玉米赤霉烯酮ELISA快速檢測試劑盒操作說明書(一)

上傳人:奔*** 文檔編號:41004525 上傳時間:2021-11-18 格式:DOCX 頁數(shù):4 大?。?6.93KB
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1、精品資料 博恒 ? 玉米赤霉烯酮 ELISA 快速檢測試劑盒操作說明書 1 、 簡介 本試劑盒采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附 ELISA 原理快速定量檢測谷物、飼料中的玉米赤 霉烯酮( ZearaLenone,ZEN ) 。 谷物 / 飼料的前處理包括:提取、過濾、稀釋,處理時間大約為 20-40 分鐘。 本試劑盒的檢測限為:10 ppb ;谷物/飼料中ZEN的回收率 > 80%;批內、批間變異 系數(shù) <15% 。 2 、 試劑盒組成 A. 24/48/96 孔 ZEN 酶標板: 3/6/12 條X8 孔 B. 20 X濃縮洗滌液:25mL (用蒸儲水稀釋20倍使用) 1瓶

2、 C. ZEN 抗體 : 3/6/12mL 1 瓶 (紅蓋 ) D. 酶標二抗: 3/6/12 mL 1 瓶 (綠蓋 ) E. 顯色液: 3/6/12 mL 1 瓶 (藍蓋 ) F. 終止液 :3/6 mL 1 瓶 (黃蓋 ) G. ZEN 標準品 :1.5/2mL/ 瓶( 0、 30 、 60 、 200 、 500ppb ) 各 1 瓶 H. 操作說明書 1 份 注意 :標準品含有低濃度 ZEN 、終止液含 2 N H 2SO 4 ,需小心取用;勿在有效期外使用本 試劑盒。 3 、 貯存條件與有效期 2- 8 ℃避光貯存,忌 0 ℃以下凍存,有效期見試劑盒內蓋。 4 、

3、樣品處理程序 實驗準備:配制 60% 甲醇水溶液( v/v , 60:40 )和 20% 甲醇水溶液( v/v , 20:80 ) 。 注意:請精確配制上述溶液,以免影響檢測的準確性 。 稱取 5 g 具有代表性的粉碎樣品于 100 mL 帶塞三角瓶內, 準確加入 25 mL 60% 甲醇 水溶液。 將加入了甲醇水溶液的樣品放入振蕩器內(或用手強力振蕩) ,充分振蕩 3 分鐘后,用 whatman 1 號濾紙過濾,收集濾液。 取濾液 2mL ,加入 6 mL 20% 甲醇水溶液,混勻,用 whatman 1 號濾紙過濾,此為 樣品待檢液。 、,、.一、、一 注意 ? 某些

4、樣品待檢液(如花生等)久置影響檢測結果的準確性,為保證檢測的準確性,樣品 提取后請即時檢測。 ? 若樣品待檢液不立即檢測,請將其存儲于棕色玻璃瓶內, 2-8 C避光保存。 ? 試劑盒在使用前,請將試劑盒內所有試劑放到室溫( 20- 25 C)進行溫度平衡。試齊IJ 用完后立即將其放置回 2- 8 C冰箱內保存。 ? 在每個步驟操作時, 速度要快,不要使板孔暴露在空氣中時間過久, 避免酶標板變干。 未用完的酶標板需密閉于自封帶內,防止受潮且避光保存于 2-8 C冰箱內。 ? 在溫育時,避免光照,建議將酶標板置于濕盒內 (在有蓋容器內放置一塊平整濕紗布 ) 進行溫育。 ? 若樣品數(shù)

5、量超過20份,請用多通道加樣器操作。 5、定量檢測程序 5.1 實驗準備:從冰箱取出試劑盒,恢復至室溫后,打開自封袋,取出所需數(shù)量的板條插 入微孔架,記錄空白、 ZEN標準品①②③④⑤號及樣品的位置(可參照下表所示) 。其 余板條封口后放入冰箱。將 20 X濃縮洗滌液用超純水或蒸儲水稀釋 20倍,待用。 1 2 3-- 12 A 空白 樣品 B 標準品① 樣品 C 標準品② 樣品 D 標準品③ 樣品 E 標準品④ 樣品 F 標準品⑤ 樣品 G 樣品 樣品 H 樣品 樣品 5.2 加樣:空白孔

6、加入100 ^L洗滌液(不加ZEN抗體)。ZEN標準品孔和樣品孔相應地加 入標準品(①②③④⑤ )和樣品待檢涌0山/孔(如上表所示加入),再加入ZEN抗體 (50 L /孔),此時各孔中溶液體積為 100山。將酶標板在水平桌面上輕微振蕩(注意 避免液體濺出),使之混勻,放入濕盒內(在有蓋容器內放置一塊平整濕紗布 ),37 c溫育 30分鐘。注意:此操作步驟要快,盡量保持前后孔溫育時間一致,每次加樣須更換新的 吸頭。 5.3 洗板:甩出孔中的液體,用洗瓶或移液器將洗滌液加入各孔中 (滿孔),再次甩出孔中液 體,將酶標板倒置在吸水紙上拍打以除去孔中的液體, 再重復操作洗滌步驟三次 (共洗四

7、次)。 5.4 加酶標二抗:將洗好的酶標板平放,加入酶標二抗 100 山/孔,置于濕盒內, 37 c溫 育30分鐘。 5.5 洗板:參照5.3 5.6 顯色:將洗好的酶標板平放,加入顯色液 100 L /孔,37 c顯色5分鐘(若顯色較淺, 可適當延長,但不宜超過 10分鐘)。 5.7 終止及測定:將顯色完畢的酶標板取出,加入終止液 50 瓜/孔,輕微震蕩混勻,以空 白孔調零,在450 nm 處測量吸光值 A (在加入終止液5分鐘內讀取吸光值)。 5.8 結果判定:以ZEN標準品濃度 30ppb、60ppb、200ppb、500ppb 的常用對數(shù)值(1gC) 為橫坐標,各濃度標準

8、品相應的吸光值 A與0ppb的標準品A值的比值(B/B 0%)為縱坐標 [B/B 0%=標準品(或樣品)的吸光值 /0ppb 標準品的吸光值X 100%],繪制標準曲線。根 據(jù)樣品孔的吸光值計算樣品的 B/B 0%值,查標準曲線,可得到相應樣品中 ZEN的含量(已 考慮樣品提取的稀釋倍數(shù),結果無需換算 )。(或可直接用 RADEWIN 等專用ELISA分析 軟件對數(shù)據(jù)進行分析得出結果)。如果檢測結果高于檢測上限,請將待測樣品提取液用 30% 甲醇水(v/v , 30:70 )稀釋后再檢測,測定結果乘以相應的稀釋倍數(shù)。 6、限量(定性)檢測程序 樣品處理程序見四,適用于同時定性檢測

9、多個限量標準不同的樣品,以 ZEN標準品③ 號(60ppb)作參照進行定性比較,不需作標準曲線。待測樣品提取液根據(jù)限量標準的不同, 用30%的甲醇水溶液按下表稀釋: 限量標準 & 60ppb & 500ppb 待檢樣品提取液 1mL 0.3mL 30%的甲醇水 0 2.2mL 稀釋倍數(shù) 1 50/6 6.1 實驗準備:從冰箱取出試劑盒,恢復至室溫后,打開自封袋,取出所需數(shù)量的板條插入 微孔架,記錄空白、ZEN標準品③號(60ppb)及樣品的位置,其余板條封口后放入冰箱。 6.2 反應:空白孔加入100 匹 洗滌液(不加ZEN抗體)。ZEN標準品孔和樣品孔相應地加

10、 入標準品③號(60ppb)和稀釋后的待檢樣品提取液各 505/孔,再加入ZEN抗體(50 人/孔),將酶標板在水平桌面上輕微振蕩 (注意避免液體濺出),使之混勻,置濕盒內, 37 c溫育30分鐘。注意:此操作步驟要快,盡量保持前后孔溫育時間一致,每次加樣 須更換新的吸頭。 6.3 洗板:參照5.3 6.4 加酶標二抗:參照5.4 6.5 洗板:參照5.5 6.6 顯色:參照5.6 6.7 終止及測定:參照5.7 (目測法不加終止液 ) 6.8 結果判定:目測法(未加終止液前目測):比較樣品孔與標準品參照孔的顏色,若樣品 孔顯色比標準品參照淺,則為陽性,樣品中 ZEN的含量超出

11、限量標準;若深者,則為 陰性;若顏色接近,則需用酶標儀測吸光值比較。儀器法:酶標儀檢測在 450nm 波長 處各孔的吸光值 A,若樣品的 A值 <標準參照的 A值,為陽性,表示樣品中 ZEN的含 量超出限量標準;若樣品 A值>標準參照 A值,為陰性。 7、自備儀器及試劑 酶標儀(內置 450nm 濾光片)或黃曲霉毒素 B1 專用測定儀 20-200山微量移液器及配套吸頭 恒溫培養(yǎng)箱( 0℃-50℃) 、冰箱、感量 0.01g 的天平、小型粉碎機或碾缽 玻璃器皿:三角瓶、燒杯、分液漏斗、蒸發(fā)皿、量筒、具塞試管、滴管、移液管等 其他:甲醇、 whatman 1 號濾紙、吸水紙等 8 、 國家標準 GB/T 19540-2004 飼料中玉米赤霉烯酮的測定 薄板層析法和 ELISA 分析法 GB 2715 2005 糧食衛(wèi)生標準 小麥和玉米中玉米赤霉烯酮限量指標為 60科g/kg GB 13078.2-2006 飼料衛(wèi)生標準飼料和玉米中玉米赤霉烯酮的允許量 500科g/kg 地址:南昌市高新區(qū)火炬大道 201 號江西留學生創(chuàng)業(yè)園 郵編: 330029 電話: 0791-8130250 傳真: 0791-8130250 可編輯修改

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