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1、 考綱要求展示知識內(nèi)容要求微生物的分離和培養(yǎng)某種微生物數(shù)量的測定培養(yǎng)基對微生物的選擇作用 知識網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 一、微生物的實驗室培養(yǎng)1. 培養(yǎng)基(1)概念：人們按照微生物對_的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。(2)成分：一般都含有碳源、_、水和_，還需要滿足不同微生物生長對_、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及_的要求。2. 無菌技術(shù)(1)含義：指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有_的方法。(2)關(guān)鍵：防止外來_的入侵。(3)方法：消毒：_、化學(xué)藥劑消毒法、_。滅菌：_滅菌、干熱滅菌、_滅菌。 3. 實驗操作(1)制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基過程：計算、_、溶化、_、倒平板。(2)純化大腸桿菌的原理：在培養(yǎng)基上將細(xì)菌稀
2、釋或分散成_，形成單個菌落，此菌落是由一個細(xì)胞繁殖而來的子細(xì)胞群體。(3)微生物的常用接種方法：_和稀釋涂布平板法，接種過程仍然是_操作。二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)1. 分離原理：土壤中細(xì)菌之所以能分解尿素，是由于它們體內(nèi)能合成_，這種物質(zhì)在把尿素分解成無機(jī)物的過程中起到_作用。 2. 統(tǒng)計菌落數(shù)目：統(tǒng)計樣品中的活菌一般用_。3. 實驗流程：土壤取樣、制備_、微生物的培養(yǎng)與觀察、細(xì)菌的計數(shù)。三、分解纖維素的微生物的分離1. 纖維素酶的組成：一種_，它至少包括三種組分，即C1酶、_酶和_酶。2. 篩選方法：剛果紅染色法，即通過是否產(chǎn)生_來篩選纖維素分解菌。3. 實驗操作步驟：土壤取樣、
3、_、_、將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上、_。 【自我校對】一、1. (1)營養(yǎng)物質(zhì) (2)氮源 無機(jī)鹽 pH 氧氣 2. (1)防止雜菌污染 (2)雜菌 (3)煮沸消毒法 紫外線消毒法 灼燒 高壓蒸汽 3. (1)稱量 滅菌 (2)單個細(xì)胞 (3)平板劃線法無菌二、1. 脲酶 催化 2. 稀釋涂布平板法 3. 培養(yǎng)基三、1. 復(fù)合酶 Cx 葡萄糖苷 2. 透明圈 3. 選擇培養(yǎng) 梯度稀釋 挑選產(chǎn)生透明圈的菌落 微生物的培養(yǎng)一、培養(yǎng)基的類型及其應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基類型配制特點主要應(yīng)用物理性質(zhì)固體培養(yǎng)基加入瓊脂較多菌種分離，鑒定，計數(shù)半固體培養(yǎng)基加入瓊脂較少菌種保存液體培養(yǎng)基不加入瓊脂工業(yè)生產(chǎn)，
4、連續(xù)培養(yǎng)化學(xué)組成合成培養(yǎng)基由已知成分配制而成，成分明確菌種分類、鑒定天然培養(yǎng)基由天然成分配制而成，培養(yǎng)基成分不明確工業(yè)生產(chǎn)，降低成本 目的用途鑒別培養(yǎng)基添加某種指示劑或化學(xué)藥劑菌種的鑒別選擇培養(yǎng)基添加(或缺少)某種化學(xué)成分菌種的分離 二、培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成營養(yǎng)物質(zhì)定義作用主要來源碳源能提供碳元素的物質(zhì)構(gòu)成生物體的物質(zhì)，異養(yǎng)生物的能源物質(zhì)無機(jī)物：CO2、NaH CO3有機(jī)物：糖類、脂肪酸、石油、花生粉餅等氮源能提供氮元素的物質(zhì)合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮代謝產(chǎn)物無機(jī)物：N 2、NH 3、氨鹽、硝酸鹽有機(jī)物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生長因子生長不可少的微量有機(jī)物酶和核酸的成分維生素、氨基酸、堿基等 (1)
5、微 生 物 最 常 利 用 的 碳 源 是 糖 類 (特 別 是 葡 萄 糖 )， 常利 用 的 氮 源 是 氨 鹽 、 硝 酸 鹽 。(2)在 微 生 物 所 需 要 的 化 合 物 中 需 要 量 最 大 的 是 碳 源 。(3)微 生 物 之 所 以 需 要 補(bǔ) 充 生 長 因 子 ， 是 由 于 缺 乏 合 成這 些 物 質(zhì) 所 需 要 的 酶 或 合 成 能 力 有 限 。 三、無菌技術(shù)1. 消毒與滅菌的區(qū)別滅菌方法條件結(jié)果常用方法消毒較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法，還有化學(xué)藥劑(如酒精、氯氣、石炭酸等)消毒、紫外線
6、消毒滅菌強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢 子灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌 2. 實驗室常用滅菌方法的比較滅菌方法適用對象所需條件滅菌時間灼燒滅菌接種的金屬工具(如接種針、接種環(huán))在酒精燈的火焰外焰灼燒直至燒紅干熱滅菌耐高溫需干燥的物品(如玻璃器皿、金屬用具)干熱滅菌箱內(nèi)160170 12 h高壓滅菌培養(yǎng)基100 kPa；121 1530 min 1. 芽 孢 是 細(xì) 菌 發(fā) 育 后 期 形 成 的 休 眠 體 ， 耐 高 溫 ， 故 消 毒 僅 殺死 物 體 表 面 或 內(nèi) 部 一 部 分 對 人 體 有 害 的 微 生 物 而 不 包 括 其 芽孢 和 孢 子 。2.
7、 滅 菌 和 消 毒 的 實 質(zhì) 大 都 是 使 微 生 物 的 蛋 白 質(zhì) 或 核 酸 發(fā) 生 變性 。3. 微 生 物 分 離 中 的 無 菌 技 術(shù) ： 獲 得 純 凈 培 養(yǎng) 物 的 關(guān) 鍵 是 防 止雜 菌 污 染 ， 無 菌 技 術(shù) 可 從 如 下 四 個 方 面 展 開 ：(1)對 實 驗 操 作 的 空 間 ， 操 作 者 的 衣 著 和 手 進(jìn) 行 清 潔 和 消 毒 。(2)將 用 于 微 生 物 培 養(yǎng) 的 器 皿 、 接 種 用 具 和 培 養(yǎng) 基 等 進(jìn) 行 滅 菌 。(3)為 避 免 周 圍 環(huán) 境 中 微 生 物 的 污 染 ， 實 驗 操 作 應(yīng) 在 酒 精 燈
8、 火焰 附 近 進(jìn) 行 。(4)實 驗 操 作 時 ， 應(yīng) 避 免 已 經(jīng) 滅 菌 處 理 的 材 料 用 具 與 周 圍 的 物品 相 接 觸 。 【例1】下列說法正確的是()A. 培養(yǎng)基是為微生物的生長繁殖提供營養(yǎng)基質(zhì)的B. 培養(yǎng)基只有兩類，液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基C. 除水以外的無機(jī)物只能提供無機(jī)鹽 D. 無機(jī)氮源不可能提供能量【解析】根據(jù)培養(yǎng)基的物理性質(zhì)，可分為液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，在液體培養(yǎng)基中加入不同量的凝固劑可形成半固體或固體培養(yǎng)基；除水以外的無機(jī)物如NH4HCO3，既可以是碳源，也可以是氮源，不僅僅能提供無機(jī)鹽；無機(jī)氮源有時也能提供能量，如NH3可以為硝化細(xì)菌提供
9、能量?！敬鸢浮緼 1. 培養(yǎng)基的配制原則目的要明確：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的選擇不同的原料配制培養(yǎng)基。營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：配制培養(yǎng)基時要注意各營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例、pH要適宜。2. 培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和無機(jī)鹽。不同培養(yǎng)基還要滿足不同微生物對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。 1. (2011合肥質(zhì)檢)制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的下列操作中，不正確的是()A. 操作流程是計算、稱量、溶化、滅菌和倒平板B. 將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同倒入燒杯中再加水，去紙C. 滅菌后向牛肉膏蛋白胨溶液中加2%瓊脂，并使其溶解D. 將培養(yǎng)基冷卻到約50度時，在酒精燈火焰
10、附近倒平板【解析】牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的操作步驟是計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板；將稱好的牛肉膏與稱量紙一同放在燒杯中，加入少量水，加熱，牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒撈出稱量紙；滅菌前將蛋白胨和氯化鈉加入燒杯；等培養(yǎng)基冷卻到50度左右時，在酒精燈火焰附近倒平板?！敬鸢浮緾 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)一、實驗原理1. 篩選菌株：常用選擇培養(yǎng)基。2. 統(tǒng)計菌落數(shù)目：測定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)。3. 設(shè)置對照。 二、實驗流程1. 土壤取樣：一般在距地表約38 cm的土壤層取樣(富含有機(jī)物、潮濕、pH7)。2. 制備培養(yǎng)基：準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。
11、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。3. 微生物的培養(yǎng)與觀察：將土樣以1、101、102依次等比稀釋至107稀釋度，按照濃度從低到高的順序涂布平板。注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期以及平板培養(yǎng)樣品的稀釋度。將涂布好的培養(yǎng)皿放在30 溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時間的延長，會有不同的菌落產(chǎn)生。比較牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。4. 細(xì)菌的計數(shù)：當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時，進(jìn)行計數(shù)，防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。求出平均值，根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。 【例2】某同學(xué)在101、102、103倍稀釋液的平均菌落數(shù)為2 760、295和
12、46，則菌落總數(shù)(個/mL)為()A. 2.76104B. 2.95104C. 4.6104 D. 3.775104【解析】菌 落 計 數(shù) 法 ， 注 意 是 計 算 不 同 稀 釋 度 的 平 均 菌 落 數(shù) 。 首先 選 擇 平 均 菌 落 數(shù) 在 30 300之 間 的 ， 當(dāng) 只 有 一 個 稀 釋 倍 數(shù) 的 平均 菌 落 數(shù) 符 合 此 范 圍 時 ， 則 以 該 平 均 菌 落 乘 以 稀 釋 倍 數(shù) 即 為 該 樣品 的 細(xì) 菌 總 數(shù) ； 若 有 兩 個 稀 釋 倍 的 平 均 菌 落 數(shù) 均 在 30 300之 間 ，則 按 兩 者 菌 落 總 數(shù) 之 比 值 來 決 定
13、， 若 比 值 小 于 2應(yīng) 采 取 兩 者 的 平均 數(shù) ， 若 大 于 2， 則 取 其 中 較 小 的 菌 落 總 數(shù) 。 本 題 295、 46在 30300之 間 ， 46103與 29510 2比 值 為 1.6， 應(yīng) 取 二 者 平 均 數(shù)(46103 295102) 2 3.775104。 若 所 有 稀 釋 倍 數(shù) 的 菌 落 數(shù)均 不 在 30 300之 間 ， 則 應(yīng) 以 最 接 近 300或 30的 平 均 菌 落 乘 以 稀 釋倍 數(shù) ?！敬鸢浮緿 微生物計數(shù)規(guī)則1. 選 擇 菌 落 數(shù) 在 30 300的 平 板 計 數(shù) 。2. 若 某 兩 個 或 多 個 稀 釋
14、濃 度 下 獲 得 的 菌 落 數(shù) 均 符 合 條 件 時 ，再 看 兩 者 菌 落 數(shù) 的 比 值 ， 若 小 于 2， 則 取 兩 者 的 平 均 值 ；若 大 于 2， 則 取 最 小 值 。3. 計 算 方 法 ： 每 克 樣 品 中 的 菌 落 數(shù) (C/V)M。C： 某 一 稀 釋 度 下 平 板 上 生 長 的 平 均 菌 落 數(shù) ； V： 涂 布 平板 所 用 稀 釋 液 的 體 積 (mL)； M： 稀 釋 倍 數(shù) 。 2. 用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，正確的是()A. 涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是23
15、0B. 涂布了兩個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是215和260，取平均值238C. 涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是21、212和256，取平均值163D. 涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是210、240和250，取平均值233【解析】在 設(shè) 計 實 驗 時 ， 一 定 要 涂 布 至 少 3個 平 板 ， 才 能 增 強(qiáng) 實驗 的 說 服 力 與 準(zhǔn) 確 性 。 C項 雖 涂 布 了 3個 平 板 ， 但 是 ， 其 中 1個 平板 的 計 數(shù) 結(jié) 果 與 另 兩 個 相 差 太 遠(yuǎn) ， 說 明 在 操 作 過 程 中 可 能 出 現(xiàn)了 錯 誤 ， 因 此 ， 不 能 簡 單 地 將 3個 平 板
16、 的 計 數(shù) 值 用 來 求 平 均 值 。【答案】D 分解纖維素的微生物的分離一、實驗原理二、實驗流程土壤取樣選擇培養(yǎng)(此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別 纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落。 【例3】纖維素分解菌的篩選原理是()A. 剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物B. 剛果紅可以與水解的纖維二糖和葡萄糖形成紅色復(fù)合物C. 剛果紅可以與纖維素酶形成紅色復(fù)合物D. 剛果紅可以與纖維素分解菌結(jié)合形成紅色復(fù)合物【解析】剛 果 紅 是 一 種 染 料 ， 它 可 以 與 像 纖 維 素 這 樣 的多 糖 物 質(zhì) 形 成 紅 色 復(fù) 合 物 ， 但
17、并 不 和 水 解 后 的 纖 維 二 糖和 葡 萄 糖 發(fā) 生 這 種 反 應(yīng) 。 剛 果 紅 也 不 與 纖 維 素 酶 或 者 與纖 維 素 分 解 菌 結(jié) 合 形 成 紅 色 復(fù) 合 物 ?！敬鸢浮緼 選 擇 培 養(yǎng) 的 目 的 是 增 加 纖 維 素 分 解 菌 的 濃 度 ， 確 保 能夠 從 樣 品 中 分 離 到 所 需 要 的 微 生 物 。涉 及 到 微 生 物 技 術(shù) 主 要 有 ： 培 養(yǎng) 基 的 配 制 、 無 菌 操 作技 術(shù) 、 稀 釋 涂 布 平 板 法 、 選 擇 培 養(yǎng) 基 的 作 用 、 土 壤 取樣 等 。 3. 分離纖維素分解菌的實驗過程中操作有誤的是()A. 經(jīng)選擇培養(yǎng)后將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上B. 富集培養(yǎng)這一步可省略，但培養(yǎng)纖維素分解菌少C. 經(jīng)稀釋培養(yǎng)后，用剛果紅染色D. 對照組可用同樣量的培養(yǎng)液涂布到不含纖維素的培養(yǎng)基上【解析】經(jīng) 選 擇 培 養(yǎng) 后 ， 再 經(jīng) 稀 釋 ， 才 能 將 樣 品 涂 布 到 鑒別 纖 維 素 分 解 菌 的 培 養(yǎng) 基 上 ； 富 集 培 養(yǎng) 可 省 略 ； 經(jīng) 稀 釋 培養(yǎng) 后 ， 用 剛 果 紅 染 色 ； 設(shè) 置 對 照 能 證 明 經(jīng) 富 集 培 養(yǎng) 的 確 得到 了 欲 分 離 的 微 生 物 ?！敬鸢浮緼
微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用學(xué)案 精校版
