細(xì)胞融合與單克隆抗體.ppt

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1、第三章 細(xì)胞融合與單克隆抗體,3.1 細(xì)胞融合(cell fusion),定義:在離體條件下用人工的方法把 不同種的細(xì)胞通過(guò)無(wú)性方式融 合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。,3.1.1細(xì)胞融合的發(fā)展歷史,“自發(fā)”細(xì)胞融合現(xiàn)象：,1838年 Muller 多核的腫瘤細(xì)胞,1858年 Virchow 正常組織、發(fā)炎組織及腫 瘤組織多核細(xì)胞,1873年 Luginbuhl 天花病人多核體血細(xì)胞,1875年 Lange 蛙類血液細(xì)胞發(fā)生合并,重要事件,1962年,(日)岡田善雄 仙臺(tái)病毒促細(xì)胞融合,70年代,(華裔加籍)高國(guó)楠 PEG促植物原生 質(zhì)體的融合,80年代，電融合,植物細(xì)胞融合：,1972年（美）P.S

2、.Carlson雜種煙草,現(xiàn)代植物細(xì)胞融合的開始,1978年（德）梅歇爾斯“potomo”,“Pomoto ”,3.1.2 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與細(xì)胞融合 (Protoplast and Cell fusion),植物原生質(zhì)體培養(yǎng) 植物細(xì)胞融合,3.1.3 動(dòng)物細(xì)胞融合,動(dòng)物細(xì)胞融合是研究細(xì)胞遺傳信息轉(zhuǎn)移，基因在染色體上的定位以及創(chuàng)造新細(xì)胞株的有效途徑。,腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的融合,人纖維肉瘤細(xì)胞與小鼠畸胎瘤細(xì)胞融合,1978年,(瑞士)埃勒門斯,(美國(guó))柯路斯,3.1.4 細(xì)胞融合的誘導(dǎo),誘導(dǎo)融合的方法:,物理法:電場(chǎng)刺激 激光 顯微操作,化學(xué)法:聚乙二醇(PEG)結(jié)合高pH、 高鈣離子法,生物

3、法:仙臺(tái)病毒,不同細(xì)胞融合的條件及其主要應(yīng)用,仙臺(tái)病毒誘導(dǎo),仙臺(tái)病毒(Sendal virus),也稱日本血凝病毒HVJ，屬粘病毒副流感類群，是RNA病毒，多型顆粒狀，易在小鼠中蔓延。,融合的可能機(jī)制：,病毒被膜含有糖蛋白，其表面還分布有許多具有神經(jīng)氨酸酶和凝血活性的突起，神經(jīng)氨酸酶可降解細(xì)胞膜上的糖蛋白，使細(xì)胞膜局部凝集，再通過(guò)膜上蛋白質(zhì)分子的重新分布，使膜中的脂類分子重排，而打開質(zhì)膜，導(dǎo)致細(xì)胞融合。,仙臺(tái)病毒誘導(dǎo),融合過(guò)程：,1. 病毒顆粒附著細(xì)胞膜上起搭橋作用，使細(xì)胞 粘著成堆，在4冰浴中細(xì)胞緊密靠近，但不 發(fā)生融合。 2. 37 溫浴后，粘結(jié)部位的細(xì)胞膜破壞，形成 通道，細(xì)胞質(zhì)流通、融

4、匯。 3. 病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，此時(shí)兩個(gè)細(xì)胞合并、 變圓，完成融合，全過(guò)程約1530分鐘。 4. 細(xì)胞核也相互合并,完成細(xì)胞融合,仙臺(tái)病毒誘導(dǎo),仙臺(tái)病毒誘導(dǎo),PEG誘導(dǎo),PEG聚乙二醇(polyethylene glycol),商品名：卡波蠟(carbowax),多聚化合物，分子式H(OCH2CH2)nOH,實(shí)驗(yàn)室用PEG平均分子量在20020,000 一般：1,000固體 常用分子量：40006000,PEG誘導(dǎo),融合的可能機(jī)制,？脫水作用能使細(xì)胞凝聚，并使膜結(jié)構(gòu)發(fā)生 變化,？改變膜表面電荷或膜電位，而導(dǎo)致膜上蛋 白質(zhì)顆粒聚集及膜脂分子隨之發(fā)生重排之 故。,？,PEG誘導(dǎo),初步分析,可能是由

5、于帶有大量負(fù)電荷的PEG分子和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷間，在鈣離子的連接下形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著和結(jié)合，在高pH、高鈣離子溶液的作用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的正負(fù)電荷連接起來(lái)，進(jìn)而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。,PEG誘導(dǎo),PEG誘導(dǎo)過(guò)程注意事項(xiàng)：,PEG誘導(dǎo),懸浮法：將細(xì)胞懸于4050的PEG4000進(jìn)行 溶，處理12分鐘為宜。,離心法：先將細(xì)胞混合物懸于3040的 PEG4000，再離心進(jìn)行融合，則可適 當(dāng)延長(zhǎng)融合時(shí)間，以58分鐘為宜。,控制與分子量、濃度和處理時(shí)間,PEG誘導(dǎo)注意事項(xiàng)：,輔以515的DMSO或在融合前用

6、 PHA處理一下，效果更好。,pH值以pH7.48.0為宜，或略偏堿性 pH8.08.2。,PEG誘導(dǎo),PEG融合法優(yōu)點(diǎn),效率高 材料方便，操作簡(jiǎn)易 效果穩(wěn)定,PEG誘導(dǎo),PEG融合法缺點(diǎn),對(duì)細(xì)胞有毒性,PEG誘導(dǎo),物理電融合誘導(dǎo),電融合誘導(dǎo),機(jī)制,在直流電脈沖的誘導(dǎo)下, 原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位變化, 使原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂,進(jìn)而質(zhì)膜開始連接,直到閉合成完整的細(xì)胞融合體,電融合誘導(dǎo)法原理示意圖,電融合誘導(dǎo),電融合優(yōu)點(diǎn)：,融合效率高，可達(dá)5080,產(chǎn)生雜交細(xì)胞的頻率高，是PEG法的100倍。,操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，但需設(shè)備。,對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用。,可在顯微鏡下觀察操作。,電融合誘

7、導(dǎo),融合率,融合細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù),視野內(nèi)全部細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù),100,融合率=,植物細(xì)胞融合基本過(guò)程,去除細(xì)胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體 誘導(dǎo)細(xì)胞融合形成雜種細(xì)胞 細(xì)胞相互靠近 形成細(xì)胞橋 最關(guān)鍵的一步 胞質(zhì)滲透 細(xì)胞核融合 篩選,培養(yǎng),促進(jìn)細(xì)胞分裂,分化, 從細(xì)胞團(tuán),愈傷組織到最后成株,動(dòng)物單個(gè)細(xì)胞的獲得,動(dòng)物細(xì)胞融合基本過(guò)程,組織的獲得,組織的消化,誘導(dǎo)細(xì)胞融合形成雜種細(xì)胞,篩選，培養(yǎng),植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合的比較,影響細(xì)胞融合的因素,(1) 親本細(xì)胞表面性質(zhì)，表面覆蓋絨毛而不規(guī)則 者較易融合；表面光滑者較難融合。,(2) 細(xì)胞種類不同，融合效果不同，如腹水癌及 株化細(xì)胞較易融合，而淋巴

8、細(xì)胞或血球細(xì)胞 幾乎不融合。,(3) 細(xì)胞融合時(shí)需要適宜溫度和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。如仙 臺(tái)病毒誘導(dǎo)歐利希氏腹水癌細(xì)胞融合時(shí)，于 37 振搖時(shí)易于融合，且融合效率與病毒量 呈正比。但在34 振搖則融合率下降。在 37時(shí)不振搖則幾乎不融合。,影響細(xì)胞融合的因素,(4)細(xì)胞融合過(guò)程中，通常耗氧量較大缺氧時(shí)經(jīng)常 不融合?？諝庵泻趿看笥?0時(shí)有一定融合率，但有些細(xì)胞在無(wú)氧條件下也可融合。,(5)有些細(xì)胞融合時(shí)需要Ca2+，否則不融合，細(xì)胞蛋 白質(zhì)亦發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、 Mn2+等離子可代替Ca2+但有效濃度較Ca2+大 的多。融合時(shí)最適合的離子強(qiáng)度一般為0.1mol/L,(6)最適合

9、的pH為7478之間，在此范圍之外， 融合率均較低。,影響細(xì)胞融合的因素,融合細(xì)胞的特征及其意義,染色體組不穩(wěn)定，尤其種間雜交細(xì)胞,培養(yǎng)過(guò)程中染色體會(huì)逐漸丟失,理論研究基因定位和繪制基因圖工作中 十分有用 應(yīng)用價(jià)值單克隆抗體 植物育種,融合細(xì)胞類型,同核體（homokaryon）,異核體(heterokaryon）,多核體（polykaryon）,異胞質(zhì)體(heterocybrid),同核體(homokaryon),同源細(xì)胞的融合體。由于是同源細(xì)胞，它們的基因型及表現(xiàn)型完全一樣。,異核體(heterokaryon),非同源細(xì)胞的融合體。一般是親源關(guān)系較近的細(xì)胞，這種親和雜種細(xì)胞含有雙親全部細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，其發(fā)育的個(gè)體也是可育的，如煙草屬種間的細(xì)胞雜種。,多核體(polykaryon),含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。親源關(guān)系較遠(yuǎn)的細(xì)胞間融合，融合體以一個(gè)細(xì)胞的核物質(zhì)為主，只加入另一細(xì)胞少量遺傳物質(zhì)，如胡蘿卜與羊角芹形成部分親和的雜種細(xì)胞。,異胞質(zhì)體(heterocybrid),不同胞質(zhì)來(lái)源。用射線或細(xì)胞松弛素B處理一親本細(xì)胞，使其選擇性地丟失核基因形成一個(gè)無(wú)核的亞原生質(zhì)體，再與一個(gè)有核的原生質(zhì)體融合，獲得一個(gè)完整的原生質(zhì)體與另一親本的細(xì)胞質(zhì)融和的異胞質(zhì)體。,雜種細(xì)胞篩選方法,（1）遺傳互補(bǔ)篩選法 （2）抗性互補(bǔ)篩選法 （3）生長(zhǎng)特性篩選法 （4）物理特性篩選法,