綜合實(shí)驗(yàn)化能異養(yǎng)微生物的分離與純化(實(shí)驗(yàn)要求)

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1、 化能異養(yǎng)微生物的分離與純化(綜合) 安排說明：本實(shí)驗(yàn)要求以實(shí)驗(yàn)小組為單位完成。第8周起，各小組應(yīng)該下載相關(guān)資料，做好預(yù)習(xí)（器材申報(bào)與領(lǐng)用）。 集中實(shí)驗(yàn)時(shí)間：11周~13周。 11周：提交實(shí)驗(yàn)材料要求清單一式兩份，一份上交，并根據(jù)清單領(lǐng)取器材。 12周：開展實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)完成后整理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。 13周：完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)器材歸還。 本次實(shí)驗(yàn)考評占實(shí)驗(yàn)總成績的20%！ 考評內(nèi)容包括實(shí)驗(yàn)紀(jì)律、操作技術(shù)、實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)結(jié)果組內(nèi)共用，實(shí)驗(yàn)報(bào)告自己寫。 注意：期末實(shí)驗(yàn)課成績=實(shí)驗(yàn)考試（卷面成績、操作各占50%）50%+實(shí)驗(yàn)報(bào)告20%+綜合、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)成績20%+平時(shí)成績10%）

2、 第一部分：實(shí)驗(yàn)原理及目的要求 [目的要求] 1．掌握細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌稀釋分離、劃線分離等技術(shù)。 2．學(xué)習(xí)從樣品中分離、純化出所需菌株。 3．學(xué)習(xí)并掌握平板傾注法和斜面接種技術(shù)，了解培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌、酵母菌及霉菌四大類微生物的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間。 4．學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)法。 [基本原理] 土壤是微生物生活的大本營，是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生物的主要菌源。不同土樣中各類微生物數(shù)量不同，一般土壤中細(xì)菌數(shù)量最多，其次為放線菌和霉菌。一般在較干燥，偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富的土壤中放線菌數(shù)量較多；酵母菌在一般土壤中的數(shù)量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數(shù)量

3、多些。本次實(shí)驗(yàn)從土壤中分離細(xì)菌、放線菌和霉菌；白面曲(發(fā)面用的引子)或酒曲或果園土中分離酵母菌。 1） 為了分離和確保獲得某種微生物的單菌落，首先要考慮制備不同稀釋度的菌懸液。各類菌的稀釋度因菌源、采集樣品時(shí)的季節(jié)、氣溫等條件而異。 2） 其次，應(yīng)考慮各類微生物的不同特性，避免樣品中各類微生物的相互干擾，通常需要使用不同的培養(yǎng)基，進(jìn)行富集和選擇培養(yǎng)。如細(xì)菌或放線菌在中性或微堿性環(huán)境較多．但細(xì)菌比放線菌生長快，分離放線菌時(shí)，一般在制備土壤稀釋液時(shí)添加10%酚或在分離培養(yǎng)基中加相應(yīng)的抗生素以抑制細(xì)菌和霉菌(如加鏈霉素25-50μg /mL以抑制細(xì)菌；添加制霉菌素50μg／mL或多菌靈30μg／

4、mL以抑制霉菌)；酵母菌和霉菌都喜酸性環(huán)境，一般酵母菌只能以糖為碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5時(shí)生長極快。細(xì)菌生長適宜的酸堿度為pH7，所以分離酵母菌時(shí)只要選擇好適宜的培養(yǎng)基和pH，可降低細(xì)菌增殖率，霉菌生長慢，也不干擾酵母菌分離。若分離霉菌，需降低細(xì)菌增殖率，一般培養(yǎng)基臨用前須添加滅過菌的乳酸或鏈霉素。為了防止菌絲蔓延干擾菌落計(jì)數(shù)，分離霉菌時(shí)常在培養(yǎng)基中加入化學(xué)抑制劑。 3） 要想獲得某種微生物的純培養(yǎng)，還需提供有利于該微生物生長繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。四大類微生物的分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間見表1。 表1 四大類微生物的分離條件 樣品來源 分離

5、對象 稀釋度 培養(yǎng)基名稱 培養(yǎng)溫度（℃） 培養(yǎng)時(shí)間/d 土樣 細(xì)菌 10-5，10-6，10-7 牛肉膏蛋白胨 30~36 1~2 土樣 放線菌 10-3，10-4，10-5 高氏1號 28 5~7 土樣 霉菌 10-2，10-3，10-4 馬丁氏培養(yǎng)基 28~30 3~5 面曲或土樣 酵母菌 10-4，10-5，10-5 豆芽汁培養(yǎng)基 28~30 2~3 細(xì)菌分離平板 細(xì)菌單菌落 牛肉膏蛋白胨 30~37 1~2 注：本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)在于兩項(xiàng)核心實(shí)驗(yàn)操作技能（按美國微生物學(xué)會核心課程實(shí)驗(yàn)操作技能第3條）： 1）無菌操作技術(shù)

6、——包括滅菌技術(shù)及保持相關(guān)器具的無菌狀態(tài)；無菌操作技術(shù)；獲得微生物樣本； 2）梯度稀釋技術(shù)估算微生物的數(shù)目——正確選擇和使用移液管和移液裝置；正確涂布樣本以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；估計(jì)所需要稀釋的倍數(shù)；根據(jù)平板計(jì)數(shù)值推測出起始樣本的CFU或PFU。 第二部分：綜合性實(shí)驗(yàn)——化能異養(yǎng)微生物的分離純化（自主實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與要求） 一、分離四大類微生物（細(xì)菌、放線菌、酵母、霉菌），要求每類型微生物各分離到2株菌，純化后以斜面（8支）的形式交驗(yàn)；計(jì)算所采集土壤中的細(xì)菌含量（CFU，要求交驗(yàn)計(jì)數(shù)所用的12塊平板）。 二、技術(shù)達(dá)標(biāo) 1.培養(yǎng)基的配制：根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要特點(diǎn)，配制相應(yīng)的培養(yǎng)基，并進(jìn)行培養(yǎng)基的

7、驗(yàn)證。 2.掌握梯度稀釋法、劃線法基本技術(shù)，其中劃線法要求每人獨(dú)立完成一份。 3.對所分離的菌株其菌落特征的表述（列表）。 4.小組的管理與合作。 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與匯報(bào) 1.綜合報(bào)告：全組撰寫一份綜合報(bào)告。含預(yù)方案（主要是器材計(jì)劃、時(shí)間安排），執(zhí)行記錄，結(jié)論以及綜合分析?？砂葱枰孕性O(shè)計(jì)表格，規(guī)范執(zhí)行、規(guī)范記錄。 報(bào)告的寫作，請嚴(yán)格按照我院報(bào)告的格式要求，并參考網(wǎng)絡(luò)課程中“實(shí)驗(yàn)報(bào)告互評的評分要求”中的相關(guān)要求執(zhí)行。 2.個(gè)人實(shí)驗(yàn)報(bào)告：每人一份實(shí)驗(yàn)報(bào)告，重點(diǎn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、觀察思考，結(jié)果分析，綜合體會等，不涉及方案及實(shí)驗(yàn)原理、步驟等的記錄。 3 實(shí)驗(yàn)匯報(bào)，以實(shí)驗(yàn)小組為單位，制作PPT

8、，交流。小組互評，推優(yōu)。 四、實(shí)驗(yàn)安排與完成時(shí)間 1. 本周完成方案學(xué)習(xí)與器材申請，并填寫附表1、2相關(guān)內(nèi)容。（見附錄）本周、下周為集中實(shí)驗(yàn)時(shí)間，在實(shí)驗(yàn)課所安排的時(shí)間，由實(shí)驗(yàn)老師集中指導(dǎo)。各組也可自行安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間，在實(shí)驗(yàn)小班科代表的統(tǒng)一安排下，聯(lián)系實(shí)驗(yàn)室開展實(shí)驗(yàn)。 2. 完成時(shí)間：十五周前。 本次練習(xí)中建議同學(xué)們利用實(shí)驗(yàn)室提供的材料，自己練習(xí)棉塞的制作。 第三部分 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（技術(shù)要求參考資料） 提示：本次實(shí)驗(yàn)所提供的方案僅供參考。各組在達(dá)到目的的情況下，可以自行設(shè)計(jì)自己的方案，但本方案中所提到的實(shí)驗(yàn)操作細(xì)節(jié)，對實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的把握很有幫助，值得關(guān)注。 [材料與用品] 1.菌源

9、選定采土地點(diǎn)后，鏟去表土層2～3cm，取3～10cm深層土壤10g，裝入已滅過菌的牛皮紙袋內(nèi)．封好袋口，并記錄取樣地點(diǎn)、環(huán)境及日期。 土樣采集后應(yīng)及時(shí)分離，凡不能立即分離的樣品，應(yīng)保存在低溫、干燥條件下，盡量減少其中菌種的變化。從面曲中分離酵母菌,也可用酒曲等替代。 2．培養(yǎng)基 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（）、馬丁氏培養(yǎng)基、高氏合成一號培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基(注意：需要制平板和斜面，劃線法所用固體培養(yǎng)基，建議瓊脂濃度為2~2.5%，使平板具有一定的硬度，便于劃線操作) 3．無菌水或無菌生理鹽水 配制生理鹽水．分裝于250mL錐形瓶中，每瓶裝99mL(或95mL分離霉菌用)，每瓶內(nèi)裝10粒玻

10、璃珠；分裝試管，每管裝約4.5~5mL(不超過試管高度的1/5)。 4．其他試劑與用品 無菌培養(yǎng)皿、無菌移液管、無菌涂棒(刮刀)、稱量紙、藥匙、洗耳球、10％酚溶液。 各組根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，統(tǒng)計(jì)后以表格形式申報(bào)所需要材料（參考表2） 1 微生物的分離及純化培養(yǎng) 微生物的分離與純化常用技術(shù)主要包括稀釋分離法、劃線分離法。稀釋分離法將樣液進(jìn)行梯度稀釋后，結(jié)合所需要分離的菌種特點(diǎn)，選擇一定稀釋度的樣液進(jìn)行接種培養(yǎng)，或涂布法或混菌法，對已經(jīng)稀釋的樣液中的菌體進(jìn)行培養(yǎng)，獲得菌落純的細(xì)胞。劃線法可以直接獲得單菌落。 *稀釋分離法 通過稀釋，結(jié)合平板分離的純化菌株的方法有傾注法和涂布法兩種。本

11、次實(shí)驗(yàn)分離細(xì)菌、放線菌、霉菌時(shí)采用傾注法，酵母菌分離采用涂布法。 以下以細(xì)菌及放線菌的分離為例說明技術(shù)要點(diǎn)： 1)細(xì)菌的分離 A 制備土壤稀釋液 ：稱取土樣1 g，在火焰旁加入盛有99mL并裝有玻璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中．振蕩10~20min，使土樣中菌體、芽孢或孢子均勻分散，制成10—2稀釋度的土壤稀釋液，然后按10倍稀釋法進(jìn)行稀釋分離。 具體操作技術(shù)要點(diǎn)如下：取4.5 mL無菌水試管6支，按10-2……10-7順序編號，放置在試管架上。取無菌移液管一支，從移液管包裝紙?zhí)? 中間撕口，將包裝紙?zhí)追殖缮?、下兩段，去除下段包裝紙?zhí)?，在移液管上端管口裝橡皮頭，取出下段移液

12、管紙?zhí)追胖米烂妫杂沂帜粗?、食指、中指拿住移液管卜端的橡皮頭，將吸液端口及移液管外部表面迅速通過火焰2～3次，殺滅撕紙?zhí)讜r(shí)可能污染的雜菌，切忌不要用手指去觸摸移液管吸液端口及外部。左手持錐形瓶底，以右手掌及小指、無名指夾住錐形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞(棉塞夾在手上，不能亂放在桌上)，將1mL移液管的吸液端伸進(jìn)振蕩混勻的錐形瓶土壤懸液底部，用手指輕按橡皮頭，在錐形瓶內(nèi)反復(fù)吹吸二次(吹吸時(shí)注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面)，然后準(zhǔn)確吸取0.5mL 10-2土壤稀釋液（吸管插入稀釋液不低于2.5cm反復(fù)沖洗10次左右，吸液高于所需要刻度少許，然后提起吸管貼于容器內(nèi)壁取出所需要體積；靠近液面但不

13、接觸液面的情況下將液體緩慢吹出到第二個(gè)容器（第一級稀釋液所用吸管不得接觸第二級稀釋液），右手將棉塞插回錐形瓶上，左手放下錐形瓶，換持一支盛有4.5mL無菌水的試管，依前法在火焰旁拔除試管帽(或棉塞)，將0.5mL 10-2土壤稀釋液注入4.5mL無菌水試管內(nèi)，制成l0-3的土壤稀釋液，將此移液管通過火焰再插入原來包裝移液管的下段紙?zhí)變?nèi)，以備再用。另取一只未用過的無菌移液管在試管內(nèi)反復(fù)吹吸三次，然后取出移液管，并將其通過火焰再插入原來包裝移液管的下段紙?zhí)變?nèi)，以備再用。蓋上試管帽。右手持10-3稀釋液試管在左手十敲打20～30次?；靹蛲寥老♂屢骸Ｔ購募?zhí)兹〕鲈瓉淼囊埔汗?，插入稀釋液已很勻的試管?nèi)，

14、再吹吸三次，然后準(zhǔn)確吸出0.5mL 10-3的稀釋液置于第二支裝有4.5 mL無菌水試管中，制成10-4土壤稀釋液。同法再制成 10-5、10-6、10-7的土壤稀釋液(為避免稀釋過程誤差，進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)時(shí)，最好每一個(gè)稀釋度更換一支移液管)。用完的移液管重新放人紙?zhí)變?nèi)。 最后應(yīng)該統(tǒng)一待滅菌后，再洗刷或?qū)⒂眠^的移液管放在廢棄物筒中．用3%-5%來蘇爾浸泡l h后再洗滌。 B 傾注法分離 取無菌培養(yǎng)皿6~9套，分別于培養(yǎng)皿底面按稀釋度編號。稀釋完畢后，可用原來的移液管從菌液濃度最小的10-7土壤稀釋液開始吸取1mL稀釋液，按無菌操作技術(shù)加到和應(yīng)編號的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。再依同方法分別吸取1m

15、L l0-6、10-5的土壤稀釋液，各加到和應(yīng)編號為10-6、10-5的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。將已滅菌的肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基融化，待冷卻至45~50℃左右(醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的要求是451 ℃)，分別傾入到已盛有I0-5、10-6、10-7土壤稀釋液的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。 注意：溫度過高易將菌燙死，且皿蓋上冷凝水太多，會影響分離效果；低于45℃培養(yǎng)基易凝固，平板易出現(xiàn)凝塊、高低不平。用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入培養(yǎng)基約12~15 mL，將培養(yǎng)皿在桌面上輕輕轉(zhuǎn)動（標(biāo)準(zhǔn)要求是:以約15cm直徑范圍，順時(shí)針方向輕輕移動平皿6次，再以15cm直徑范圍前后移動平皿6次，并重復(fù)往返1次……），使稀釋的菌

16、懸液與融化的瓊脂培養(yǎng)基混合均勻．混勻后靜置桌上，待凝。 C 培養(yǎng) 待平板完全冷凝后，將平扳倒置于35—37℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)24～48h觀察結(jié)果。 (2)放線菌、酵母的分離 A 制備土壤稀釋液 稱取土樣l g，加入盛有99mL并裝有玻璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中．并加人10滴10％酚溶液抑制細(xì)菌生長（也可用l％的重鉻酸鉀溶液代替10%酚溶液．效果更好)。振蕩后靜置5min，即成10-2土壤稀釋液。 B1 傾注法 按前法將土壤稀釋液分別稀釋為10-3、10-4、10-5三個(gè)稀釋度，然后用無菌移液管依次分別吸取lmL 10-5、l0-4、10-3土壤稀釋液于

17、對應(yīng)編號的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用高氏合成1號培養(yǎng)基依前法傾倒平板，每個(gè)稀釋度做2～3個(gè)平行培養(yǎng)皿。 酵母分離時(shí)可選擇面曲溶解在生理鹽水內(nèi)，振蕩20min，即成10-2的面曲稀釋液。若選用果園土樣分離酵母，也依前法稱取土樣，制成10-2壤稀釋液。 B2 涂布法 依前法向無菌培養(yǎng)皿中傾倒已融化并冷卻至45-50℃的豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基，待平板冷凝后，用無菌移液管分別吸取上述l0-6、l0-5、10-4三個(gè)稀釋度菌懸液0.1mL，依次滴加于對應(yīng)編號已制備好的豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基平板上。右手持無菌玻璃涂棒，左手拿培養(yǎng)皿，并用拇指將皿蓋打開一縫，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培養(yǎng)皿平板表面將菌液自平板中央均

18、勻向四周涂布擴(kuò)散，切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或?qū)⑴囵B(yǎng)基劃破。 C 培養(yǎng) 接種后，將平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～3 d觀察酵母培養(yǎng)結(jié)果，5~7d觀察放線菌培養(yǎng)結(jié)果。 1.2劃線分離法 菌種被其他雜菌污染時(shí)或混合菌懸液常用劃線法進(jìn)行純種分離。此法將蘸有混合菌懸液（10-2）的接種環(huán)在平板表面多方向連續(xù)劃線，使混雜的微生物細(xì)胞在平板表面分散，經(jīng)培養(yǎng)得到分散成由單個(gè)微生物細(xì)胞繁殖而成的菌落，從而達(dá)到純化目的。 平板制作方法如前所述。劃線分離的培養(yǎng)基必須事先傾倒好，需充分冷凝待平板稍于后方可使用；為便于劃線，一般培養(yǎng)基不宜太薄，每皿約傾倒20mL培養(yǎng)基（較之一般培養(yǎng)

19、數(shù)量稍多），培養(yǎng)基應(yīng)厚薄均勻，平板表面光滑。同時(shí)，可以增加瓊脂的用量到2~2.5%。有必要時(shí)，應(yīng)該將平板放置于培養(yǎng)箱內(nèi)24小時(shí)左右，除去皿蓋上的水珠，并使平板的表面干燥。 劃線分離主要有連續(xù)劃線法和分區(qū)劃線法兩種。 (1)連續(xù)劃線法 連續(xù)劃線法適用于菌濃度較低的樣品的分離。方法是從平板邊緣一點(diǎn)開始，連續(xù)作波浪式劃線直到平板的另一端為止，當(dāng)中不需灼燒接種環(huán)上的菌。以無菌操作用接種環(huán)直接取平板上待分離純化的菌落。將菌種點(diǎn)種在平板邊緣一處，取出接種，燒去多余菌體。將接種環(huán)再次通過稍打開皿蓋的縫隙伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻．然后從接種有菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線。

20、劃線時(shí)平板面與接種環(huán)面成30～40的角度，以手腕力量在平板表面輕巧滑動劃線。接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基，線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊)。劃線完畢，關(guān)上皿蓋。灼燒接種環(huán)，待冷卻后放置接種架上。培養(yǎng)皿倒置于適溫的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(可以免培養(yǎng)過程中皿蓋冷凝水滴下，重新混亂巳分離的菌落)。 培養(yǎng)后在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態(tài)，涂片鏡檢為純種后再接種斜面。 (2)分區(qū)劃線法 平板分四區(qū)，故又稱四分區(qū)劃線法，適用于菌濃度較高的樣品的分離。劃線時(shí)每次將平板轉(zhuǎn)動60~70劃線，每換一次角度，應(yīng)將接種環(huán)上的菌燒滅后，再在上次劃線末尾處繼續(xù)劃線。取菌、

21、接種、培養(yǎng)方法與連續(xù)劃線法相似。分區(qū)劃線法劃線分離的平板分4個(gè)區(qū)，其中第四區(qū)是單菌落的主要分布區(qū)，故其劃線面積應(yīng)最大。為防止第四區(qū)內(nèi)劃線與l、2、3區(qū)線條和接觸，應(yīng)使4區(qū)線條與l區(qū)線條和平行，這樣區(qū)與區(qū)間線條夾角最好保持120左右。先將接種環(huán)沾取少量菌在平板1區(qū)劃3～5條平行線，取出接種環(huán)，左手關(guān)上皿蓋．將平板轉(zhuǎn)動60～70，右手把接種環(huán)上多余菌體燒滅，將燒紅的接種環(huán)在平板邊緣冷卻，再按以上方法以1區(qū)劃線的菌體為菌源，由1區(qū)向2區(qū)作第二次早行劃線。第二次劃線完畢，同時(shí)再把平皿轉(zhuǎn)動約60~70，同樣依次劃線。劃線完畢，灼燒接種環(huán)，關(guān)上皿蓋，同上法培養(yǎng)，在劃線區(qū)觀察單菌落。 本次實(shí)驗(yàn)可在分離細(xì)菌

22、的平板上選取單菌落。于肉膏蛋白胨平板上再次劃線分離，使菌進(jìn)一步純化。劃線接種后的平板，倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。 酵母及霉菌的分離方法基本步驟同上，但注意細(xì)菌、放線菌、霉菌時(shí)可采用傾注法，酵母菌分離采用涂布法。 2微生物菌落計(jì)數(shù)(平板菌落計(jì)數(shù)法，細(xì)菌) 說明：這一部分的內(nèi)容，可以結(jié)合1中的內(nèi)容一并完成。 含菌樣品的微生物經(jīng)稀釋分離培養(yǎng)后，每一個(gè)活菌細(xì)胞可以在平板上繁殖形成一個(gè)肉眼可見的菌落，根據(jù)平板上菌落的數(shù)目，推算出每克含菌樣品中所含的活菌總數(shù)。每克菌樣品中微生物的活細(xì)胞數(shù)＝(同一稀釋度的3個(gè)平板上菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù))/含菌樣品克數(shù)。 一般由三個(gè)稀釋度計(jì)算

23、出的每克含菌樣品中的總活菌數(shù)和同一稀釋度出現(xiàn)的總活菌數(shù)均應(yīng)很接近，不同稀釋度平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)應(yīng)呈規(guī)律性地減少。如相差較大，表示操作不精確。菌落計(jì)數(shù)法要求計(jì)數(shù)平板中的菌落數(shù)以50~300為準(zhǔn)，通常以第二個(gè)稀釋度的平板上出現(xiàn)50個(gè)左右菌落為好。 3其它要求完成的內(nèi)容 3.1平板菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)觀察 從不同平板上選擇不同類型菌落用肉眼觀察，區(qū)分細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌的菌落形態(tài)特征; 用接種環(huán)試挑菌，看其與基質(zhì)結(jié)合緊密程度; 用接種環(huán)挑取不同菌落制片，在顯微鏡下進(jìn)行個(gè)體形態(tài)觀察; 記錄所分離的含菌樣品中明顯不同的各類菌株的主要菌落特征和細(xì)胞形態(tài)。 3.2分離純化菌株轉(zhuǎn)接斜

24、面(斜面接種) 在分離細(xì)菌、放線菌，酵母菌和霉菌的不同平板上選擇分離效果較好，認(rèn)為已經(jīng)純化的菌落各挑選一個(gè)用接種環(huán)接種斜面，操作時(shí)注意左手同時(shí)拿住平板與斜面試管，單人完成從平板至斜面的轉(zhuǎn)接。 將細(xì)菌接種于肉膏蛋白胨斜面，放線菌接種于高氏1號斜面，酵母菌和霉菌接種于豆芽汁葡萄糖斜面上。 貼好標(biāo)簽，在各自適宜的溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)后觀察是否為純種，記錄斜面培養(yǎng)條件及菌苔特征。 交驗(yàn)后，值得保存的菌株置冰箱保藏，其余滅菌后，將器皿清洗交還實(shí)驗(yàn)室。 [實(shí)驗(yàn)報(bào)告] 1. 簡述分離微生物純種的原則及列出分離操作過程的關(guān)鍵無菌操作技術(shù)。 2. 將記錄四大類微生物的分離方法及培養(yǎng)條件填入

25、表中（參考表1，注意標(biāo)明表序號,表格的說明，下同）。 3. 將你所分離的微生物平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果填入表中。 4. 將你所分離樣品中單菌落菌株的菌落培養(yǎng)特征與鏡檢形態(tài)填入表中。 5. 將斜面培養(yǎng)條件及菌苔特征(包括純化結(jié)果是否上交保藏)填入表中。 [思考題] 1. 使用傾注法進(jìn)行稀釋分離時(shí)．為什么要將已融化的瓊脂培養(yǎng)基冷卻到45～50℃左右才能傾入到裝有菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)? 2. 為什么對細(xì)菌、放線菌和霉菌的稀釋分離采用傾注法，而對酵母菌的稀釋分離采用涂布法? 3. 劃線分離時(shí)為什么每次都要將接種環(huán)上多余的菌體燒掉? 劃線時(shí)為何不能重疊? 4. 在恒溫箱中培養(yǎng)微生物時(shí)為何培養(yǎng)皿均需

26、倒置? 5. 分離某類微生物時(shí)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)其他類微生物，請說明原因。應(yīng)該如何進(jìn)一步分離和純化；經(jīng)過—次分離的菌種是否皆為純種，若不純，應(yīng)采用哪種分離方法最合適? 6. 根據(jù)哪些菌落特征可區(qū)分細(xì)菌、放線菌、酵母菌與霉菌（可參考周德慶版教材）?它們的細(xì)胞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)在菌落形態(tài)上有什么聯(lián)系？ [實(shí)驗(yàn)討論] 附：表格示例 表X 分離獲得的菌株特征記錄表 分離日期 地點(diǎn) 分離培養(yǎng)基 菌株編號 菌落特征 鏡檢形態(tài) 說明 表X平均每克樣品所含微生物數(shù) 培養(yǎng)皿號 菌落數(shù) 每克樣品

27、所含菌數(shù) 表X四大類微生物的斜面培養(yǎng)條件及菌苔特征 生科院 2014年秋微生物學(xué)綜合\設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)器材領(lǐng)用申請表 器材名稱 數(shù)量 規(guī)格 說明(領(lǐng)用依據(jù)) 備注 器材儲置 小組長 tel: 教師確認(rèn) 附表2 生科院 2014年秋微生物學(xué)綜合\設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)小組實(shí)驗(yàn)安排時(shí)間分布情況表 時(shí)間 第 組 第 組 第 組 第 組 第 組 第 組 星期一 器材儲置地（門號、柜別） 說明 本表格由各班科代表組織填寫,各組填寫時(shí)應(yīng)寫明實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，一般應(yīng)按計(jì)劃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)管理好所領(lǐng)器材，并于實(shí)驗(yàn)完成后交還實(shí)驗(yàn)室。 班級 實(shí)驗(yàn)小班