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1、1方法原理2氣相色譜儀3實驗技術4氣相色譜應用實例5實驗 第 六 章 高 效 液 相 色 譜 法 第 六 章 高 效 液 相 色 譜 法 第 六 章 高 效 液 相 色 譜 法 第 一 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 的 主 要 類 型u 高效液相色譜（H PLC）分析的分類 液固吸附色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上的分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離； 液液分配色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔體表面，或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離； 離子交換色譜法； 體積排阻色譜法； 離子對色譜法； 親和色譜法； 第 一
2、 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 的 主 要 類 型v 高效液相色譜分析的特點 能實現(xiàn)高效的分離; HPLC完成一次分離分析一般只需幾分鐘到幾十分鐘，比經(jīng)典液相色譜快得多; 靈敏度高，使HPLC的最小檢測量可達10-1110-9g; 能與計算機聯(lián)用，自動化程度高； 應用范圍廣，對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制； 流動相可選擇范圍廣，可通過改變流動相組成來改善分離效果； 餾分容易收集，更有利于制備； 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 1、貯液器和吸濾器：一 、 高 壓 輸 液 系 統(tǒng)貯液器: 1-2L的 玻 璃 瓶溶劑吸濾器: Ni合
3、金，孔約0.45 m，防止顆粒物進行泵內(nèi)。 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 2、高壓輸液泵 要求流量準確可調(diào)、可調(diào)范圍寬：流動相流速在0.5-2mL/min，輸液泵的最大流量5-10mL/min耐高壓：輸出壓力常達30-60MPa液流穩(wěn)定。結構材料應耐化學腐蝕 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 活塞型往復泵液相色譜儀中使用最廣泛的恒流泵 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 雙活塞型往復泵 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 離線超聲波振蕩脫氣在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣在線真空脫氣裝置3、脫氣裝置 ：將相對分子量小的氣體從溶劑中除去 第
4、 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 4、梯度洗脫裝置：為什么要進行梯度洗脫？ 使保留值相差很大的多種成分在合理的時間內(nèi)全部洗脫并達到相互分離梯度洗脫：在分離過程中逐漸改變流動相組成，如溶劑的極性、離子強度、pH值等。 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 高壓梯度： 用于二元梯度，用兩個泵分別按設定的比例輸送A和B兩溶液至混合器 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 低壓梯度： 只用一個高壓泵，在泵前安裝了一個比例閥，混合就在比例閥中完成。 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 二 、 進 樣 系 統(tǒng)將樣品溶液準確送入色譜柱的裝置 手動方式、自動方式 密封性好、死體積小、重復性好、進樣
5、時引起色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動要很小。進樣器要求常用手動進樣器六通閥進樣器， 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 六通閥進樣Load Inject 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 三 、 色 譜 柱柱 長 1530cm， 內(nèi) 徑 45mm基質(zhì) (硅膠或高分子聚合物微球)功能層(固定在基質(zhì)表面對樣品分子保留起實質(zhì)作用的有機分子或功能團) 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 四、 檢測系統(tǒng) 用來連續(xù)監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。 溶質(zhì)性檢測器：僅對被分離組分理化特性響應紫外、熒光、電化學檢測器總體檢測器：對試樣和洗脫液總理化性質(zhì)響應示差折光，電導檢測器 第 二
6、節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 石 英 窗接 色 譜 柱UV 光 電倍 增 管廢 液1、紫外檢測器微量吸收池，光程為2-10mm, 體積約為110 L最小檢測量10-9gml-1對流量和溫度波動不敏感可用于梯度洗脫。 最常用的通用型檢測器 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 光電二極管陣列檢測器時間、光強度和波長三維譜 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 2、熒光檢測器靈敏度高選擇性好樣品量很小適合藥物和生化樣品分析 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 3、蒸發(fā)光散射檢測器適于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測通用型和質(zhì)量型檢測器 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 光
7、 源調(diào) 零光 學 零參 比 樣 品平 面 鏡 透 鏡 光 電 轉 換 記 錄 儀放 大 器遮 光 板溶劑相和樣品+溶劑相對光的折射率不同，造成兩束光強度差變化，差示信號放大記錄代表樣品濃度通用型檢測器，靈敏度為10-7g/ml 對溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗4、示差折光檢測器 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 接 參 比 電 極和 對 電 極 接 色 譜 柱Teflon塑 料 塊 1 cm 工 作 電 極(Pt, Au, 碳 糊 )5、安培檢測器 利用待測物在工作電極表面發(fā)生反應產(chǎn)生電流，此電流大小與待測物濃度成正比。 流動相必須含電解質(zhì)，且呈化學隋性。只能檢測具有電活性的物質(zhì)。 第
8、二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 五 、 數(shù)據(jù)處理和計算機控制系統(tǒng)色譜工作站在線顯示自動采集處理儲存自動控制 第 二 節(jié) 高 效 液 相 色 譜 儀 1、 定 性 分 析色譜鑒定法：保留時間對照化學鑒定法：利用專屬化學反應對分離 后收集的組分定性色譜-光譜聯(lián)用定性 非在線色譜光譜聯(lián)用法： 色譜光譜聯(lián)用儀 第 三 節(jié) 高 效 液 相 色 的 應 用 2、 定 量 分 析外標法：外標工作曲線法、外標一點法、外標二點法等 不需知道校正因子，但需進樣量準確內(nèi)標法：內(nèi)標工作曲線法、內(nèi)標一點法、內(nèi)標二點法、內(nèi)標對比法 第 三 節(jié) 高 效 液 相 色 的 應 用 1、在食品分析中的應用食品營養(yǎng)成分分析：蛋
9、白質(zhì)、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、礦物質(zhì)等；食品添加劑分析：甜味劑、防腐劑、著色劑、抗氧化劑等；食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多環(huán)芳烴等。 2、在環(huán)境分析中的應用 多環(huán)芳烴、農(nóng)藥（如氨基甲酸脂類）殘留等。3、H PLC的應用領域 第 三 節(jié) 高 效 液 相 色 的 應 用 3、在生命科學中的應用 分子水平上研究生命科學、遺傳工程、臨床化學、分子生物學等必不可少的工具低分子量物質(zhì)：氨基酸、有機酸、有機胺、類固醇、卟啉、糖類、維生素等分離和測定高分子量物質(zhì)：多肽、核糖核酸、蛋白質(zhì)和酶的純化、分離和測定 第 三 節(jié) 高 效 液 相 色 的 應 用 4、在醫(yī)學檢驗中的應用 體液中代謝物測定；藥代動力學研究；臨床藥物監(jiān)測：合成藥物：抗生素、抗憂郁藥、黃胺類藥等天然藥物：生物堿（吲哚堿、強心甙）等5、在無機分析中的應用 陽、陰離子的分析等。 第 三 節(jié) 高 效 液 相 色 的 應 用
儀器分析(高職)黃一石主編 第六章 高效液相色譜法
