的選取 ２. 冷凍前材料的預(yù)處理 ３. 添加冷凍防護劑 ４. 材料冷凍的方法 ５. 材料保存 ６. 保存材料解凍 ７. 保存材料復(fù)蘇培養(yǎng) 第十三章 離體培養(yǎng)在品種改良上的應(yīng)用 第一節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞變異系的利用 一、 自發(fā)變異系的利用 在離體培養(yǎng)中，變異細(xì)胞可高頻率的表現(xiàn)出來。只要加以一定分離選擇，就可以利用變異系進行品種改良。 二、 培養(yǎng)細(xì)胞的人工誘發(fā)突變 １. 誘變劑類型及其處理 ２. 細(xì)胞突變體的分離篩選方法 ⑴直接選擇法 ⑵間接選擇法 ３. 有應(yīng)

40、用潛力的突變系的選擇和利用 ⑴. 涉及優(yōu)質(zhì)，高產(chǎn)等性狀的突變系 ⑵. 抗性突變系 ⑶. 抗氨基酸及其類似物，嘌哈和嘧啶類似物的突變系 第二節(jié) 遺傳轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化：該詞原是指一個細(xì)菌品系由于吸收了另一個細(xì)菌品系的NDA而發(fā)生遺傳性狀改變的現(xiàn)象。現(xiàn)在一般認(rèn)為：凡外源NDA導(dǎo)入細(xì)胞的過程都可指轉(zhuǎn)化，包括用原生質(zhì)體融合的方法把整個核導(dǎo)入細(xì)胞。 一、 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移核、質(zhì)基因組 １. 通過原生質(zhì)體融合培育抗兵新品種或合成新品種。 ２. 通過原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)基因控制的性狀。 ３. 原生質(zhì)體攝取外源細(xì)胞器。 二、 直接轉(zhuǎn)化 １. 目的基因的分離 ２. 基因直接轉(zhuǎn)化法 ３. 轉(zhuǎn)化基因

41、材料的分析與鑒定 三、 載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 １. Ti質(zhì)粒及其改建 ⑴. 去除T-DNA區(qū)的激素基因； ⑵. 保留T-DNA的左右邊界，尤其是左邊界； ⑶. 在去除的T-DNA區(qū)，增加可以在植物體內(nèi)表達的選擇基因； ⑷. 在T-DNA區(qū)加一個可以克隆外源自的基因的多聚接口； ⑸. 在T-DNA區(qū)外加一個抗菌素的基因，用以標(biāo)記這個質(zhì)粒，這個基因只能在細(xì)菌內(nèi)表達，而不能在植物體內(nèi)表達。 ２. 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 ３. 植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化體的檢測。 第十四章 離體培養(yǎng)生產(chǎn)次生物質(zhì) 第一節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生物質(zhì)的意義及特點 一、 利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生物質(zhì)的意義 細(xì)胞培養(yǎng)次生物質(zhì)

42、優(yōu)點（與栽培植物相比）： １. 細(xì)胞培養(yǎng)在人工控制的環(huán)境條件下進行，不受氣候等限制。 ２. 減少占用大量土地以及栽培植物的管理。 ３. 細(xì)胞生長可自動化控制，在代謝過程中可進行合理調(diào)節(jié)，提高生產(chǎn)率，并可得到穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量。 ４. 細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)系統(tǒng)較規(guī)范化，可根據(jù)市場供銷情況有計劃的調(diào)控。 第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)技術(shù) 一、 一般發(fā)酵罐的生產(chǎn)程序 １. 細(xì)胞株系建立 ２. 擴大培養(yǎng) ３. 大罐培養(yǎng) ４. 產(chǎn)品提取與純化 二、 篩選高產(chǎn)細(xì)胞系 三、 采用高效率的培養(yǎng)方法 １. 二步培養(yǎng)法 ２. 培養(yǎng)基中添加前提； ３. 培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的作用 ４. 培養(yǎng)條件的影響 ５. 采用固相細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。 第三節(jié) 若干有用物質(zhì)的生產(chǎn) 1.生物堿 2.菌類物質(zhì) 3.醇類物質(zhì) 4.蛋白質(zhì)類 5.食品添加劑 6.農(nóng)藥