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1、精品資料
博恒 ?
玉米赤霉烯酮 ELISA 快速檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)
1 、 簡(jiǎn)介
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附 ELISA 原理快速定量檢測(cè)谷物、飼料中的玉米赤
霉烯酮( ZearaLenone,ZEN ) 。
谷物 / 飼料的前處理包括:提取、過(guò)濾、稀釋,處理時(shí)間大約為 20-40 分鐘。
本試劑盒的檢測(cè)限為:10 ppb ;谷物/飼料中ZEN的回收率 > 80%;批內(nèi)、批間變異 系數(shù) <15% 。
2 、 試劑盒組成
A. 24/48/96 孔 ZEN 酶標(biāo)板: 3/6/12 條X8 孔
B. 20 X濃縮洗滌液:25mL (用蒸儲(chǔ)水稀釋20倍使用) 1瓶
2、
C. ZEN 抗體 : 3/6/12mL 1 瓶 (紅蓋 )
D. 酶標(biāo)二抗: 3/6/12 mL 1 瓶 (綠蓋 )
E. 顯色液: 3/6/12 mL 1 瓶 (藍(lán)蓋 )
F. 終止液 :3/6 mL 1 瓶 (黃蓋 )
G. ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品 :1.5/2mL/ 瓶( 0、 30 、 60 、 200 、 500ppb ) 各 1 瓶
H. 操作說(shuō)明書(shū) 1 份
注意 :標(biāo)準(zhǔn)品含有低濃度 ZEN 、終止液含 2 N H 2SO 4 ,需小心取用;勿在有效期外使用本 試劑盒。
3 、 貯存條件與有效期
2- 8 ℃避光貯存,忌 0 ℃以下凍存,有效期見(jiàn)試劑盒內(nèi)蓋。
4 、
3、樣品處理程序
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:配制 60% 甲醇水溶液( v/v , 60:40 )和 20% 甲醇水溶液( v/v , 20:80 ) 。
注意:請(qǐng)精確配制上述溶液,以免影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性 。
稱取 5 g 具有代表性的粉碎樣品于 100 mL 帶塞三角瓶?jī)?nèi), 準(zhǔn)確加入 25 mL 60% 甲醇
水溶液。
將加入了甲醇水溶液的樣品放入振蕩器內(nèi)(或用手強(qiáng)力振蕩) ,充分振蕩 3 分鐘后,用
whatman 1 號(hào)濾紙過(guò)濾,收集濾液。
取濾液 2mL ,加入 6 mL 20% 甲醇水溶液,混勻,用 whatman 1 號(hào)濾紙過(guò)濾,此為
樣品待檢液。
、,、.一、、一
注意
? 某些
4、樣品待檢液(如花生等)久置影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,為保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性,樣品 提取后請(qǐng)即時(shí)檢測(cè)。
? 若樣品待檢液不立即檢測(cè),請(qǐng)將其存儲(chǔ)于棕色玻璃瓶?jī)?nèi), 2-8 C避光保存。
? 試劑盒在使用前,請(qǐng)將試劑盒內(nèi)所有試劑放到室溫( 20- 25 C)進(jìn)行溫度平衡。試齊IJ
用完后立即將其放置回 2- 8 C冰箱內(nèi)保存。
? 在每個(gè)步驟操作時(shí), 速度要快,不要使板孔暴露在空氣中時(shí)間過(guò)久, 避免酶標(biāo)板變干。
未用完的酶標(biāo)板需密閉于自封帶內(nèi),防止受潮且避光保存于 2-8 C冰箱內(nèi)。
? 在溫育時(shí),避免光照,建議將酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi) (在有蓋容器內(nèi)放置一塊平整濕紗布 )
進(jìn)行溫育。
? 若樣品數(shù)
5、量超過(guò)20份,請(qǐng)用多通道加樣器操作。
5、定量檢測(cè)程序
5.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:從冰箱取出試劑盒,恢復(fù)至室溫后,打開(kāi)自封袋,取出所需數(shù)量的板條插
入微孔架,記錄空白、 ZEN標(biāo)準(zhǔn)品①②③④⑤號(hào)及樣品的位置(可參照下表所示) 。其
余板條封口后放入冰箱。將 20 X濃縮洗滌液用超純水或蒸儲(chǔ)水稀釋 20倍,待用。
1
2
3-- 12
A
空白
樣品
B
標(biāo)準(zhǔn)品①
樣品
C
標(biāo)準(zhǔn)品②
樣品
D
標(biāo)準(zhǔn)品③
樣品
E
標(biāo)準(zhǔn)品④
樣品
F
標(biāo)準(zhǔn)品⑤
樣品
G
樣品
樣品
H
樣品
樣品
5.2 加樣:空白孔
6、加入100 ^L洗滌液(不加ZEN抗體)。ZEN標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔相應(yīng)地加 入標(biāo)準(zhǔn)品(①②③④⑤ )和樣品待檢涌0山/孔(如上表所示加入),再加入ZEN抗體 (50 L /孔),此時(shí)各孔中溶液體積為 100山。將酶標(biāo)板在水平桌面上輕微振蕩(注意
避免液體濺出),使之混勻,放入濕盒內(nèi)(在有蓋容器內(nèi)放置一塊平整濕紗布 ),37 c溫育
30分鐘。注意:此操作步驟要快,盡量保持前后孔溫育時(shí)間一致,每次加樣須更換新的 吸頭。
5.3 洗板:甩出孔中的液體,用洗瓶或移液器將洗滌液加入各孔中 (滿孔),再次甩出孔中液
體,將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打以除去孔中的液體, 再重復(fù)操作洗滌步驟三次 (共洗四
7、次)。
5.4 加酶標(biāo)二抗:將洗好的酶標(biāo)板平放,加入酶標(biāo)二抗 100 山/孔,置于濕盒內(nèi), 37 c溫
育30分鐘。
5.5 洗板:參照5.3
5.6 顯色:將洗好的酶標(biāo)板平放,加入顯色液 100 L /孔,37 c顯色5分鐘(若顯色較淺, 可適當(dāng)延長(zhǎng),但不宜超過(guò) 10分鐘)。
5.7 終止及測(cè)定:將顯色完畢的酶標(biāo)板取出,加入終止液 50 瓜/孔,輕微震蕩混勻,以空
白孔調(diào)零,在450 nm 處測(cè)量吸光值 A (在加入終止液5分鐘內(nèi)讀取吸光值)。
5.8 結(jié)果判定:以ZEN標(biāo)準(zhǔn)品濃度 30ppb、60ppb、200ppb、500ppb 的常用對(duì)數(shù)值(1gC) 為橫坐標(biāo),各濃度標(biāo)準(zhǔn)
8、品相應(yīng)的吸光值 A與0ppb的標(biāo)準(zhǔn)品A值的比值(B/B 0%)為縱坐標(biāo)
[B/B 0%=標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)的吸光值 /0ppb 標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值X 100%],繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根
據(jù)樣品孔的吸光值計(jì)算樣品的 B/B 0%值,查標(biāo)準(zhǔn)曲線,可得到相應(yīng)樣品中 ZEN的含量(已
考慮樣品提取的稀釋倍數(shù),結(jié)果無(wú)需換算 )。(或可直接用 RADEWIN 等專用ELISA分析
軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出結(jié)果)。如果檢測(cè)結(jié)果高于檢測(cè)上限,請(qǐng)將待測(cè)樣品提取液用 30%
甲醇水(v/v , 30:70 )稀釋后再檢測(cè),測(cè)定結(jié)果乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
6、限量(定性)檢測(cè)程序
樣品處理程序見(jiàn)四,適用于同時(shí)定性檢測(cè)
9、多個(gè)限量標(biāo)準(zhǔn)不同的樣品,以 ZEN標(biāo)準(zhǔn)品③ 號(hào)(60ppb)作參照進(jìn)行定性比較,不需作標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)樣品提取液根據(jù)限量標(biāo)準(zhǔn)的不同, 用30%的甲醇水溶液按下表稀釋:
限量標(biāo)準(zhǔn)
& 60ppb
& 500ppb
待檢樣品提取液
1mL
0.3mL
30%的甲醇水
0
2.2mL
稀釋倍數(shù)
1
50/6
6.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:從冰箱取出試劑盒,恢復(fù)至室溫后,打開(kāi)自封袋,取出所需數(shù)量的板條插入 微孔架,記錄空白、ZEN標(biāo)準(zhǔn)品③號(hào)(60ppb)及樣品的位置,其余板條封口后放入冰箱。
6.2 反應(yīng):空白孔加入100 匹 洗滌液(不加ZEN抗體)。ZEN標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔相應(yīng)地加
10、 入標(biāo)準(zhǔn)品③號(hào)(60ppb)和稀釋后的待檢樣品提取液各 505/孔,再加入ZEN抗體(50
人/孔),將酶標(biāo)板在水平桌面上輕微振蕩 (注意避免液體濺出),使之混勻,置濕盒內(nèi),
37 c溫育30分鐘。注意:此操作步驟要快,盡量保持前后孔溫育時(shí)間一致,每次加樣 須更換新的吸頭。
6.3 洗板:參照5.3
6.4 加酶標(biāo)二抗:參照5.4
6.5 洗板:參照5.5
6.6 顯色:參照5.6
6.7 終止及測(cè)定:參照5.7 (目測(cè)法不加終止液 )
6.8 結(jié)果判定:目測(cè)法(未加終止液前目測(cè)):比較樣品孔與標(biāo)準(zhǔn)品參照孔的顏色,若樣品 孔顯色比標(biāo)準(zhǔn)品參照淺,則為陽(yáng)性,樣品中 ZEN的含量超出
11、限量標(biāo)準(zhǔn);若深者,則為 陰性;若顏色接近,則需用酶標(biāo)儀測(cè)吸光值比較。儀器法:酶標(biāo)儀檢測(cè)在 450nm 波長(zhǎng)
處各孔的吸光值 A,若樣品的 A值 <標(biāo)準(zhǔn)參照的 A值,為陽(yáng)性,表示樣品中 ZEN的含
量超出限量標(biāo)準(zhǔn);若樣品 A值>標(biāo)準(zhǔn)參照 A值,為陰性。
7、自備儀器及試劑
酶標(biāo)儀(內(nèi)置 450nm 濾光片)或黃曲霉毒素 B1 專用測(cè)定儀
20-200山微量移液器及配套吸頭
恒溫培養(yǎng)箱( 0℃-50℃) 、冰箱、感量 0.01g 的天平、小型粉碎機(jī)或碾缽
玻璃器皿:三角瓶、燒杯、分液漏斗、蒸發(fā)皿、量筒、具塞試管、滴管、移液管等
其他:甲醇、 whatman 1 號(hào)濾紙、吸水紙等
8 、 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
GB/T 19540-2004 飼料中玉米赤霉烯酮的測(cè)定 薄板層析法和 ELISA 分析法
GB 2715 2005 糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 小麥和玉米中玉米赤霉烯酮限量指標(biāo)為 60科g/kg
GB 13078.2-2006 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)飼料和玉米中玉米赤霉烯酮的允許量 500科g/kg
地址:南昌市高新區(qū)火炬大道 201 號(hào)江西留學(xué)生創(chuàng)業(yè)園 郵編: 330029
電話: 0791-8130250 傳真: 0791-8130250
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