酵母細(xì)胞的破碎及破碎率的測(cè)定

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1、 試驗(yàn)一 酵母細(xì)胞的破碎及破碎率的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.掌握超聲波破碎細(xì)胞的原理和操作； 2.學(xué)習(xí)細(xì)胞破碎率的評(píng)價(jià)方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 頻率超過(guò)15～20kHz的超聲波，在較高的輸入功率下（100～250W）可破碎細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用JY95-2D超生波細(xì)胞粉碎機(jī)，其工作原理是：JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)由超聲波發(fā)生器和換能器兩部分組成。超聲波發(fā)生器（電源）是將220V、50Hz的單相電通過(guò)變頻器件變?yōu)?0～25Hz、約600V的交變電能，并以適當(dāng)?shù)淖杩古c功率匹配來(lái)推動(dòng)換能器工作，做縱向機(jī)械振動(dòng)，震動(dòng)波通過(guò)浸入在樣品中的鈦合金變速桿對(duì)破碎的各類細(xì)胞產(chǎn)生空化效應(yīng)，從而達(dá)到破碎細(xì)胞的目的

2、。 三、實(shí)驗(yàn)器材 超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，電子顯微鏡，酒精燈，載玻片，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，接種針。 四、試劑和材料 （1）酵母細(xì)胞懸浮液 0.2g/mL的啤酒酵母溶于50mmol/L乙酸鈉-乙酸緩沖溶液（pH為4.7）。 （2）馬鈴薯培養(yǎng)基 ①馬鈴薯（去皮切塊）200g；②瓊脂20g；③蔗糖20g；④蒸餾水1000mL；⑤pH為6.5。 選優(yōu)質(zhì)馬鈴薯去皮切塊，加水煮沸30min，然后用紗布過(guò)濾，再加糖及瓊脂，融化后補(bǔ)充加水至1000mL，分裝，115℃滅菌20min。 五、操作步驟 （1）啤酒酵母的培養(yǎng) ①菌種純化。 將酵母菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，28～30℃，培養(yǎng)3～4d，培養(yǎng)成熟后，

3、用接種環(huán)取一環(huán)酵母菌至8mL液體培養(yǎng)基中，28～30℃，培養(yǎng)24h。 ②擴(kuò)大培養(yǎng)。 將培養(yǎng)成熟的8mL液體培養(yǎng)基中的酵母菌全部轉(zhuǎn)接至80mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28～30℃，培養(yǎng)15～20h。 （2）破碎前計(jì)數(shù) 取1mL酵母細(xì)胞懸浮液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。 （3）細(xì)胞超聲波破碎 ①將80mL酵母細(xì)胞懸浮液放入100mL容器中，液體浸沒(méi)超聲發(fā)射針1cm。 ②打開(kāi)開(kāi)關(guān)，將頻率設(shè)置中檔，超聲破碎1min，間歇1min，破碎20次。 ③取1mL破碎后的細(xì)胞懸浮液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，滴一滴在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，用電子顯微鏡進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)。計(jì)算細(xì)胞破碎率。 ④破碎后

4、的細(xì)胞懸浮液，于12000r/min、4℃離心30min，去除細(xì)胞碎片。用Lowry法檢測(cè)上清液蛋白質(zhì)含量。 六、結(jié)果與討論 1、用顯微鏡觀察細(xì)胞破碎前后的形態(tài)變化。 2、用兩種方法對(duì)細(xì)胞破碎率進(jìn)行評(píng)價(jià)：一種是直接計(jì)數(shù)法，對(duì)破碎后的樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯?，通過(guò)在血球計(jì)數(shù)板上用顯微鏡觀察來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的計(jì)數(shù)，從而計(jì)算出破碎率；另一種是間接計(jì)數(shù)法，將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心分離掉固體（完整細(xì)胞和碎片），然后用Lowry法測(cè)量上清液中的蛋白質(zhì)含量，也可以評(píng)估細(xì)胞的破碎程度。 試驗(yàn)二 細(xì)胞核與線粒體的分級(jí)分離 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.了解離心分離的原理； 2.掌握差速離心法分離細(xì)胞器的方法及操

5、作。 二、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞內(nèi)不同的結(jié)構(gòu)，密度和大小都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來(lái)。 分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行分離，其過(guò)程包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分離和分析三步，這種方法已成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。 （1）勻漿(Homogenization) 低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(zhì)(即0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化鈣)進(jìn)行破碎細(xì)胞使之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。 （2）分級(jí)分離(Fractiona

6、tion) 由低速到高速離心逐漸沉降。先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉淀下來(lái)，從而使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體等得以分離。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開(kāi)始時(shí)均勻分布在整個(gè)離心管中，所以每級(jí)離心得到的第一次沉淀必然不是純的最重的顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化。 （3）分析 分級(jí)分離得到的組分，可用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。 三、實(shí)驗(yàn)器材 普通離心機(jī)，高速離心機(jī)，勻漿器，平皿，載玻片，顯微鏡。 四、試劑和材料 小白鼠，0.9%NaCl溶液，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化鈣，1%甲苯胺藍(lán)，0.02%詹納斯綠

7、B染液。 五、操作步驟 （一）細(xì)胞核的分離提取操作步驟 1.用頸椎脫位的方法處死小白鼠后，迅速剖開(kāi)腹部取出肝臟，剪成小塊(去除結(jié)締組織)盡快置于盛有0.9％NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。 2.將濕重約1g的肝組織放在小平皿中，用量筒量取8ml預(yù)冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝組織后，再全部加入。 3.剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨3～5次，用3層紗布過(guò)濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片I，做好標(biāo)記，自然干燥。

8、 4.將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機(jī)，以2500r/min離心15min；緩緩取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待分離線粒體用；同時(shí)涂一張上清液片Ⅱ做好標(biāo)記，自然干燥；余下的沉淀物進(jìn)行下一步驟。 ??? 5.用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以2500r/min離心15min，棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，涂片Ⅲ，自然干燥。 6.將I、Ⅱ、Ⅲ涂片用l％甲苯胺藍(lán)染色后蓋片即可觀察。 7.分別于高倍鏡下觀察三張圖片，描述鏡下所見(jiàn)。 （二）高速離心分離提取線粒體操作步驟 1.將裝有上清液的高速

9、離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000r/min離心20min，棄上清，留取沉淀物。 2.加入0.25mol／L蔗糖-0．003mol／L氯化鈣液lmL，用吸管吹打成懸液，以17000r/min離心20min，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物，加入0.1mL 0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化鈣溶液混勻成懸液(可用牙簽)。 3.取上清液和沉淀物懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上(分別標(biāo)記Ⅳ、Ⅴ涂片)，各滴一滴0.02％詹納斯綠B染液蓋上蓋片染20min。 4.油鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)顆粒狀的線粒體被詹納斯綠B染液染成藍(lán)綠色。 六、結(jié)果與討論 1、畫(huà)出說(shuō)分離的細(xì)胞核和

10、線粒體的形態(tài)，并說(shuō)明其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 2、解釋差速離心的分離原理。 試驗(yàn)三 胰凝乳蛋白酶的制備 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.掌握鹽析法分離酶的基本原理和操作； 2.掌握結(jié)晶的基本方法和操作； 3.學(xué)習(xí)胰凝乳蛋白酶制備的方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)分子表面帶有一定的電荷，因同種電荷相互排斥，使蛋白質(zhì)分子彼此分離；同時(shí)，蛋白質(zhì)分子表面分布著各種親水基團(tuán)，這些基團(tuán)與水分子相互作用形成水化膜，增加蛋白質(zhì)水溶液的穩(wěn)定性。如果在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，蛋白質(zhì)分子表面的電荷被大量中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。由于不同的蛋白質(zhì)分子表面所帶的電荷多少不同，

11、分布情況也不一樣，因此不同的蛋白質(zhì)鹽析所需的鹽濃度也各異。鹽析法就是通過(guò)控制鹽的濃度，使蛋白質(zhì)混合液中的各個(gè)成分分步析出，達(dá)到粗分離蛋白質(zhì)的目的。 三、實(shí)驗(yàn)器材 高速組織搗碎機(jī)，解剖刀，鑷子，剪刀，燒杯（50mL、100mL），離心機(jī)，離心管，漏斗，紗布，棉線，吸管（10mL、5mL、2mL、1mL、0.5mL），玻璃棒，滴管，透析袋，臺(tái)秤，分析天平，離心機(jī)。 四、試劑和材料 新鮮豬胰臟，0.125mol/LH2SO4溶液，固體（NH4）2SO4，1%酪蛋白溶液（稱取酪蛋白1.0g，加pH為8.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液100mL，在沸水中煮5min使之溶解，冰箱中保存），磷酸鹽

12、緩沖液（0.1mol/L，pH為7.4），0.1mol/LNaOH溶液，1%BaCl2。 五、操作步驟 整個(gè)操作過(guò)程在0～5℃條件下進(jìn)行。 （1）提取 取新鮮豬胰臟，放在盛有冰冷0.125mol/LH2SO4的容器中，保存在冰箱中待用。去除胰臟表面的脂肪和結(jié)締組織后稱重。用組織搗碎機(jī)絞碎，然后涽懸于2倍體積的冰冷0.125mol/LH2SO4溶液中，放冰箱內(nèi)過(guò)夜。將上述混懸液離心10min，上層液經(jīng)2層紗布過(guò)濾至燒杯中，將沉淀再混懸于等體積的冰冷的0.125mol/LH2SO4溶液中，再離心，將兩次上層液合并，即為提取液。 （2）分離 取提取液10mL，加固體（NH4）2SO41.

13、14g達(dá)0.2飽和度，放置10min，離心（3000r/min）10min。棄去沉淀，保留上清液。在上清液中加入固體（NH4）2SO41.323g達(dá)0.5飽和度，放置10min離心（3000r/min）10min。棄去上清液，保留沉淀。將沉淀溶解于3倍體積的水中，裝入透析袋中，用pH為7.4的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液透析，直至1%BaCl2檢查無(wú)白色BaSO4沉淀產(chǎn)生，然后離心（3000r/min）5min。棄去沉淀（變性的酶蛋白），保留上清液。在上清液中加（NH4）2SO4（0.39g/mL）達(dá)0.6飽和度，放置10min，離心（3000r/min）10min。棄去上清液，保留沉淀（即為

14、胰凝乳蛋白酶）。 （3）結(jié)晶 取分離所得的胰凝乳蛋白酶容于3倍體積的水中。然后加（NH4）2SO4（1.14g/mL）至胰凝乳蛋白酶溶液達(dá)0.25飽和度，用0.1mol/LNaOH調(diào)節(jié)至pH6.0，在室溫（25～30℃）放置12h即可出現(xiàn)結(jié)晶。 六、結(jié)果與討論 1、在顯微鏡下觀察胰凝乳蛋白酶的結(jié)晶形狀。 2、計(jì)算胰凝乳蛋白酶的得率。 3、分析影響胰凝乳蛋白酶得率的因素。 試驗(yàn)四 牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制備 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.掌握鹽析法和等電點(diǎn)沉淀法的原理和基本操作。 二、實(shí)驗(yàn)原理 乳蛋白素（α-lactalbumin）廣泛存在于乳品中，是乳糖合成所需要的重要

15、蛋白質(zhì)。牛奶中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白（casein），酪蛋白在pH4.8左右會(huì)沉淀析出。而乳蛋白素在pH3左右才會(huì)沉淀。利用這一性質(zhì)，可先將pH降至4.8，或是在加熱至40℃的牛奶中加硫酸鈉，將酪蛋白沉淀出來(lái)。酪蛋白不溶于乙醇，這個(gè)性質(zhì)被利用從酪蛋白粗制劑中出去脂類雜質(zhì)。將去除掉酪蛋白的濾液的pH調(diào)至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分雜質(zhì)可隨澄清液除去。再經(jīng)過(guò)一次pH沉淀后，即可得到粗乳蛋白素。 三、實(shí)驗(yàn)器材 燒杯（250mL、100mL、50mL），玻璃試管（10mm×100mm），離心管（50mL），磁力攪拌器，pH計(jì)，離心機(jī)。 四、試劑和材料 脫脂或低脂奶粉，無(wú)水硫酸鈉，0.1mo

16、l/LHCl，0.1mol/LNaOH，0.05mol/L碳酸氫銨，濾紙，pH試紙，濃鹽酸，0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH為4.6），乙醇。 五、操作步驟 （一）鹽析法或等電點(diǎn)沉淀法制備酪蛋白 1.將50mL牛乳倒入250mL燒杯中，于40℃水浴中加熱并攪拌。 2.在攪拌下緩慢加入10g無(wú)水硫酸鈉（約10min內(nèi)分次加入），之后再繼續(xù)攪拌10min（或加熱到40℃，再在攪拌下滿滿地加入50mL40左右的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，直到pH達(dá)到4.8左右，可以用酸度計(jì)調(diào)節(jié)。將上述懸浮液冷卻至室溫，然后靜置5min）。 3.將溶液用細(xì)布過(guò)濾，分別收集沉淀和濾液。將上述沉淀懸浮于30

17、mL乙醇中，傾于布式漏斗中，過(guò)濾出去乙醇溶液，抽干。將沉淀從布式漏斗中已出，在表面皿上攤開(kāi)以除去乙醇，干燥后得到酪蛋白。準(zhǔn)確秤量。 （二）等電點(diǎn)沉淀法制備酪蛋白素 1.將操作步驟（一）所得的濾液置于100mL燒杯中，一邊攪拌，一邊利用pH計(jì)以濃鹽酸調(diào)整pH至3.0±0.1。 2.6000r/min離心15min，倒掉上清液。 3.在離心管內(nèi)加入10mL去離子水，震蕩，使館內(nèi)下層物重心懸浮，用0.1mol/LNaOH溶液調(diào)整pH至8.5～9.0（以pH試紙或pH計(jì)判定），此時(shí)大部分蛋白質(zhì)均會(huì)溶解。 4.6000r/min離心10min，將上清液倒入50mL燒杯中。 5.將燒杯置于磁力

18、攪拌器上，一邊攪拌，一邊利用pH計(jì)用0.1mol/LHCl調(diào)整pH至3.0±0.1。 6.6000r/min離心10min，倒掉上清液。沉淀取出干燥，并秤量。 六、結(jié)果與討論 1、計(jì)算出每100mL牛乳所制備出的酪蛋白數(shù)量，并與理論產(chǎn)量（3.5%）相比較。求出實(shí)際得率。 2、計(jì)算出每100mL牛乳所制備出的乳蛋白素的數(shù)量。 3、討論影響得率的因素。 試驗(yàn)五 大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.掌握有機(jī)溶劑沉淀法的原理和基本操作。 2.掌握SOD酶提取分離的一般步驟。 二、實(shí)驗(yàn)原理 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種

19、具有抗氧化、抗衰老、抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可催化超氧負(fù)離子（O2-）進(jìn)行岐化反應(yīng)，生成氧和過(guò)氧化氫。大蒜蒜瓣和懸浮培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞中含有較豐富的SOD，通過(guò)組織和細(xì)胞破碎后，可用pH7.8的磷酸緩沖液提取出來(lái)。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮將其沉淀析出。 有機(jī)溶劑沉淀的原理是有機(jī)溶劑能降低水溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子之間的靜電引力增大。同時(shí)，有機(jī)溶劑的親水性比溶質(zhì)分子的親水性強(qiáng)，它會(huì)搶奪本來(lái)與親水溶質(zhì)結(jié)合的自由水，破壞其表面的水化膜，導(dǎo)致溶質(zhì)分子之間的相互作用增大而發(fā)生聚集，從而沉淀析出。 三、實(shí)驗(yàn)器材 研缽，石英砂，燒杯（50mL），玻璃棒，pH計(jì)，冷凍離心機(jī)，離心管。 四、試

20、劑和材料 新鮮蒜瓣，0.05mol/L磷酸緩沖溶液（pH7.8），氯仿-乙醇混合液（氯仿-無(wú)水乙醇3：5），丙酮（用前預(yù)冷至-10℃）。 五、操作步驟 整個(gè)操作過(guò)程在0～5℃條件下進(jìn)行。 1.SOD酶的提取 稱取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎細(xì)胞后，加入0.05mol/L的磷酸緩沖液（pH7.8）15mL，繼續(xù)研磨20min，使SOD酶充分溶解到緩沖液中，然后6000r/min冷凍離心15min，棄沉淀，取上清液。 2.去除雜蛋白 上清液中加入0.25倍體積的氯仿-乙醇混合液攪拌15min，6000r/min離心15min，棄去沉淀，得到的上清液即為粗酶液。 3.SOD酶的沉

21、淀分離 粗酶液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，6000r/min離心15min，得到SOD酶沉淀。冷凍干燥后即得成品。對(duì)成品進(jìn)行稱量并測(cè)定酶活力。 六、結(jié)果與討論 1、計(jì)算出每500g大蒜蒜瓣所制備出的SOD酶的量。 2、討論有機(jī)溶劑沉淀法與鹽析法相比的優(yōu)缺點(diǎn)。 試驗(yàn)六 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.掌握凝膠色譜基本原理。 2.熟悉凝膠色譜法的操作。 3.了解物資在色譜柱中洗脫行為與分配系數(shù)哦的關(guān)系。 二、實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)將藍(lán)葡聚糖200（分子質(zhì)量2000kD）、細(xì)胞色素c（分子質(zhì)量17kD）和DNFP-甘氨酸（分子質(zhì)量0.5kD）的混合物通過(guò)交聯(lián)

22、葡聚糖凝膠G-50（Sephadex G-50）的色譜柱以蒸餾水為洗脫溶劑進(jìn)行洗脫。藍(lán)葡聚糖2000分子量最大，全部被排阻在凝膠顆粒的間隙中，而未進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，因而洗脫速度最快，最先流出柱，其Ve=Vo即Kd=0。DNFP-甘氨酸分子量最小不被排阻而可完全進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，洗脫速度最慢，最后流出柱，其Ve=Vi+Vo即Kd=1。細(xì)胞色素c分子量在上述二者之間，其洗脫速度居中?？梢灾苯訌乃{(lán)、紅、黃三種不同顏色直接觀察到三種物質(zhì)分離的情況，并通過(guò)洗脫體積可以計(jì)算Vi、Vo和各自的Kd。 三、實(shí)驗(yàn)器材 玻璃色譜柱1cm×25cm，蠕動(dòng)泵，收集器。 四、試驗(yàn)試劑 交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50，藍(lán)

23、葡聚糖2000：配成2mg/mL溶液，細(xì)胞色素c：配成2mg/mL溶液。DNFP-甘氨酸（二硝基氟苯-甘氨酸）：稱取甘氨酸0.15g溶于10%NaHCO31.5mL中，此液pH應(yīng)在8.5～9.0左右，另取二硝基氟苯（DNFP）0.15g，溶于微熱的95%乙醇3mL中，待其充分溶解后，立即倒入甘氨酸液管中。將此管置于沸水浴煮沸5min（防止乙醇沸溢），待冷卻后加2倍體積的95%乙醇，可見(jiàn)黃色DNFP-甘氨酸沉淀，離心2000r/min，1.5min棄去上清液，沉淀用95%乙醇洗兩次，所得沉淀用蒸餾水1mL溶解即為DNFP-甘氨酸液，備用。 五、操作步驟 1.凝膠的準(zhǔn)備 稱取交聯(lián)葡聚糖G-5

24、0約4g，置于燒杯中，加蒸餾水適量平衡幾次，傾去上浮的系小顆粒，于沸水浴中煮沸1h（此為加熱法溶脹，如在室溫溶脹，需放置3h），取出，傾去商城業(yè)中的細(xì)顆粒，待冷卻至室溫后進(jìn)行裝柱。 2.樣品制備 取配置好的藍(lán)葡聚糖2000、細(xì)胞色素c和DNFP-甘氨酸各0.3mL，混合即可。 3.裝柱 將洗凈的色譜柱保持垂直位置，關(guān)閉出口，柱內(nèi)留下約2.0mL洗脫液。一次性將凝膠從塑料接口加入色譜柱內(nèi)，打開(kāi)柱底部出口，接通蠕動(dòng)泵，調(diào)節(jié)流速0.3mL/min。凝膠隨柱內(nèi)溶液慢慢流下而均勻沉降到色譜柱底部，最后使凝膠床沉降達(dá)20cm高，操作過(guò)程中注意不能讓凝膠床表面露出液體，以防色譜床內(nèi)出現(xiàn)“紋路”。在凝

25、膠表面可蓋一圓形濾紙，以免加入液體時(shí)沖起凝膠。 4.加樣 用滴管吸去凝膠床面上的溶液，使洗脫液恰好流到床表面，關(guān)閉出口，小心把樣品（約0.5mL）沿壁加于柱內(nèi)成一薄層。切勿攪動(dòng)床表面，打開(kāi)出口使樣品溶液滲入凝膠內(nèi)并開(kāi)始收集流出液，計(jì)量體積。 5.洗脫并收集 樣品流完后，分三次加入少量洗脫液洗下柱壁上樣品，最后接通蠕動(dòng)泵，調(diào)節(jié)流速為0.3mL/min，用部分收集器收集，每管1mL。仔細(xì)觀察樣品在色譜柱內(nèi)的分離現(xiàn)象。用肉眼觀察并以-、+符合記錄三種物質(zhì)洗脫液的顏色及深淺程度。 6.繪制洗脫曲線 以洗脫體積為橫坐標(biāo)，洗脫液的顏色度（-、+、++、+++）為縱坐標(biāo)（相應(yīng)指示出洗脫液內(nèi)物資濃

26、度的變化），在坐標(biāo)紙上作圖，即得洗脫曲線。 六、結(jié)果與討論 1、分析洗脫曲線，討論組分分離情況和試驗(yàn)注意點(diǎn)。 試驗(yàn)七 離子交換色譜分離氨基酸 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.熟悉離子交換色譜技術(shù)的基本原理和方法。 2.熟悉離子交換色譜分離氨基酸的基本原理和操作。 二、實(shí)驗(yàn)原理 氨基酸是兩性電解質(zhì)，有一定的等電點(diǎn)，在溶液pH小于其pI時(shí)帶正電，大于其pI時(shí)帶負(fù)電。故在一定的pH條件小，各種氨基酸的帶電情況不同，與離子交換劑上的交換基團(tuán)的親和力亦不同。因而得到分離。 本實(shí)驗(yàn)選用Dowex50做為離子交換劑，它是含磺酸基團(tuán)的強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換劑，分離的樣品為Asp、Gly、His三種氨基酸

27、的混合液，這三種氨基酸分別屬于酸性氨基酸、中性氨基酸和堿性氨基酸，它們?cè)趐H4.2的緩沖液中分別帶負(fù)電荷和不同量的正電荷，與Dowex50的磺酸基團(tuán)之間的親和力不同，因此被洗脫下來(lái)的順序亦不同，可以將三種不同的氨基酸分離開(kāi)來(lái)，將各收集管分別用茚三酮顯色鑒定。 三、實(shí)驗(yàn)器材 分光光度計(jì)，色譜柱（0.8cm×18cm），試管。 四、試驗(yàn)試劑 1）0.1mol/LNaOH。 2）氨基酸混合液 Asp、Gly、His各10mg溶于30mL0.06mol/LpH4.2檸檬酸鈉緩沖液中。 3）0.06mol/LpH4.2檸檬酸鈉緩沖液 取檸檬酸三鈉98.0g溶于蒸餾水中，再加入42mL濃

28、鹽酸和6mL80%苯酚（現(xiàn)用可不加苯酚），最終加蒸餾水至5000mL，用pH計(jì)調(diào)溶液pH至4.2。 4）茚三酮顯色液 稱取85mg茚三酮和15mg還原茚三酮，用10mL乙二醇溶解。 5）Dowex50的處理 Dowex50用蒸餾水充分浸泡后，用6mol/LHCl浸泡煮沸1h，然后用蒸餾水洗去HCl至樹(shù)脂呈中性，換15%NaOH浸泡1h，用蒸餾水洗去NaOH至樹(shù)脂呈中性，最后用pH4.2檸檬酸鈉緩沖液浸泡備用。 五、操作步驟 1）裝柱前準(zhǔn)備 用流水沖洗色譜柱，然后用蒸餾水沖洗，柱流水口裝上橡皮管放入2～3mL蒸餾水，按壓橡皮管內(nèi)氣泡，抬高流出管防止蒸餾水排空。 2）裝柱 將處理

29、好的Dowex50懸液小心倒入色譜柱內(nèi),待Dowex50自然下沉至柱下部時(shí),打開(kāi)下端放出液體,再慢慢加入懸液至Dowex50沉積面離色譜柱上緣約3cm時(shí)停止。裝柱時(shí)注意防止液面低于交換樹(shù)脂平面以及氣泡的產(chǎn)生。 3）平衡 用pH4.2的檸檬酸鈉緩沖液反復(fù)加在柱床上面，平衡10min，最后接通蠕動(dòng)泵，調(diào)節(jié)流速1mL/min。 4）加樣 柱內(nèi)緩沖液的液面與樹(shù)脂平面相平，但勿使樹(shù)脂露出液面，馬上用乳頭滴管滴加7滴樣品在樹(shù)脂平面上（注意不能使樹(shù)脂平面破壞）， 然后加少量緩沖液使樣品進(jìn)入柱內(nèi)，反復(fù)兩次，當(dāng)樣品完全進(jìn)入樹(shù)脂床后，接通蠕動(dòng)泵，用pH4.2的檸檬酸鈉緩沖液洗脫，部分收集器收集。 5）收

30、集與檢測(cè) 取12支試管編號(hào)，每管加入茚三酮顯色液20滴，依次收集洗脫液每管2mL，混勻，置沸水浴15min取出，觀色，用自來(lái)水冷卻后在波長(zhǎng)570nm處比色，當(dāng)收集至第二洗脫峰出現(xiàn)時(shí)（茚三酮顯色），即換用0.1mol/LNaOH溶液洗脫直至第三洗脫峰出現(xiàn)后，停止洗脫。 6）樹(shù)脂的再生 用0.1mol/LNaOH溶液洗脫色譜柱10min。 7）回收樹(shù)脂 拔去橡皮接收管用洗耳球?qū)χＡе鞒隹趯?shù)脂吹入裝樹(shù)脂的小瓶?jī)?nèi)加入0.1mol/LNaOH浸泡。 8）洗脫曲線的繪制 以吸光度為縱坐標(biāo)，洗脫體積為橫坐標(biāo)繪制曲線。 六、結(jié)果與討論 1、分析洗脫曲線，討論組分分離情況和試驗(yàn)注意事項(xiàng)。

31、 試驗(yàn)八 青霉素的萃取與萃取率的計(jì)算 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.學(xué)會(huì)利用溶劑萃取的方法對(duì)目的產(chǎn)物進(jìn)行提純。 2.掌握利用碘量法測(cè)定青霉素的含量，并計(jì)算出青霉素的萃取率。 二、實(shí)驗(yàn)原理 萃取過(guò)程是利用混合物質(zhì)在兩個(gè)不相混溶的液相中各種組分的溶解度的不同，從而達(dá)到分離的目的。pH為2.3時(shí)，青霉素在乙酸乙酯中比在水中溶解度大，因而可以將乙酸乙酯加到青霉素混合液中，并使其充分接觸，從而使青霉素被萃取濃集到乙酸乙酯中，達(dá)到分離提存的目的。 三、實(shí)驗(yàn)器材 分液漏斗，小燒杯，電子天平，酸式滴定管，移液管，容量瓶，量筒，玻璃棒，pH試紙。 四、試劑及藥品 1）Na2S2O3（0.1mol

32、/L） 取Na2S2O3約2.6g與無(wú)水Na2CO30.02g，加新煮沸過(guò)的冷蒸餾水適量溶解，定容到100mL。 2）碘溶液（0.1mol/L） 取碘1.3g，加KI3.6g與水5mL使之溶解，再加HCl1～2滴，定容到100mL。 3）HAc-NaAc（pH4.5）緩沖液 取83g無(wú)水NaAc溶于水，加入60mL冰醋酸，定容到1L。 4）NaOH液（1mol/L）、HCl液（1mol/L）、淀粉指示劑、乙酸乙酯、稀H2SO4、蒸餾水。 5）Dowex50的處理 Dowex50用蒸餾水充分浸泡后，用6mol/LHCl浸泡煮沸1h，然后用蒸餾水洗去HCl至樹(shù)脂呈中性，換15%NaO

33、H浸泡1h，用蒸餾水洗去NaOH至樹(shù)脂呈中性，最后用pH4.2檸檬酸鈉緩沖液浸泡備用。 五、操作步驟 （一）Na2S2O3的標(biāo)定 取K2Cr2O30.15g于碘量瓶中，加入50mL水，使之溶解，再加KI2g，溶解后加入稀H2SO440mL，搖勻，密閉，在暗處放置10min，取出后再加水250mL稀釋，用Na2S2O3滴定臨近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示劑3mL，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，記錄Na2S2O3消耗的體積。 （二）青霉素的萃取 1）用電子天平稱取0.12g青霉素鈉，溶解后定容到100mL。 2）取15mL乙酸乙酯液，用稀H2SO4調(diào)節(jié)pH在2.3～2.4之間，準(zhǔn)確移取10mL青霉素鈉溶液

34、與乙酸乙酯溶液融合，置于分液漏斗中，搖勻，靜置30min。 3）溶液分層后，講下層萃余相置于燒杯中備用，將上層萃取液回收。 （三）萃取率的計(jì)算 1）取5mL定容好的青霉素鈉溶液于碘量瓶中，加NaOH溶液1mL，放置20min，再加1mLHCl溶液與5mLHAc-NaAc緩沖液，精密加入碘滴定液5mL，搖勻，密閉，在20～25℃暗處放置20min，用Na2S2O3滴定液滴定，臨近終點(diǎn)時(shí)加淀粉指示劑3mL，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，記錄Na2S2O3消耗的體積（V對(duì)照）。 2）另取5mL定容好的青霉素鈉溶液于碘量瓶中，加入5mLHAc-NaAc緩沖液，再精密加入碘滴定液5mL，用滴定液滴定至藍(lán)色

35、消失，記錄Na2S2O3消耗的體積（V空白）。 3）取萃余項(xiàng)5mL于碘量瓶中，按步驟1）的方法進(jìn)行測(cè)定，記錄Na2S2O3消耗的體積（V樣品）。 六、結(jié)果與討論 1、數(shù)據(jù)處理 1）根據(jù)Na2S2O3-I2 2：1，分別計(jì)算操作步驟（三）——萃取率計(jì)算中各步滴定的碘的量I①、I②、I③。 2）萃取前與青霉素反應(yīng)的碘：總I2= I②- I①； 萃取后與青霉素反應(yīng)的碘：余I2= I②- I③； 3）根據(jù)青霉素-I2 1：8計(jì)算：萃取前青霉素含量和萃取后青霉素含量。 4）計(jì)算： 萃取率=（萃取前青霉素含量-萃取后青霉素含量）/萃取前青霉素含量 2、討論 pH的調(diào)節(jié)在提高青霉素萃取

36、效率方面的重要性。 試驗(yàn)九 蛋白質(zhì)的透析 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.學(xué)會(huì)透析的基本原理和操作； 二、實(shí)驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)是大分子物質(zhì)，它不能透過(guò)透析膜，而小分子物質(zhì)可以自由透過(guò)。在分離提純蛋白質(zhì)的過(guò)程中，常利用透析的方法使蛋白質(zhì)與其中夾雜的小分子物質(zhì)分開(kāi)。 三、實(shí)驗(yàn)器材 透析管或玻璃紙，燒杯，玻璃棒，電磁攪拌器，試管及試管。 四、試劑及藥品 蛋白質(zhì)的氯化鈉溶液（3個(gè)出去蛋黃的雞蛋蛋清與700mL 水及300mL飽和氯化鈉溶液混合后，用數(shù)層干紗布過(guò)濾），10％硝酸溶液，1％硝酸銀溶液，10％氫氧化鈉溶液，1%硫酸銅溶液。 五、操作步驟 1. 用蛋白質(zhì)溶液做雙縮脲反應(yīng)（加10%氫

37、氧化鈉溶液約1mL，震蕩搖勻，再加1％硫酸銅溶液1滴，震蕩，觀察出現(xiàn)的粉紅顏色）。 2. 透析袋的的預(yù)處理。將一適當(dāng)大小和長(zhǎng)度的透析管放在50％乙醇中煮沸1h（或浸泡一段時(shí)間），再用10g/LNa2CO3和1mmol/LEDTA洗滌，最后用蒸餾水洗滌2～3次，結(jié)扎管的一端。 3. 向火棉膠制成的透析管中裝入10～15mL蛋白質(zhì)溶液并放在盛有蒸餾水的燒杯中（或用玻璃紙裝入蛋白質(zhì)溶液后扎成袋形，系于一橫放在燒杯的玻璃棒上）。 4. 約1h后，至燒杯中取出水1～2mL水，加10%硝酸溶液數(shù)滴使成酸性，再加入1%硝酸銀溶液1～2滴，檢查氯離子的存在。 5. 從燒杯中另取出水1～2mL水，做雙縮

38、脲反應(yīng)，檢查是否有蛋白質(zhì)存在。 6. 不斷更換燒杯中的蒸餾水（并用電磁攪拌器不斷攪動(dòng)蒸餾水）以加速透析過(guò)程。數(shù)小時(shí)后從燒杯中的水中不能再檢出氯離子時(shí)，停止透析并檢查透析袋內(nèi)容物是否有蛋白質(zhì)或氯離子存在（此時(shí)應(yīng)觀察到透析袋中球蛋白沉淀的出現(xiàn)，這是因?yàn)榍虻鞍撞蝗苡诩兯木壒剩? 六、結(jié)果與討論 1從氯離子和雙縮脲反應(yīng)檢查結(jié)果，評(píng)價(jià)透析效果。 試驗(yàn)十 蛋白質(zhì)的真空濃縮 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.了解各種物質(zhì)的濃縮原理，熟練掌握濃縮的一般過(guò)程、常用的濃縮技術(shù)的操作方法。 2.通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作學(xué)會(huì)使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，掌握真空濃縮的原理及方法。分析試驗(yàn)現(xiàn)象，并能運(yùn)用文字表達(dá)技術(shù)報(bào)告。 二、實(shí)驗(yàn)

39、原理 蒸發(fā)濃縮是生產(chǎn)中使用最廣泛的濃縮方法，采用濃縮設(shè)備把物料加熱，使物料的易揮發(fā)部分水分在其沸點(diǎn)溫度時(shí)不斷地由液態(tài)變?yōu)闅鈶B(tài)，并將汽化時(shí)所產(chǎn)生的二次蒸汽不斷排除，從而使制品的濃度不斷提高，直至達(dá)到濃度要求。 真空濃縮設(shè)備是利用真空蒸發(fā)機(jī)或機(jī)械分離等方法達(dá)到物料濃縮。目前，為了提高濃縮產(chǎn)品的質(zhì)量，廣泛采用真空濃縮。即一般在8～18kPa低壓狀態(tài)下，以蒸汽間接加熱方式，對(duì)料液加熱，使其在低溫下沸騰蒸發(fā)，這樣物料溫度低，且加熱所用蒸汽與沸騰液料的溫差增大，在相同傳熱條件下，比常壓蒸發(fā)時(shí)的蒸發(fā)速率高，可減少液料營(yíng)養(yǎng)的損失，并可利用低壓蒸汽作蒸發(fā)熱源。一般低熱敏性高的物質(zhì)，都采用此方法來(lái)進(jìn)行濃縮。

40、 真空蒸發(fā)濃縮是濃縮蛋白質(zhì)的一種較好的方法，它即使蛋白質(zhì)不易變性，有保持蛋白質(zhì)中固有的成分。 三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（試驗(yàn)圖10-1）是應(yīng)用真空負(fù)壓條件下，恒溫加熱、薄膜蒸發(fā)的原理研制而成。本儀器采用進(jìn)口高檔變頻器控制，無(wú)級(jí)調(diào)速使玻璃旋轉(zhuǎn)瓶恒速旋轉(zhuǎn)，物料在瓶壁形成大面積均勻薄膜，再由可控恒溫水浴鍋對(duì)旋轉(zhuǎn)瓶均勻加熱，在系統(tǒng)抽真空條件下高速蒸發(fā)，溶劑蒸汽經(jīng)高效玻璃雙冷凝器冷卻，回收于收集瓶。本儀器另設(shè)有加料接口及放料機(jī)構(gòu)，便于蒸發(fā)過(guò)程中自動(dòng)、連續(xù)工作。 由于本儀器是在真空條件下工作，且與物料接觸部分全部采用耐高溫高硼硅玻璃和聚四氟乙烯材料，所以本儀器特別適用于對(duì)熱敏感性物料及對(duì)不銹鋼等

41、金屬材料有污蝕的物料的濃縮、結(jié)晶、分離以及溶劑回收。本儀器接觸面積大、蒸發(fā)效率高、使用方便、噪聲低、密封可靠，可處理易發(fā)泡物料，且規(guī)格齊全，已形成2L、5L、10L、20L、50L等多種規(guī)格。所以在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中受到了廣泛的歡迎，目前在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、科研和其他部門(mén)得到了廣泛的應(yīng)用。 四、操作步驟 1.工藝流程 1）粗大豆蛋白 低變形脫脂大豆粕粉→酸洗→離心分離→水洗→離心分離→解碎→中和→粗液體大豆蛋白。 2）冷凍濃縮大豆蛋白 粗大豆蛋白→裝料→真空濃縮大豆蛋白。 2.工藝過(guò)程 1）取一定量低變性脫脂大豆粕，先經(jīng)錘片式粉碎機(jī)粉碎，然后過(guò)100目篩，將過(guò)篩的豆粉裝入酸洗罐（玻璃

42、缸）中，按1：8（W/V）加入8倍用水浴鍋加熱到40℃的熱水，攪拌均勻后加入鹽酸調(diào)節(jié)pH為1.2～1.6，同時(shí)加入原料重2%的焦亞硫酸鈉漂白劑和適量消泡劑，酸洗60min。洗滌完畢后，用泥漿泵將酸洗罐內(nèi)的物料泵入臥式螺旋卸料離心機(jī)進(jìn)行離心分離。 2）將水浴鍋加水，設(shè)定溫度（40℃），然后打開(kāi)電源加熱，加熱好的熱水備用。 3）分離后棄去上清液，收集凝乳狀的沉淀，將分理處的酸洗凝乳裝入水洗罐（玻璃缸），加入8倍溫度40℃的熱水?dāng)嚢?。調(diào)節(jié)pH至4.2～4.6，水洗60min，洗滌完畢，用泥漿泵將水洗罐內(nèi)的物料泵入臥式螺旋沉降分離機(jī)進(jìn)行離心分離。 4）將分理出的凝乳在解碎機(jī)中解碎。然后送入中和罐

43、（大燒杯）中，罐的夾套內(nèi)通入冷卻水（大燒杯放入冰水中），使物料溫度降至28℃。加入氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)物料的pH至7.2，中和漿液。 5）將綜合蛋白漿漿液從入料口放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。 3.設(shè)備操作 1）首先在加熱盆中加入加熱介質(zhì)（蛋白質(zhì)），接通冷卻水。 2）接通電源，將需濃縮物料加入蒸發(fā)瓶中，旋緊蒸發(fā)瓶。 3）打開(kāi)自動(dòng)升降開(kāi)關(guān)，使蒸發(fā)瓶進(jìn)入加熱盆中。 4）打開(kāi)真空泵開(kāi)關(guān)，使蒸發(fā)瓶進(jìn)入加熱盆中。 5）打開(kāi)加熱盆開(kāi)關(guān)，緩慢升溫至物料沸騰，直至濃縮完成。 6）如在蒸發(fā)過(guò)程中需要補(bǔ)料，可通過(guò)自動(dòng)進(jìn)料管直接進(jìn)料。 7）蒸發(fā)完畢后，提起升降臺(tái)，關(guān)閉真空泵、冷卻水、加熱盆開(kāi)關(guān)，切斷電源。

44、8）破真空后，方可取下蒸發(fā)瓶，倒出濃縮好的物料。 9）最后倒出加熱介質(zhì)，對(duì)儀器及玻璃容器進(jìn)行清洗。 五、試驗(yàn)報(bào)告 色澤 粒度 氣味 水分 灰分 六、注意事項(xiàng) 1.玻璃容器只能用洗滌劑清洗，不能用去污粉和洗衣粉，防止劃傷瓶壁。 2.當(dāng)突然停電而又要提起升降臺(tái)時(shí)，可用手動(dòng)升降按鈕。 3. 升溫速度一定要慢，尤其在濃縮易揮發(fā)物料時(shí)。 試驗(yàn)十一 蛋白質(zhì)的冷凍干燥 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.通過(guò)試驗(yàn)了解真空冷凍干燥的基本知識(shí)及設(shè)備的操作過(guò)程。 二、實(shí)驗(yàn)原理 與曬干、煮干、烘干、噴霧干燥和真空干燥等在0℃以上或更高的溫度下進(jìn)行的干燥方法相比，冷凍干燥基本

45、上在0℃以下的溫度進(jìn)行，即在產(chǎn)品凍結(jié)的狀態(tài)下進(jìn)行，直到最后期，為了進(jìn)一步降低產(chǎn)品的殘余水分含量，才讓產(chǎn)品升至0℃以上的溫度，但一般也不超過(guò)40℃。 冷凍干燥就是把含有大量水分的物質(zhì)，預(yù)先進(jìn)行降溫凍結(jié)成固體，然后在真空條件下使水蒸氣直接升華出來(lái)，而物資本身剩留在凍結(jié)時(shí)的冰架中，因此它干燥后體積不變，疏松多孔。在升華時(shí)要吸收熱量，引起產(chǎn)品本身溫度的下降而減慢升華速度，為了增加升華速度，縮短干燥時(shí)間，必須要對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行適當(dāng)加熱。整個(gè)干燥是在較低的溫度下進(jìn)行的。 冷凍干燥目前在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、科研和其他部門(mén)得到廣泛的應(yīng)用。 三、實(shí)驗(yàn)材料設(shè)備 （1）實(shí)驗(yàn)材料 蛋白質(zhì)溶液 （2）實(shí)驗(yàn)設(shè)備

46、速凍設(shè)備（-38℃以下）、真空冷凍干燥機(jī)、冷凍縮濃機(jī)、天平等。 四、操作方法 1.工藝流程 真空冷凍干燥可按如下工藝流程圖進(jìn)行： 原料→前處理→速凍→真空脫水干燥→后處理 2.操作要點(diǎn) 1）前處理。采用冷凍濃縮的方法將蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行濃縮，并把樣品分裝在玻璃模子瓶、玻璃管子瓶或安，裝量要均勻，蒸發(fā)表面盡量大而厚度要盡量薄一些，產(chǎn)品厚度不要超過(guò)10mm。 2）速凍。將裝好的蛋白質(zhì)溶液速凍，溫度-35℃左右，時(shí)間約2.0h。凍結(jié)終了溫度約在-30℃，使物料的中心溫度在共晶點(diǎn)以下（溶質(zhì)和水都凍結(jié)的狀態(tài)稱為共晶體，凍結(jié)溫度成為共晶點(diǎn)）。 速凍的目的是將樣品內(nèi)的水分固化，并使凍干后產(chǎn)品與凍

47、結(jié)前具有相同的形態(tài)，以防止在升華過(guò)程中由于抽真空而使其發(fā)生濃縮、氣泡、收縮等不良現(xiàn)象。一般來(lái)說(shuō)，凍結(jié)越快，物品中結(jié)晶越小，對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損壞作用也越小。凍結(jié)時(shí)間短，蛋白質(zhì)在凝聚和濃縮作用下不會(huì)發(fā)生變質(zhì)。 3）真空脫水干燥。包括升華干燥和解析干燥兩個(gè)階段。 a.升華干燥。凍結(jié)后的樣品需迅速進(jìn)行真空升華干燥。樣品在真空條件下吸熱，冰晶就會(huì)升華成水蒸氣而從樣品表面逸出。升華過(guò)程是從樣品表面開(kāi)始逐漸向內(nèi)推移，在升華過(guò)程中，由于熱量不斷被升華熱帶走，要及時(shí)供給升華熱能，來(lái)維持升華溫度不變。當(dāng)樣品內(nèi)部的冰晶全部升華完畢，升華過(guò)程便完成。首先，將冷阱預(yù)冷至-35℃，打開(kāi)干燥倉(cāng)門(mén)，裝入預(yù)冷好的樣品瓶并關(guān)上倉(cāng)

48、門(mén)，啟動(dòng)真空機(jī)組進(jìn)行抽真空，當(dāng)真空度達(dá)到30～60Pa左右時(shí)，進(jìn)行加熱，這時(shí)凍結(jié)好的物料開(kāi)始升華干燥。但加熱不能太快或過(guò)量，否則溫度過(guò)高，超過(guò)共熔點(diǎn)，冰晶融化，會(huì)影響質(zhì)量。所以，料溫應(yīng)控制在-20～25℃之間，時(shí)間約為3～5h。 b.解析干燥。升華干燥后，樣品中仍含有少部分的結(jié)合水，較牢固。所以必須提高溫度，才能達(dá)到產(chǎn)品所要求的水分含量。料溫由-20℃升到45℃左右，當(dāng)料溫與板層溫度趨于一致時(shí)，干燥過(guò)程即可結(jié)束。 真空干燥時(shí)間約為8～9h。此時(shí)水分含量減至3%左右，停止加熱，破壞抽真空，出倉(cāng)。如此干燥的樣品能在80～90s內(nèi)用水復(fù)原，復(fù)原后仍具有類似于干燥前樣品的質(zhì)地。 4）后處理。當(dāng)倉(cāng)

49、內(nèi)真空度恢復(fù)接近大氣壓時(shí)打開(kāi)倉(cāng)門(mén)，開(kāi)始出倉(cāng)，將已干燥的樣品立即進(jìn)行檢查、稱重、包裝等。 3.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在真空凍干過(guò)程中影響因素很多，如物料厚度、預(yù)凍溫度和升華真空度等條件，可進(jìn)行多因素多水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳工藝參數(shù)。 五、試驗(yàn)報(bào)告 （1）做出凍干曲線 以溫度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)做出凍干曲線（把產(chǎn)品和板層的溫度、冷凝器溫度和真空度對(duì)照時(shí)間畫(huà)成的曲線稱為凍干曲線）。 （2）產(chǎn)品的評(píng)價(jià) a.感官指標(biāo)。外觀形狀飽滿（不塌陷）；斷面呈多孔海綿樣疏松狀；保持了原有的色澤；具有濃郁的芳香氣味。復(fù)水較快，復(fù)水后芳香氣味更濃。 b.衛(wèi)生指標(biāo)。應(yīng)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。 六、討論題 1.加熱升華時(shí)溫度是不是越低約好？為什么？ 2.凍干法與傳統(tǒng)干燥法相比有哪些優(yōu)點(diǎn)？ - 21 -