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1、第三章 細胞融合與單克隆抗體,3.1 細胞融合(cell fusion),定義:在離體條件下用人工的方法把 不同種的細胞通過無性方式融 合成一個雜合細胞的技術。,3.1.1細胞融合的發(fā)展歷史,“自發(fā)”細胞融合現(xiàn)象：,1838年 Muller 多核的腫瘤細胞,1858年 Virchow 正常組織、發(fā)炎組織及腫 瘤組織多核細胞,1873年 Luginbuhl 天花病人多核體血細胞,1875年 Lange 蛙類血液細胞發(fā)生合并,重要事件,1962年,(日)岡田善雄 仙臺病毒促細胞融合,70年代,(華裔加籍)高國楠 PEG促植物原生 質體的融合,80年代，電融合,植物細胞融合：,1972年（美）P.S
2、.Carlson雜種煙草,現(xiàn)代植物細胞融合的開始,1978年（德）梅歇爾斯“potomo”,“Pomoto ”,3.1.2 植物原生質體培養(yǎng)與細胞融合 (Protoplast and Cell fusion),植物原生質體培養(yǎng) 植物細胞融合,3.1.3 動物細胞融合,動物細胞融合是研究細胞遺傳信息轉移，基因在染色體上的定位以及創(chuàng)造新細胞株的有效途徑。,腫瘤細胞與樹突狀細胞的融合,人纖維肉瘤細胞與小鼠畸胎瘤細胞融合,1978年,(瑞士)埃勒門斯,(美國)柯路斯,3.1.4 細胞融合的誘導,誘導融合的方法:,物理法:電場刺激 激光 顯微操作,化學法:聚乙二醇(PEG)結合高pH、 高鈣離子法,生物
3、法:仙臺病毒,不同細胞融合的條件及其主要應用,仙臺病毒誘導,仙臺病毒(Sendal virus),也稱日本血凝病毒HVJ，屬粘病毒副流感類群，是RNA病毒，多型顆粒狀，易在小鼠中蔓延。,融合的可能機制：,病毒被膜含有糖蛋白，其表面還分布有許多具有神經(jīng)氨酸酶和凝血活性的突起，神經(jīng)氨酸酶可降解細胞膜上的糖蛋白，使細胞膜局部凝集，再通過膜上蛋白質分子的重新分布，使膜中的脂類分子重排，而打開質膜，導致細胞融合。,仙臺病毒誘導,融合過程：,1. 病毒顆粒附著細胞膜上起搭橋作用，使細胞 粘著成堆，在4冰浴中細胞緊密靠近，但不 發(fā)生融合。 2. 37 溫浴后，粘結部位的細胞膜破壞，形成 通道，細胞質流通、融
4、匯。 3. 病毒顆粒進入細胞質，此時兩個細胞合并、 變圓，完成融合，全過程約1530分鐘。 4. 細胞核也相互合并,完成細胞融合,仙臺病毒誘導,仙臺病毒誘導,PEG誘導,PEG聚乙二醇(polyethylene glycol),商品名：卡波蠟(carbowax),多聚化合物，分子式H(OCH2CH2)nOH,實驗室用PEG平均分子量在20020,000 一般：1,000固體 常用分子量：40006000,PEG誘導,融合的可能機制,？脫水作用能使細胞凝聚，并使膜結構發(fā)生 變化,？改變膜表面電荷或膜電位，而導致膜上蛋 白質顆粒聚集及膜脂分子隨之發(fā)生重排之 故。,？,PEG誘導,初步分析,可能是由
5、于帶有大量負電荷的PEG分子和原生質體表面的負電荷間，在鈣離子的連接下形成靜電鍵，促使異源的原生質體間的粘著和結合，在高pH、高鈣離子溶液的作用下，將鈣離子和與質膜結合的PEG分子洗脫，導致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質體上的正負電荷連接起來，進而形成具有共同質膜的融合體。,PEG誘導,PEG誘導過程注意事項：,PEG誘導,懸浮法：將細胞懸于4050的PEG4000進行 溶，處理12分鐘為宜。,離心法：先將細胞混合物懸于3040的 PEG4000，再離心進行融合，則可適 當延長融合時間，以58分鐘為宜。,控制與分子量、濃度和處理時間,PEG誘導注意事項：,輔以515的DMSO或在融合前用
6、 PHA處理一下，效果更好。,pH值以pH7.48.0為宜，或略偏堿性 pH8.08.2。,PEG誘導,PEG融合法優(yōu)點,效率高 材料方便，操作簡易 效果穩(wěn)定,PEG誘導,PEG融合法缺點,對細胞有毒性,PEG誘導,物理電融合誘導,電融合誘導,機制,在直流電脈沖的誘導下, 原生質體質膜表面的電荷和氧化還原電位變化, 使原生質體粘合并發(fā)生質膜瞬間破裂,進而質膜開始連接,直到閉合成完整的細胞融合體,電融合誘導法原理示意圖,電融合誘導,電融合優(yōu)點：,融合效率高，可達5080,產(chǎn)生雜交細胞的頻率高，是PEG法的100倍。,操作簡便、穩(wěn)定，但需設備。,對細胞無毒害作用。,可在顯微鏡下觀察操作。,電融合誘
7、導,融合率,融合細胞的細胞核總數(shù),視野內(nèi)全部細胞的細胞核總數(shù),100,融合率=,植物細胞融合基本過程,去除細胞壁以獲得大量的原生質體 誘導細胞融合形成雜種細胞 細胞相互靠近 形成細胞橋 最關鍵的一步 胞質滲透 細胞核融合 篩選,培養(yǎng),促進細胞分裂,分化, 從細胞團,愈傷組織到最后成株,動物單個細胞的獲得,動物細胞融合基本過程,組織的獲得,組織的消化,誘導細胞融合形成雜種細胞,篩選，培養(yǎng),植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較,影響細胞融合的因素,(1) 親本細胞表面性質，表面覆蓋絨毛而不規(guī)則 者較易融合；表面光滑者較難融合。,(2) 細胞種類不同，融合效果不同，如腹水癌及 株化細胞較易融合，而淋巴
8、細胞或血球細胞 幾乎不融合。,(3) 細胞融合時需要適宜溫度和運動狀態(tài)。如仙 臺病毒誘導歐利希氏腹水癌細胞融合時，于 37 振搖時易于融合，且融合效率與病毒量 呈正比。但在34 振搖則融合率下降。在 37時不振搖則幾乎不融合。,影響細胞融合的因素,(4)細胞融合過程中，通常耗氧量較大缺氧時經(jīng)常 不融合?？諝庵泻趿看笥?0時有一定融合率，但有些細胞在無氧條件下也可融合。,(5)有些細胞融合時需要Ca2+，否則不融合，細胞蛋 白質亦發(fā)生變化。實驗表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、 Mn2+等離子可代替Ca2+但有效濃度較Ca2+大 的多。融合時最適合的離子強度一般為0.1mol/L,(6)最適合
9、的pH為7478之間，在此范圍之外， 融合率均較低。,影響細胞融合的因素,融合細胞的特征及其意義,染色體組不穩(wěn)定，尤其種間雜交細胞,培養(yǎng)過程中染色體會逐漸丟失,理論研究基因定位和繪制基因圖工作中 十分有用 應用價值單克隆抗體 植物育種,融合細胞類型,同核體（homokaryon）,異核體(heterokaryon）,多核體（polykaryon）,異胞質體(heterocybrid),同核體(homokaryon),同源細胞的融合體。由于是同源細胞，它們的基因型及表現(xiàn)型完全一樣。,異核體(heterokaryon),非同源細胞的融合體。一般是親源關系較近的細胞，這種親和雜種細胞含有雙親全部細胞核和細胞質物質，其發(fā)育的個體也是可育的，如煙草屬種間的細胞雜種。,多核體(polykaryon),含有雙親不同比例核物質的融合體。親源關系較遠的細胞間融合，融合體以一個細胞的核物質為主，只加入另一細胞少量遺傳物質，如胡蘿卜與羊角芹形成部分親和的雜種細胞。,異胞質體(heterocybrid),不同胞質來源。用射線或細胞松弛素B處理一親本細胞，使其選擇性地丟失核基因形成一個無核的亞原生質體，再與一個有核的原生質體融合，獲得一個完整的原生質體與另一親本的細胞質融和的異胞質體。,雜種細胞篩選方法,（1）遺傳互補篩選法 （2）抗性互補篩選法 （3）生長特性篩選法 （4）物理特性篩選法,
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