發(fā)酵綜合實驗 實驗報告.docx

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1、名目 摘要 錯誤!未定義書簽。 1引言 2材料與方法 錯誤!未定義書簽。 3結(jié)果與爭論 錯誤!未定義書簽。 4總結(jié) 錯誤!未定義書簽。 5心得體會 錯誤!未定義書簽。 參考文獻 錯誤!未定義書簽。 EU099CO OOOOOOOOO 20 40 60 80 100 120 3結(jié)果與爭論 3. 1酪氨酸標準曲線 在入二660nm時,酪氨酸濃度在20~100ug/nil范

2、圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。 標準曲線見圖1。 R2 = 0.991 酪氨酸濃度ug/ml 圖1酪氨酸標準曲線 3. 2發(fā)酵工藝爭論 3. 2.1碳源濃度對發(fā)酵的影響 采納50ml基本發(fā)酵培育基的搖瓶培育，通過轉(zhuǎn)變豆粉含量來轉(zhuǎn)變碳源 濃度，以爭論濃度對發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響。測定發(fā)酵液蛋白酶活力， 以酶活力凹凸作為指標，以初始發(fā)酵培育基的酶活力作為比照。 3000 2500 T O O O 2 12 3 不同碳源濃度對產(chǎn)酶的影響 圖2碳源濃度對產(chǎn)酶的影響 注：1豆餅粉濃度為2.4g/100ml； 2豆餅粉濃度為3.0g/100nd； 3豆餅粉濃度為 3. 6

3、g/100mlo 從圖2可以看出，豆餅粉濃度為3.0g/100ml時，枯草芽抱桿菌的產(chǎn)酶 活性最高。豆餅粉濃度為2.4g/100ml時，由于碳源量缺乏，限制了菌 體生長，因而導致產(chǎn)酶量較低。豆餅粉濃度為3.6g/100ml時，碳源量 充分，導致C/N上升而限制了產(chǎn)蛋白酶的活性，故而，最適豆餅粉濃 度為3. Og/lOOml為產(chǎn)蛋白酶的最相宜濃度。 3. 2. 2接種量對發(fā)酵的影響 將種子液以1肌2%, 3%分別接種到50nli基本發(fā)酵培育基上，搖瓶培育, 測定酶活。 2500 2000 500 接種量對發(fā)酵的影響 圖3接種量對發(fā)酵的影響 注：1接種量1%; 2接種量2%；

4、 3接種量3%。 由圖3可以看出，接種量對發(fā)酵的影響不大，圖中顯示由1%?3%接種量, 菌株的產(chǎn)蛋白酶活力漸漸增加，未達最大值。 3. 2. 3發(fā)酵罐培育 按2. 5. 2所述方法進行發(fā)酵培育 O O O 3 1000 500 不同培養(yǎng)時間對發(fā)酵罐產(chǎn)酶的影響 圖4發(fā)酵罐培育時，隨時間變化對產(chǎn)酶的影響 注：1 24小時;2 42小時;3 48小時。 由圖4可以看出，前24h發(fā)酵產(chǎn)酶活性很低，這主要是由于接種后24h 發(fā)酵罐中主要發(fā)生菌體生長的反響，蛋白酶是生長偶聯(lián)型產(chǎn)物，此時 產(chǎn)量很低。至(J48h到達高點，蛋白酶積累量很

5、高。 蛋白酶的提取 按2. 5.1 (5)所述方法進行酶的提取，結(jié)果如下： 表二酶蛋白提取得率 酶活 總酶活 得率 30nli 母液 2230u/ml 66900u 66. 8% 0.34g濕固體 131559u/g 44730u 平板試驗觀看蛋白酶性質(zhì) 取種子培育液不同稀釋度ICT?IO"分別接種于平板上，300C培育48h 觀看平板上的透亮 圈。 圖5 10甘稀釋度下的透亮 圈 圖6 IO"稀釋度下的透亮 圈 圖5、6平板所用培育基為酪蛋白培育基，枯草芽抱桿菌AS1. 398由于 能產(chǎn)生泌外蛋白分解酪蛋白而消失透亮 圈。 4總結(jié) 本試驗對一株

6、產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽抱桿菌進行性質(zhì)爭論，對C源濃 度及接種量進行單因素試驗。結(jié)果說明，最相宜豆餅粉濃度為 3. 0g/100ml,最適接種量為3%。通過比擬發(fā)酵罐培育試驗與搖瓶培育 試驗覺察，發(fā)酵罐培育產(chǎn)中性蛋白酶的力量強于搖瓶培育。這是由于， 發(fā)酵罐培育的傳質(zhì)與溶氧條件優(yōu)于搖瓶培育。 5心得體會 此次試驗由于時間和條件的限制，并不能對影響發(fā)酵產(chǎn)酶的全部因素 進行單因素試驗，因而局限了試驗結(jié)果的采用價值。通過此次試驗我 系統(tǒng)的熟識到，做發(fā)酵條件優(yōu)化試驗的詳細方法和步驟，以及留意事 項。并且初步把握了蛋白酶酶活測定和蛋白酶提取的方法。對小型發(fā) 酵罐的使用積累了肯定的學問?？偟膩碚f，此次試驗

7、收獲頗豐。 參考文獻 [1]王海洪，吳漢民.枯草芽抱桿菌AS1. 398制備中性蛋白酶的爭論. 浙江水產(chǎn)學院學,1996 (9) : 179-183 _2] Takii, Yukio;Urata, Yoshimi. Themmostable neutral protease resembling thermolysin derived from bacillus brevis MTB001. Noriko Biosci, Biotechnol. Biochem. 1998,62 (5):1028-1030 [3]朱儉等.生物化學試驗.上海:上海科學技術(shù)出版社，1981. [5]陳名洪

8、，濟琛，邱宏端，等.豆粕的微生物發(fā)酵降解[J].中國 農(nóng)學通報,2022, 24(1) : 307- 311. [6]夏寧，高媛，遲玉杰.蛋白酶水解低溫豆粕制備大豆寡肽的爭 論[J].食品工業(yè)科技,2022, 29(1): 171- 175. [7]姚小飛，石慧.大豆多肽的養(yǎng)分及開發(fā)應用進展[J].中國食 物與養(yǎng)分,2022 (7): 44- 46. [8]李泰明，徐秀蘭.AS1. 398中性蛋白酶固定化條件的初步爭論. 藥物生物技術(shù),1998, 5(4) :214-218 [9]唐兵，周林峰，陳向東等.嗜熱脂肪芽抱桿菌高溫中性蛋白酶的 產(chǎn)生條件及酶學性質(zhì).微生物學報，2000, (

9、40) : 188-192 蛋白酶的發(fā)酵工藝爭論 摘要 中性蛋白酶是最早被覺察并廣泛應用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶 制劑，可用于皮革脫毛、軟化、畜禽血液蛋白質(zhì)水解、果酒、啤酒和 飲料的澄清以及醫(yī)學治療等應用領(lǐng)域中。本文對一株產(chǎn)中性蛋白酶枯 草芽抱桿菌（AS1.398）的發(fā)酵條件進行了爭論，考察不同因素條件 下對產(chǎn)酶的影響。通過搖瓶培育爭論碳源濃度，不同接種量對蛋白酶 產(chǎn)量的影響。采用酪蛋白培育基的平板試驗觀看蛋白酶的性質(zhì)。采用 發(fā)酵罐培育觀看時間對產(chǎn)酶的影響.結(jié)果說明：豆餅粉3. Og/lOOmL玉 米粉4.0g/100ml,米皮粉2.5g/100ml,磷酸氫二鈉0. 4g/100ml,磷酸 二

10、氫鉀0. 03g/100nd, pH 7. 2-7. 4為最相宜培育基組分。并且發(fā)酵罐 培育的產(chǎn)酶活性高于搖瓶培育。 關(guān)鍵詞：中性蛋白酶；枯草芽抱桿菌；搖瓶培育；發(fā)酵罐 The Fermentation Process Research of Protease Abstract Neutral protease is the first to be discovered and widely used in industrial production of the protease preparation , which can be used for leather hair remo

11、val, softening, animal blood protein hydrolysis, wine, beer and beverage clarification, and in applications such as medical treatment. The fermentation conditions of a Bacillus Subtilis (ASI. 398) which can produce neutral protease were studied in this paper. Under the condition of different factors

12、 to examine the influence of enzyme production. This study discussed concentration of carbon source, different inoculum on protease yield by shake flask. Casein petri dishes has been used in the observation of the nature of the protease. Fermentation tanks culture was used for observing time's effec

13、tion on the production of enzymes, the results showed that soybean meal 3.Og/lOOml, corn flour 4.Og/lOOml, wheat bran powder 2.5g/100ml, disodium hydrogen phosphate 0.4g/100ml, potassium dihydrogen phosphate 0.03g/100ml, pH 7.2-7.4 was the most appropriate medium composition. Enzyme production activ

14、ity of Fermentation tanks culture was higher than shaking culture. Keywords: Neutral protease； Bacillus subtilis； Shaking culture； Fermentation 1引言 1.1自然界中有大量產(chǎn)泌外蛋白酶微生物，其中以微生物的產(chǎn)酶活性 最優(yōu)。微生物來源蛋白酶一般按蛋白酶的最適pH值分為酸性、中性、 堿性蛋白酶三類。中性蛋白酶最早被覺察并廣泛應用于工業(yè)化生產(chǎn) 中。本試驗采納枯草芽抱桿菌AS1. 398做為爭論菌株，其產(chǎn)酶量大， 酶的耐熱性好，因而被廣泛應用于工業(yè)化生產(chǎn)

15、中。此菌株在C/N為 1:4左右時的產(chǎn)蛋白酶活性最高，并且有機N源優(yōu)于無機N源，因而 其發(fā)酵本錢較高。探究新的發(fā)酵途徑，查找更加經(jīng)濟的組合方式顯出 了重大的意義。 1. 2此次試驗主要做蛋白酶搖瓶發(fā)酵工藝的優(yōu)化，轉(zhuǎn)變發(fā)酵的C源濃 度和接種量，測定蛋白酶酶活，以確定最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件。提取發(fā) 酵液中的蛋白酶，測定酶活算出前后總活力，計算得率。并且進行發(fā) 酵罐培育試驗，比擬發(fā)酵罐培育與搖瓶培育的產(chǎn)酶活性差異。通過此 次試驗學習蛋白酶的測定方法和發(fā)酵液酶蛋白的初步提取方法，考察 不同發(fā)酵條件對微生物產(chǎn)酶的影響，以及熟識小型發(fā)酵罐的使用方 法，包括滅菌，清洗，加料，接種，取樣等環(huán)節(jié)。 2材料與方法

16、 2. 1菌種 枯草芽抱桿菌(B. subtilis) AS1. 398 3. 2試劑 (1)生理鹽水：稱取0.85g NaCl ,用蒸儲水定容至100ml,即 為0. 85%生理鹽水，121℃滅菌20mino (2)福林試劑(Folin試劑)：使用時加2倍蒸鐳水稀釋，即成 已稀釋的福林試劑。 (3) 0.4mol碳酸鈉溶液：稱取無水碳酸鈉42. 4g,用蒸儲水定 容至 1000ml o (4) 0. 4mol三氯乙酸(TCA)溶液:稱取三氯乙酸65. 4g,用蒸儲 水定容至1000ml o (5)pH7. 2磷酸鹽緩沖液:稱取磷酸二氫鈉(NaH2P0, -2H20)31. 2

17、g, 用蒸儲水定容至1000ml,即成0. 2mol溶液(A液)。稱取磷酸氫二鈉 (Na2HP04 - 12H20) 71. 63g,定容至 1000ml,即成 0. 2mol 溶液(B 液)。 取A液28ml和B液72ml,再用蒸儲水稀釋1倍，即成0. Imol/L pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液。 (6) 2%酪蛋白溶液：精確 稱取干酪素2g,稱準至 0. 002g,加入0. 1N氫氧化鈉10ml,在水浴中加熱使溶解(必要時用 小火加熱煮沸)，然后用pH 7. 2磷酸鹽緩沖液定容至100ml即成。配 制后應準時使用或放入冰箱內(nèi)保存，否那么極易繁殖細菌，引起變質(zhì)。 (7) lOO^g/

18、ml酪氨酸溶液：精確稱取在105℃烘箱中烘至恒重 的酪氨酸0. 1000g,逐步加入6ml 1N鹽酸使溶解，用0. 2N鹽酸定容 至100mL其濃度為1000kig/ml,再吸取此液10ml,以0. 2N鹽酸定 容至100mL即配成100強/ml的酪氨酸溶液。此溶液配成后也應準 時使用或放入冰箱內(nèi)保存，以免繁殖細菌而變質(zhì)。 2.3 培育基 (1)牛肉膏蛋白陳培育基(g/100ml)：牛肉膏0.5,蛋白陳1, 氯化鈉 0. 5, pH 70-7. 2, 121℃滅菌 20mino (2)酪蛋白培育基A (g/100ml):牛肉膏0.5,蛋白陳1.0,氯 化鈉 0.5,奶粉 5,瓊脂 2,

19、pH7. 2-7.4, 121℃滅菌 20min。 (3)種子培育基1：牛肉膏蛋白腺培育基。 (4)基本發(fā)酵培育基1 (g/100ml):豆餅粉3.0,玉米粉4.0, 款皮粉2. 5,磷酸氫二鈉0.4,磷酸二氫鉀0.03, pH 7. 2-7. 4, 121 ℃ 滅菌 20nlin。 2.4 蛋白酶活力的測定(福林-酚法,ZBX66030-87): 原理：福林-酚試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈藍色 (鋁藍和鴇藍混合物)，由于蛋白質(zhì)分子中含有酚基的氨基酸(如酪 氨酸，色氨酸等)，可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反響。因此可采 用此原理測定蛋白酶活力。通常以酪蛋白為底物，在肯定pH值和

20、溫 度條件下，同酶液反響，經(jīng)一段時間后終止酶促反響，經(jīng)離心或過濾 除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用NazCOs堿化，再加入福林-酚試 劑顯色，藍色的深淺與濾液中生成產(chǎn)物酪氨酸量成正比；酪氨酸含量 用分光光度計在660nm波特長測定，從而計算出蛋白酶的活力。 酪氨酸標準曲線的繪制：取6支干燥試管編號，分別吸取不同 濃度酪氨酸1ml,各加入0. 4mol碳酸鈉5ml,再加入已稀釋的福林試劑 1ml0搖勻置于水浴鍋中。40℃保溫發(fā)色20min,再用721型分光光度 計進行測定（波長660nni）。 表一標準曲線繪制加樣 編號 1 2 3 4 5 6 酪氨酸 0 0.2 0

21、.4 0.6 0.8 1.0 /ml H20/ml 1. 0 0.8 0.6 0.4 0. 2 0 Na2co3/m 5 5 5 5 5 5 1 福林-酚 1 1 1 1 1 1 /ml 蛋白酶活力測定：試管中加入0. 1 M pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液 稀釋后的酶液1 ml, 40℃預熱5 min,加入預熱過的pH 7. 2的2. 0% 酪蛋白1ml,搖勻，在40℃水浴中精確 反響10 min。用2 ml TCA終止酶反響，靜置10 min。過濾后取1ml濾液，

22、加入0.4 mol 碳酸鈉5ml,再加入已稀釋的福林試劑1ml?？瞻自囼灉y定方法同上, 唯有加酪蛋白之前先加0.4 mol三氯乙酸2nd,使酶失活，再加入酪 蛋白。 蛋白酶酶活力單位的定義：在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1場 酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。 蛋白酶活力(Wml)=A*4*N/10 式中： A——由樣品測得0D值，查標準曲線得相當?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)； N——酶液稀釋的倍數(shù)； 10 反響 lOmin. 2. 5試驗步驟 2. 5. 1搖瓶培育 (1)種子培育：在無菌條件下自斜面菌種挑取一環(huán)菌體，接入 裝有30ml種子培育基的250ml三角瓶中，在30±1℃振蕩培育

23、 12-16ho (2)涂平板：取種子培育液1mL用無菌生理鹽水稀釋，取10% IO"稀釋度，涂布在酪蛋白培育基平板上。每個稀釋度涂2套平板， 每套平板加稀釋菌液0. 1mL用無菌玻璃涂棒勻稱地涂滿整個平板表 面。 (3)發(fā)酵培育：按1%的接種量，將種子液接種到發(fā)酵培育基 中,振蕩培育72h。 (4)蛋白酶搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化：轉(zhuǎn)變發(fā)酵的某一條件，如碳 源種類，氮源種類，C/N, pH,裝液量，接種量等，測定蛋白酶酶活, 以確定較優(yōu)的發(fā)酵工藝條件。 (5)提取：將培育物合并，抽濾除菌體，取30nli濾液測定的 蛋白酶酶活，算出總酶活。向濾液加入硫酸鏤使?jié)舛冗_飽和，靜置 過夜，過濾得濕固體(

24、初步提取物)，稱重后溶解于30ml磷酸緩沖液, 測定酶活，算出總酶活。 2. 5. 2發(fā)酵罐發(fā)酵 (1)種子培育：在無菌條件下自斜面菌種挑取一環(huán)菌體，接入 裝有50ml種子培育基的500ml三角瓶中，在30±1℃振蕩培育 16-18ho (2)接種：將浸有酒精的脫脂棉圍繞在接種口四周，點火翻開 接種口，將種子培育液注入。接種量為1%-5%,蓋好接種口，調(diào)整攪 拌轉(zhuǎn)速至所需數(shù)值，培育開頭。 (3)取樣：為了解培育過程中的變化，需定時取樣進行樣品分 析。由于罐內(nèi)為正壓，翻開取樣管時，樣品自然流出。取樣時應將上 一次殘留在取樣管中的培育液去除后再取樣。止匕外，取樣后應通過加 熱蒸汽，以防取樣管路污染雜菌。 (4)培育結(jié)束：將電極與培育液全部取出，發(fā)酵罐沖洗潔凈。