酵母細(xì)胞的破碎及破碎率的測定

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1、 試驗(yàn)一 酵母細(xì)胞的破碎及破碎率的測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.掌握超聲波破碎細(xì)胞的原理和操作； 2.學(xué)習(xí)細(xì)胞破碎率的評價方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 頻率超過15～20kHz的超聲波，在較高的輸入功率下（100～250W）可破碎細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用JY95-2D超生波細(xì)胞粉碎機(jī)，其工作原理是：JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)由超聲波發(fā)生器和換能器兩部分組成。超聲波發(fā)生器（電源）是將220V、50Hz的單相電通過變頻器件變?yōu)?0～25Hz、約600V的交變電能，并以適當(dāng)?shù)淖杩古c功率匹配來推動換能器工作，做縱向機(jī)械振動，震動波通過浸入在樣品中的鈦合金變速桿對破碎的各類細(xì)胞產(chǎn)生空化效應(yīng)，從而達(dá)到破碎細(xì)胞的目的

2、。 三、實(shí)驗(yàn)器材 超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，電子顯微鏡，酒精燈，載玻片，血細(xì)胞計數(shù)板，接種針。 四、試劑和材料 （1）酵母細(xì)胞懸浮液 0.2g/mL的啤酒酵母溶于50mmol/L乙酸鈉-乙酸緩沖溶液（pH為4.7）。 （2）馬鈴薯培養(yǎng)基 ①馬鈴薯（去皮切塊）200g；②瓊脂20g；③蔗糖20g；④蒸餾水1000mL；⑤pH為6.5。 選優(yōu)質(zhì)馬鈴薯去皮切塊，加水煮沸30min，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂，融化后補(bǔ)充加水至1000mL，分裝，115℃滅菌20min。 五、操作步驟 （1）啤酒酵母的培養(yǎng) ①菌種純化。 將酵母菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，28～30℃，培養(yǎng)3～4d，培養(yǎng)成熟后，

3、用接種環(huán)取一環(huán)酵母菌至8mL液體培養(yǎng)基中，28～30℃，培養(yǎng)24h。 ②擴(kuò)大培養(yǎng)。 將培養(yǎng)成熟的8mL液體培養(yǎng)基中的酵母菌全部轉(zhuǎn)接至80mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28～30℃，培養(yǎng)15～20h。 （2）破碎前計數(shù) 取1mL酵母細(xì)胞懸浮液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，用血細(xì)胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)。 （3）細(xì)胞超聲波破碎 ①將80mL酵母細(xì)胞懸浮液放入100mL容器中，液體浸沒超聲發(fā)射針1cm。 ②打開開關(guān)，將頻率設(shè)置中檔，超聲破碎1min，間歇1min，破碎20次。 ③取1mL破碎后的細(xì)胞懸浮液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，滴一滴在血細(xì)胞計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，用電子顯微鏡進(jìn)行觀察，計數(shù)。計算細(xì)胞破碎率。 ④破碎后

4、的細(xì)胞懸浮液，于12000r/min、4℃離心30min，去除細(xì)胞碎片。用Lowry法檢測上清液蛋白質(zhì)含量。 六、結(jié)果與討論 1、用顯微鏡觀察細(xì)胞破碎前后的形態(tài)變化。 2、用兩種方法對細(xì)胞破碎率進(jìn)行評價：一種是直接計數(shù)法，對破碎后的樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯螅ㄟ^在血球計數(shù)板上用顯微鏡觀察來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的計數(shù)，從而計算出破碎率；另一種是間接計數(shù)法，將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心分離掉固體（完整細(xì)胞和碎片），然后用Lowry法測量上清液中的蛋白質(zhì)含量，也可以評估細(xì)胞的破碎程度。 試驗(yàn)二 細(xì)胞核與線粒體的分級分離 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.了解離心分離的原理； 2.掌握差速離心法分離細(xì)胞器的方法及操

5、作。 二、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞內(nèi)不同的結(jié)構(gòu)，密度和大小都不相同，在同一離心場內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級分離出來。 分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行分離，其過程包括組織細(xì)胞勻漿、分級分離和分析三步，這種方法已成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。 （1）勻漿(Homogenization) 低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(zhì)(即0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化鈣)進(jìn)行破碎細(xì)胞使之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。 （2）分級分離(Fractiona

6、tion) 由低速到高速離心逐漸沉降。先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉淀下來，從而使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體等得以分離。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時均勻分布在整個離心管中，所以每級離心得到的第一次沉淀必然不是純的最重的顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化。 （3）分析 分級分離得到的組分，可用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。 三、實(shí)驗(yàn)器材 普通離心機(jī)，高速離心機(jī)，勻漿器，平皿，載玻片，顯微鏡。 四、試劑和材料 小白鼠，0.9%NaCl溶液，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化鈣，1%甲苯胺藍(lán)，0.02%詹納斯綠

7、B染液。 五、操作步驟 （一）細(xì)胞核的分離提取操作步驟 1.用頸椎脫位的方法處死小白鼠后，迅速剖開腹部取出肝臟，剪成小塊(去除結(jié)締組織)盡快置于盛有0.9％NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。 2.將濕重約1g的肝組織放在小平皿中，用量筒量取8ml預(yù)冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝組織后，再全部加入。 3.剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動研磨3～5次，用3層紗布過濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片I，做好標(biāo)記，自然干燥。

8、 4.將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機(jī)，以2500r/min離心15min；緩緩取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待分離線粒體用；同時涂一張上清液片Ⅱ做好標(biāo)記，自然干燥；余下的沉淀物進(jìn)行下一步驟。 ??? 5.用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以2500r/min離心15min，棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，涂片Ⅲ，自然干燥。 6.將I、Ⅱ、Ⅲ涂片用l％甲苯胺藍(lán)染色后蓋片即可觀察。 7.分別于高倍鏡下觀察三張圖片，描述鏡下所見。 （二）高速離心分離提取線粒體操作步驟 1.將裝有上清液的高速

9、離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000r/min離心20min，棄上清，留取沉淀物。 2.加入0.25mol／L蔗糖-0．003mol／L氯化鈣液lmL，用吸管吹打成懸液，以17000r/min離心20min，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物，加入0.1mL 0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化鈣溶液混勻成懸液(可用牙簽)。 3.取上清液和沉淀物懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上(分別標(biāo)記Ⅳ、Ⅴ涂片)，各滴一滴0.02％詹納斯綠B染液蓋上蓋片染20min。 4.油鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)顆粒狀的線粒體被詹納斯綠B染液染成藍(lán)綠色。 六、結(jié)果與討論 1、畫出說分離的細(xì)胞核和

10、線粒體的形態(tài)，并說明其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 2、解釋差速離心的分離原理。 試驗(yàn)三 胰凝乳蛋白酶的制備 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.掌握鹽析法分離酶的基本原理和操作； 2.掌握結(jié)晶的基本方法和操作； 3.學(xué)習(xí)胰凝乳蛋白酶制備的方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)分子表面帶有一定的電荷，因同種電荷相互排斥，使蛋白質(zhì)分子彼此分離；同時，蛋白質(zhì)分子表面分布著各種親水基團(tuán)，這些基團(tuán)與水分子相互作用形成水化膜，增加蛋白質(zhì)水溶液的穩(wěn)定性。如果在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，蛋白質(zhì)分子表面的電荷被大量中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。由于不同的蛋白質(zhì)分子表面所帶的電荷多少不同，

11、分布情況也不一樣，因此不同的蛋白質(zhì)鹽析所需的鹽濃度也各異。鹽析法就是通過控制鹽的濃度，使蛋白質(zhì)混合液中的各個成分分步析出，達(dá)到粗分離蛋白質(zhì)的目的。 三、實(shí)驗(yàn)器材 高速組織搗碎機(jī)，解剖刀，鑷子，剪刀，燒杯（50mL、100mL），離心機(jī)，離心管，漏斗，紗布，棉線，吸管（10mL、5mL、2mL、1mL、0.5mL），玻璃棒，滴管，透析袋，臺秤，分析天平，離心機(jī)。 四、試劑和材料 新鮮豬胰臟，0.125mol/LH2SO4溶液，固體（NH4）2SO4，1%酪蛋白溶液（稱取酪蛋白1.0g，加pH為8.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液100mL，在沸水中煮5min使之溶解，冰箱中保存），磷酸鹽

12、緩沖液（0.1mol/L，pH為7.4），0.1mol/LNaOH溶液，1%BaCl2。 五、操作步驟 整個操作過程在0～5℃條件下進(jìn)行。 （1）提取 取新鮮豬胰臟，放在盛有冰冷0.125mol/LH2SO4的容器中，保存在冰箱中待用。去除胰臟表面的脂肪和結(jié)締組織后稱重。用組織搗碎機(jī)絞碎，然后涽懸于2倍體積的冰冷0.125mol/LH2SO4溶液中，放冰箱內(nèi)過夜。將上述混懸液離心10min，上層液經(jīng)2層紗布過濾至燒杯中，將沉淀再混懸于等體積的冰冷的0.125mol/LH2SO4溶液中，再離心，將兩次上層液合并，即為提取液。 （2）分離 取提取液10mL，加固體（NH4）2SO41.

13、14g達(dá)0.2飽和度，放置10min，離心（3000r/min）10min。棄去沉淀，保留上清液。在上清液中加入固體（NH4）2SO41.323g達(dá)0.5飽和度，放置10min離心（3000r/min）10min。棄去上清液，保留沉淀。將沉淀溶解于3倍體積的水中，裝入透析袋中，用pH為7.4的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液透析，直至1%BaCl2檢查無白色BaSO4沉淀產(chǎn)生，然后離心（3000r/min）5min。棄去沉淀（變性的酶蛋白），保留上清液。在上清液中加（NH4）2SO4（0.39g/mL）達(dá)0.6飽和度，放置10min，離心（3000r/min）10min。棄去上清液，保留沉淀（即為

14、胰凝乳蛋白酶）。 （3）結(jié)晶 取分離所得的胰凝乳蛋白酶容于3倍體積的水中。然后加（NH4）2SO4（1.14g/mL）至胰凝乳蛋白酶溶液達(dá)0.25飽和度，用0.1mol/LNaOH調(diào)節(jié)至pH6.0，在室溫（25～30℃）放置12h即可出現(xiàn)結(jié)晶。 六、結(jié)果與討論 1、在顯微鏡下觀察胰凝乳蛋白酶的結(jié)晶形狀。 2、計算胰凝乳蛋白酶的得率。 3、分析影響胰凝乳蛋白酶得率的因素。 試驗(yàn)四 牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制備 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.掌握鹽析法和等電點(diǎn)沉淀法的原理和基本操作。 二、實(shí)驗(yàn)原理 乳蛋白素（α-lactalbumin）廣泛存在于乳品中，是乳糖合成所需要的重要

15、蛋白質(zhì)。牛奶中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白（casein），酪蛋白在pH4.8左右會沉淀析出。而乳蛋白素在pH3左右才會沉淀。利用這一性質(zhì)，可先將pH降至4.8，或是在加熱至40℃的牛奶中加硫酸鈉，將酪蛋白沉淀出來。酪蛋白不溶于乙醇，這個性質(zhì)被利用從酪蛋白粗制劑中出去脂類雜質(zhì)。將去除掉酪蛋白的濾液的pH調(diào)至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分雜質(zhì)可隨澄清液除去。再經(jīng)過一次pH沉淀后，即可得到粗乳蛋白素。 三、實(shí)驗(yàn)器材 燒杯（250mL、100mL、50mL），玻璃試管（10mm×100mm），離心管（50mL），磁力攪拌器，pH計，離心機(jī)。 四、試劑和材料 脫脂或低脂奶粉，無水硫酸鈉，0.1mo

16、l/LHCl，0.1mol/LNaOH，0.05mol/L碳酸氫銨，濾紙，pH試紙，濃鹽酸，0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH為4.6），乙醇。 五、操作步驟 （一）鹽析法或等電點(diǎn)沉淀法制備酪蛋白 1.將50mL牛乳倒入250mL燒杯中，于40℃水浴中加熱并攪拌。 2.在攪拌下緩慢加入10g無水硫酸鈉（約10min內(nèi)分次加入），之后再繼續(xù)攪拌10min（或加熱到40℃，再在攪拌下滿滿地加入50mL40左右的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，直到pH達(dá)到4.8左右，可以用酸度計調(diào)節(jié)。將上述懸浮液冷卻至室溫，然后靜置5min）。 3.將溶液用細(xì)布過濾，分別收集沉淀和濾液。將上述沉淀懸浮于30

17、mL乙醇中，傾于布式漏斗中，過濾出去乙醇溶液，抽干。將沉淀從布式漏斗中已出，在表面皿上攤開以除去乙醇，干燥后得到酪蛋白。準(zhǔn)確秤量。 （二）等電點(diǎn)沉淀法制備酪蛋白素 1.將操作步驟（一）所得的濾液置于100mL燒杯中，一邊攪拌，一邊利用pH計以濃鹽酸調(diào)整pH至3.0±0.1。 2.6000r/min離心15min，倒掉上清液。 3.在離心管內(nèi)加入10mL去離子水，震蕩，使館內(nèi)下層物重心懸浮，用0.1mol/LNaOH溶液調(diào)整pH至8.5～9.0（以pH試紙或pH計判定），此時大部分蛋白質(zhì)均會溶解。 4.6000r/min離心10min，將上清液倒入50mL燒杯中。 5.將燒杯置于磁力

18、攪拌器上，一邊攪拌，一邊利用pH計用0.1mol/LHCl調(diào)整pH至3.0±0.1。 6.6000r/min離心10min，倒掉上清液。沉淀取出干燥，并秤量。 六、結(jié)果與討論 1、計算出每100mL牛乳所制備出的酪蛋白數(shù)量，并與理論產(chǎn)量（3.5%）相比較。求出實(shí)際得率。 2、計算出每100mL牛乳所制備出的乳蛋白素的數(shù)量。 3、討論影響得率的因素。 試驗(yàn)五 大蒜細(xì)胞SOD酶的提取和分離 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.掌握有機(jī)溶劑沉淀法的原理和基本操作。 2.掌握SOD酶提取分離的一般步驟。 二、實(shí)驗(yàn)原理 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種

19、具有抗氧化、抗衰老、抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可催化超氧負(fù)離子（O2-）進(jìn)行岐化反應(yīng)，生成氧和過氧化氫。大蒜蒜瓣和懸浮培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞中含有較豐富的SOD，通過組織和細(xì)胞破碎后，可用pH7.8的磷酸緩沖液提取出來。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮將其沉淀析出。 有機(jī)溶劑沉淀的原理是有機(jī)溶劑能降低水溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子之間的靜電引力增大。同時，有機(jī)溶劑的親水性比溶質(zhì)分子的親水性強(qiáng)，它會搶奪本來與親水溶質(zhì)結(jié)合的自由水，破壞其表面的水化膜，導(dǎo)致溶質(zhì)分子之間的相互作用增大而發(fā)生聚集，從而沉淀析出。 三、實(shí)驗(yàn)器材 研缽，石英砂，燒杯（50mL），玻璃棒，pH計，冷凍離心機(jī)，離心管。 四、試

20、劑和材料 新鮮蒜瓣，0.05mol/L磷酸緩沖溶液（pH7.8），氯仿-乙醇混合液（氯仿-無水乙醇3：5），丙酮（用前預(yù)冷至-10℃）。 五、操作步驟 整個操作過程在0～5℃條件下進(jìn)行。 1.SOD酶的提取 稱取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎細(xì)胞后，加入0.05mol/L的磷酸緩沖液（pH7.8）15mL，繼續(xù)研磨20min，使SOD酶充分溶解到緩沖液中，然后6000r/min冷凍離心15min，棄沉淀，取上清液。 2.去除雜蛋白 上清液中加入0.25倍體積的氯仿-乙醇混合液攪拌15min，6000r/min離心15min，棄去沉淀，得到的上清液即為粗酶液。 3.SOD酶的沉

21、淀分離 粗酶液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，6000r/min離心15min，得到SOD酶沉淀。冷凍干燥后即得成品。對成品進(jìn)行稱量并測定酶活力。 六、結(jié)果與討論 1、計算出每500g大蒜蒜瓣所制備出的SOD酶的量。 2、討論有機(jī)溶劑沉淀法與鹽析法相比的優(yōu)缺點(diǎn)。 試驗(yàn)六 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.掌握凝膠色譜基本原理。 2.熟悉凝膠色譜法的操作。 3.了解物資在色譜柱中洗脫行為與分配系數(shù)哦的關(guān)系。 二、實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)將藍(lán)葡聚糖200（分子質(zhì)量2000kD）、細(xì)胞色素c（分子質(zhì)量17kD）和DNFP-甘氨酸（分子質(zhì)量0.5kD）的混合物通過交聯(lián)

22、葡聚糖凝膠G-50（Sephadex G-50）的色譜柱以蒸餾水為洗脫溶劑進(jìn)行洗脫。藍(lán)葡聚糖2000分子量最大，全部被排阻在凝膠顆粒的間隙中，而未進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，因而洗脫速度最快，最先流出柱，其Ve=Vo即Kd=0。DNFP-甘氨酸分子量最小不被排阻而可完全進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，洗脫速度最慢，最后流出柱，其Ve=Vi+Vo即Kd=1。細(xì)胞色素c分子量在上述二者之間，其洗脫速度居中。可以直接從藍(lán)、紅、黃三種不同顏色直接觀察到三種物質(zhì)分離的情況，并通過洗脫體積可以計算Vi、Vo和各自的Kd。 三、實(shí)驗(yàn)器材 玻璃色譜柱1cm×25cm，蠕動泵，收集器。 四、試驗(yàn)試劑 交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50，藍(lán)

23、葡聚糖2000：配成2mg/mL溶液，細(xì)胞色素c：配成2mg/mL溶液。DNFP-甘氨酸（二硝基氟苯-甘氨酸）：稱取甘氨酸0.15g溶于10%NaHCO31.5mL中，此液pH應(yīng)在8.5～9.0左右，另取二硝基氟苯（DNFP）0.15g，溶于微熱的95%乙醇3mL中，待其充分溶解后，立即倒入甘氨酸液管中。將此管置于沸水浴煮沸5min（防止乙醇沸溢），待冷卻后加2倍體積的95%乙醇，可見黃色DNFP-甘氨酸沉淀，離心2000r/min，1.5min棄去上清液，沉淀用95%乙醇洗兩次，所得沉淀用蒸餾水1mL溶解即為DNFP-甘氨酸液，備用。 五、操作步驟 1.凝膠的準(zhǔn)備 稱取交聯(lián)葡聚糖G-5

24、0約4g，置于燒杯中，加蒸餾水適量平衡幾次，傾去上浮的系小顆粒，于沸水浴中煮沸1h（此為加熱法溶脹，如在室溫溶脹，需放置3h），取出，傾去商城業(yè)中的細(xì)顆粒，待冷卻至室溫后進(jìn)行裝柱。 2.樣品制備 取配置好的藍(lán)葡聚糖2000、細(xì)胞色素c和DNFP-甘氨酸各0.3mL，混合即可。 3.裝柱 將洗凈的色譜柱保持垂直位置，關(guān)閉出口，柱內(nèi)留下約2.0mL洗脫液。一次性將凝膠從塑料接口加入色譜柱內(nèi)，打開柱底部出口，接通蠕動泵，調(diào)節(jié)流速0.3mL/min。凝膠隨柱內(nèi)溶液慢慢流下而均勻沉降到色譜柱底部，最后使凝膠床沉降達(dá)20cm高，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液體，以防色譜床內(nèi)出現(xiàn)“紋路”。在凝

25、膠表面可蓋一圓形濾紙，以免加入液體時沖起凝膠。 4.加樣 用滴管吸去凝膠床面上的溶液，使洗脫液恰好流到床表面，關(guān)閉出口，小心把樣品（約0.5mL）沿壁加于柱內(nèi)成一薄層。切勿攪動床表面，打開出口使樣品溶液滲入凝膠內(nèi)并開始收集流出液，計量體積。 5.洗脫并收集 樣品流完后，分三次加入少量洗脫液洗下柱壁上樣品，最后接通蠕動泵，調(diào)節(jié)流速為0.3mL/min，用部分收集器收集，每管1mL。仔細(xì)觀察樣品在色譜柱內(nèi)的分離現(xiàn)象。用肉眼觀察并以-、+符合記錄三種物質(zhì)洗脫液的顏色及深淺程度。 6.繪制洗脫曲線 以洗脫體積為橫坐標(biāo)，洗脫液的顏色度（-、+、++、+++）為縱坐標(biāo)（相應(yīng)指示出洗脫液內(nèi)物資濃

26、度的變化），在坐標(biāo)紙上作圖，即得洗脫曲線。 六、結(jié)果與討論 1、分析洗脫曲線，討論組分分離情況和試驗(yàn)注意點(diǎn)。 試驗(yàn)七 離子交換色譜分離氨基酸 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.熟悉離子交換色譜技術(shù)的基本原理和方法。 2.熟悉離子交換色譜分離氨基酸的基本原理和操作。 二、實(shí)驗(yàn)原理 氨基酸是兩性電解質(zhì)，有一定的等電點(diǎn)，在溶液pH小于其pI時帶正電，大于其pI時帶負(fù)電。故在一定的pH條件小，各種氨基酸的帶電情況不同，與離子交換劑上的交換基團(tuán)的親和力亦不同。因而得到分離。 本實(shí)驗(yàn)選用Dowex50做為離子交換劑，它是含磺酸基團(tuán)的強(qiáng)酸型陽離子交換劑，分離的樣品為Asp、Gly、His三種氨基酸

27、的混合液，這三種氨基酸分別屬于酸性氨基酸、中性氨基酸和堿性氨基酸，它們在pH4.2的緩沖液中分別帶負(fù)電荷和不同量的正電荷，與Dowex50的磺酸基團(tuán)之間的親和力不同，因此被洗脫下來的順序亦不同，可以將三種不同的氨基酸分離開來，將各收集管分別用茚三酮顯色鑒定。 三、實(shí)驗(yàn)器材 分光光度計，色譜柱（0.8cm×18cm），試管。 四、試驗(yàn)試劑 1）0.1mol/LNaOH。 2）氨基酸混合液 Asp、Gly、His各10mg溶于30mL0.06mol/LpH4.2檸檬酸鈉緩沖液中。 3）0.06mol/LpH4.2檸檬酸鈉緩沖液 取檸檬酸三鈉98.0g溶于蒸餾水中，再加入42mL濃

28、鹽酸和6mL80%苯酚（現(xiàn)用可不加苯酚），最終加蒸餾水至5000mL，用pH計調(diào)溶液pH至4.2。 4）茚三酮顯色液 稱取85mg茚三酮和15mg還原茚三酮，用10mL乙二醇溶解。 5）Dowex50的處理 Dowex50用蒸餾水充分浸泡后，用6mol/LHCl浸泡煮沸1h，然后用蒸餾水洗去HCl至樹脂呈中性，換15%NaOH浸泡1h，用蒸餾水洗去NaOH至樹脂呈中性，最后用pH4.2檸檬酸鈉緩沖液浸泡備用。 五、操作步驟 1）裝柱前準(zhǔn)備 用流水沖洗色譜柱，然后用蒸餾水沖洗，柱流水口裝上橡皮管放入2～3mL蒸餾水，按壓橡皮管內(nèi)氣泡，抬高流出管防止蒸餾水排空。 2）裝柱 將處理

29、好的Dowex50懸液小心倒入色譜柱內(nèi),待Dowex50自然下沉至柱下部時,打開下端放出液體,再慢慢加入懸液至Dowex50沉積面離色譜柱上緣約3cm時停止。裝柱時注意防止液面低于交換樹脂平面以及氣泡的產(chǎn)生。 3）平衡 用pH4.2的檸檬酸鈉緩沖液反復(fù)加在柱床上面，平衡10min，最后接通蠕動泵，調(diào)節(jié)流速1mL/min。 4）加樣 柱內(nèi)緩沖液的液面與樹脂平面相平，但勿使樹脂露出液面，馬上用乳頭滴管滴加7滴樣品在樹脂平面上（注意不能使樹脂平面破壞）， 然后加少量緩沖液使樣品進(jìn)入柱內(nèi)，反復(fù)兩次，當(dāng)樣品完全進(jìn)入樹脂床后，接通蠕動泵，用pH4.2的檸檬酸鈉緩沖液洗脫，部分收集器收集。 5）收

30、集與檢測 取12支試管編號，每管加入茚三酮顯色液20滴，依次收集洗脫液每管2mL，混勻，置沸水浴15min取出，觀色，用自來水冷卻后在波長570nm處比色，當(dāng)收集至第二洗脫峰出現(xiàn)時（茚三酮顯色），即換用0.1mol/LNaOH溶液洗脫直至第三洗脫峰出現(xiàn)后，停止洗脫。 6）樹脂的再生 用0.1mol/LNaOH溶液洗脫色譜柱10min。 7）回收樹脂 拔去橡皮接收管用洗耳球?qū)χＡе鞒隹趯渲等胙b樹脂的小瓶內(nèi)加入0.1mol/LNaOH浸泡。 8）洗脫曲線的繪制 以吸光度為縱坐標(biāo)，洗脫體積為橫坐標(biāo)繪制曲線。 六、結(jié)果與討論 1、分析洗脫曲線，討論組分分離情況和試驗(yàn)注意事項。

31、 試驗(yàn)八 青霉素的萃取與萃取率的計算 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.學(xué)會利用溶劑萃取的方法對目的產(chǎn)物進(jìn)行提純。 2.掌握利用碘量法測定青霉素的含量，并計算出青霉素的萃取率。 二、實(shí)驗(yàn)原理 萃取過程是利用混合物質(zhì)在兩個不相混溶的液相中各種組分的溶解度的不同，從而達(dá)到分離的目的。pH為2.3時，青霉素在乙酸乙酯中比在水中溶解度大，因而可以將乙酸乙酯加到青霉素混合液中，并使其充分接觸，從而使青霉素被萃取濃集到乙酸乙酯中，達(dá)到分離提存的目的。 三、實(shí)驗(yàn)器材 分液漏斗，小燒杯，電子天平，酸式滴定管，移液管，容量瓶，量筒，玻璃棒，pH試紙。 四、試劑及藥品 1）Na2S2O3（0.1mol

32、/L） 取Na2S2O3約2.6g與無水Na2CO30.02g，加新煮沸過的冷蒸餾水適量溶解，定容到100mL。 2）碘溶液（0.1mol/L） 取碘1.3g，加KI3.6g與水5mL使之溶解，再加HCl1～2滴，定容到100mL。 3）HAc-NaAc（pH4.5）緩沖液 取83g無水NaAc溶于水，加入60mL冰醋酸，定容到1L。 4）NaOH液（1mol/L）、HCl液（1mol/L）、淀粉指示劑、乙酸乙酯、稀H2SO4、蒸餾水。 5）Dowex50的處理 Dowex50用蒸餾水充分浸泡后，用6mol/LHCl浸泡煮沸1h，然后用蒸餾水洗去HCl至樹脂呈中性，換15%NaO

33、H浸泡1h，用蒸餾水洗去NaOH至樹脂呈中性，最后用pH4.2檸檬酸鈉緩沖液浸泡備用。 五、操作步驟 （一）Na2S2O3的標(biāo)定 取K2Cr2O30.15g于碘量瓶中，加入50mL水，使之溶解，再加KI2g，溶解后加入稀H2SO440mL，搖勻，密閉，在暗處放置10min，取出后再加水250mL稀釋，用Na2S2O3滴定臨近終點(diǎn)時，加淀粉指示劑3mL，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，記錄Na2S2O3消耗的體積。 （二）青霉素的萃取 1）用電子天平稱取0.12g青霉素鈉，溶解后定容到100mL。 2）取15mL乙酸乙酯液，用稀H2SO4調(diào)節(jié)pH在2.3～2.4之間，準(zhǔn)確移取10mL青霉素鈉溶液

34、與乙酸乙酯溶液融合，置于分液漏斗中，搖勻，靜置30min。 3）溶液分層后，講下層萃余相置于燒杯中備用，將上層萃取液回收。 （三）萃取率的計算 1）取5mL定容好的青霉素鈉溶液于碘量瓶中，加NaOH溶液1mL，放置20min，再加1mLHCl溶液與5mLHAc-NaAc緩沖液，精密加入碘滴定液5mL，搖勻，密閉，在20～25℃暗處放置20min，用Na2S2O3滴定液滴定，臨近終點(diǎn)時加淀粉指示劑3mL，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，記錄Na2S2O3消耗的體積（V對照）。 2）另取5mL定容好的青霉素鈉溶液于碘量瓶中，加入5mLHAc-NaAc緩沖液，再精密加入碘滴定液5mL，用滴定液滴定至藍(lán)色

35、消失，記錄Na2S2O3消耗的體積（V空白）。 3）取萃余項5mL于碘量瓶中，按步驟1）的方法進(jìn)行測定，記錄Na2S2O3消耗的體積（V樣品）。 六、結(jié)果與討論 1、數(shù)據(jù)處理 1）根據(jù)Na2S2O3-I2 2：1，分別計算操作步驟（三）——萃取率計算中各步滴定的碘的量I①、I②、I③。 2）萃取前與青霉素反應(yīng)的碘：總I2= I②- I①； 萃取后與青霉素反應(yīng)的碘：余I2= I②- I③； 3）根據(jù)青霉素-I2 1：8計算：萃取前青霉素含量和萃取后青霉素含量。 4）計算： 萃取率=（萃取前青霉素含量-萃取后青霉素含量）/萃取前青霉素含量 2、討論 pH的調(diào)節(jié)在提高青霉素萃取

36、效率方面的重要性。 試驗(yàn)九 蛋白質(zhì)的透析 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.學(xué)會透析的基本原理和操作； 二、實(shí)驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)是大分子物質(zhì)，它不能透過透析膜，而小分子物質(zhì)可以自由透過。在分離提純蛋白質(zhì)的過程中，常利用透析的方法使蛋白質(zhì)與其中夾雜的小分子物質(zhì)分開。 三、實(shí)驗(yàn)器材 透析管或玻璃紙，燒杯，玻璃棒，電磁攪拌器，試管及試管。 四、試劑及藥品 蛋白質(zhì)的氯化鈉溶液（3個出去蛋黃的雞蛋蛋清與700mL 水及300mL飽和氯化鈉溶液混合后，用數(shù)層干紗布過濾），10％硝酸溶液，1％硝酸銀溶液，10％氫氧化鈉溶液，1%硫酸銅溶液。 五、操作步驟 1. 用蛋白質(zhì)溶液做雙縮脲反應(yīng)（加10%氫

37、氧化鈉溶液約1mL，震蕩搖勻，再加1％硫酸銅溶液1滴，震蕩，觀察出現(xiàn)的粉紅顏色）。 2. 透析袋的的預(yù)處理。將一適當(dāng)大小和長度的透析管放在50％乙醇中煮沸1h（或浸泡一段時間），再用10g/LNa2CO3和1mmol/LEDTA洗滌，最后用蒸餾水洗滌2～3次，結(jié)扎管的一端。 3. 向火棉膠制成的透析管中裝入10～15mL蛋白質(zhì)溶液并放在盛有蒸餾水的燒杯中（或用玻璃紙裝入蛋白質(zhì)溶液后扎成袋形，系于一橫放在燒杯的玻璃棒上）。 4. 約1h后，至燒杯中取出水1～2mL水，加10%硝酸溶液數(shù)滴使成酸性，再加入1%硝酸銀溶液1～2滴，檢查氯離子的存在。 5. 從燒杯中另取出水1～2mL水，做雙縮

38、脲反應(yīng)，檢查是否有蛋白質(zhì)存在。 6. 不斷更換燒杯中的蒸餾水（并用電磁攪拌器不斷攪動蒸餾水）以加速透析過程。數(shù)小時后從燒杯中的水中不能再檢出氯離子時，停止透析并檢查透析袋內(nèi)容物是否有蛋白質(zhì)或氯離子存在（此時應(yīng)觀察到透析袋中球蛋白沉淀的出現(xiàn)，這是因?yàn)榍虻鞍撞蝗苡诩兯木壒剩? 六、結(jié)果與討論 1從氯離子和雙縮脲反應(yīng)檢查結(jié)果，評價透析效果。 試驗(yàn)十 蛋白質(zhì)的真空濃縮 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.了解各種物質(zhì)的濃縮原理，熟練掌握濃縮的一般過程、常用的濃縮技術(shù)的操作方法。 2.通過實(shí)驗(yàn)操作學(xué)會使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，掌握真空濃縮的原理及方法。分析試驗(yàn)現(xiàn)象，并能運(yùn)用文字表達(dá)技術(shù)報告。 二、實(shí)驗(yàn)

39、原理 蒸發(fā)濃縮是生產(chǎn)中使用最廣泛的濃縮方法，采用濃縮設(shè)備把物料加熱，使物料的易揮發(fā)部分水分在其沸點(diǎn)溫度時不斷地由液態(tài)變?yōu)闅鈶B(tài)，并將汽化時所產(chǎn)生的二次蒸汽不斷排除，從而使制品的濃度不斷提高，直至達(dá)到濃度要求。 真空濃縮設(shè)備是利用真空蒸發(fā)機(jī)或機(jī)械分離等方法達(dá)到物料濃縮。目前，為了提高濃縮產(chǎn)品的質(zhì)量，廣泛采用真空濃縮。即一般在8～18kPa低壓狀態(tài)下，以蒸汽間接加熱方式，對料液加熱，使其在低溫下沸騰蒸發(fā)，這樣物料溫度低，且加熱所用蒸汽與沸騰液料的溫差增大，在相同傳熱條件下，比常壓蒸發(fā)時的蒸發(fā)速率高，可減少液料營養(yǎng)的損失，并可利用低壓蒸汽作蒸發(fā)熱源。一般低熱敏性高的物質(zhì)，都采用此方法來進(jìn)行濃縮。

40、 真空蒸發(fā)濃縮是濃縮蛋白質(zhì)的一種較好的方法，它即使蛋白質(zhì)不易變性，有保持蛋白質(zhì)中固有的成分。 三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（試驗(yàn)圖10-1）是應(yīng)用真空負(fù)壓條件下，恒溫加熱、薄膜蒸發(fā)的原理研制而成。本儀器采用進(jìn)口高檔變頻器控制，無級調(diào)速使玻璃旋轉(zhuǎn)瓶恒速旋轉(zhuǎn)，物料在瓶壁形成大面積均勻薄膜，再由可控恒溫水浴鍋對旋轉(zhuǎn)瓶均勻加熱，在系統(tǒng)抽真空條件下高速蒸發(fā)，溶劑蒸汽經(jīng)高效玻璃雙冷凝器冷卻，回收于收集瓶。本儀器另設(shè)有加料接口及放料機(jī)構(gòu)，便于蒸發(fā)過程中自動、連續(xù)工作。 由于本儀器是在真空條件下工作，且與物料接觸部分全部采用耐高溫高硼硅玻璃和聚四氟乙烯材料，所以本儀器特別適用于對熱敏感性物料及對不銹鋼等

41、金屬材料有污蝕的物料的濃縮、結(jié)晶、分離以及溶劑回收。本儀器接觸面積大、蒸發(fā)效率高、使用方便、噪聲低、密封可靠，可處理易發(fā)泡物料，且規(guī)格齊全，已形成2L、5L、10L、20L、50L等多種規(guī)格。所以在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中受到了廣泛的歡迎，目前在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、科研和其他部門得到了廣泛的應(yīng)用。 四、操作步驟 1.工藝流程 1）粗大豆蛋白 低變形脫脂大豆粕粉→酸洗→離心分離→水洗→離心分離→解碎→中和→粗液體大豆蛋白。 2）冷凍濃縮大豆蛋白 粗大豆蛋白→裝料→真空濃縮大豆蛋白。 2.工藝過程 1）取一定量低變性脫脂大豆粕，先經(jīng)錘片式粉碎機(jī)粉碎，然后過100目篩，將過篩的豆粉裝入酸洗罐（玻璃

42、缸）中，按1：8（W/V）加入8倍用水浴鍋加熱到40℃的熱水，攪拌均勻后加入鹽酸調(diào)節(jié)pH為1.2～1.6，同時加入原料重2%的焦亞硫酸鈉漂白劑和適量消泡劑，酸洗60min。洗滌完畢后，用泥漿泵將酸洗罐內(nèi)的物料泵入臥式螺旋卸料離心機(jī)進(jìn)行離心分離。 2）將水浴鍋加水，設(shè)定溫度（40℃），然后打開電源加熱，加熱好的熱水備用。 3）分離后棄去上清液，收集凝乳狀的沉淀，將分理處的酸洗凝乳裝入水洗罐（玻璃缸），加入8倍溫度40℃的熱水?dāng)嚢?。調(diào)節(jié)pH至4.2～4.6，水洗60min，洗滌完畢，用泥漿泵將水洗罐內(nèi)的物料泵入臥式螺旋沉降分離機(jī)進(jìn)行離心分離。 4）將分理出的凝乳在解碎機(jī)中解碎。然后送入中和罐

43、（大燒杯）中，罐的夾套內(nèi)通入冷卻水（大燒杯放入冰水中），使物料溫度降至28℃。加入氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)物料的pH至7.2，中和漿液。 5）將綜合蛋白漿漿液從入料口放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。 3.設(shè)備操作 1）首先在加熱盆中加入加熱介質(zhì)（蛋白質(zhì)），接通冷卻水。 2）接通電源，將需濃縮物料加入蒸發(fā)瓶中，旋緊蒸發(fā)瓶。 3）打開自動升降開關(guān)，使蒸發(fā)瓶進(jìn)入加熱盆中。 4）打開真空泵開關(guān)，使蒸發(fā)瓶進(jìn)入加熱盆中。 5）打開加熱盆開關(guān)，緩慢升溫至物料沸騰，直至濃縮完成。 6）如在蒸發(fā)過程中需要補(bǔ)料，可通過自動進(jìn)料管直接進(jìn)料。 7）蒸發(fā)完畢后，提起升降臺，關(guān)閉真空泵、冷卻水、加熱盆開關(guān)，切斷電源。

44、8）破真空后，方可取下蒸發(fā)瓶，倒出濃縮好的物料。 9）最后倒出加熱介質(zhì)，對儀器及玻璃容器進(jìn)行清洗。 五、試驗(yàn)報告 色澤 粒度 氣味 水分 灰分 六、注意事項 1.玻璃容器只能用洗滌劑清洗，不能用去污粉和洗衣粉，防止劃傷瓶壁。 2.當(dāng)突然停電而又要提起升降臺時，可用手動升降按鈕。 3. 升溫速度一定要慢，尤其在濃縮易揮發(fā)物料時。 試驗(yàn)十一 蛋白質(zhì)的冷凍干燥 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1.通過試驗(yàn)了解真空冷凍干燥的基本知識及設(shè)備的操作過程。 二、實(shí)驗(yàn)原理 與曬干、煮干、烘干、噴霧干燥和真空干燥等在0℃以上或更高的溫度下進(jìn)行的干燥方法相比，冷凍干燥基本

45、上在0℃以下的溫度進(jìn)行，即在產(chǎn)品凍結(jié)的狀態(tài)下進(jìn)行，直到最后期，為了進(jìn)一步降低產(chǎn)品的殘余水分含量，才讓產(chǎn)品升至0℃以上的溫度，但一般也不超過40℃。 冷凍干燥就是把含有大量水分的物質(zhì)，預(yù)先進(jìn)行降溫凍結(jié)成固體，然后在真空條件下使水蒸氣直接升華出來，而物資本身剩留在凍結(jié)時的冰架中，因此它干燥后體積不變，疏松多孔。在升華時要吸收熱量，引起產(chǎn)品本身溫度的下降而減慢升華速度，為了增加升華速度，縮短干燥時間，必須要對產(chǎn)品進(jìn)行適當(dāng)加熱。整個干燥是在較低的溫度下進(jìn)行的。 冷凍干燥目前在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、科研和其他部門得到廣泛的應(yīng)用。 三、實(shí)驗(yàn)材料設(shè)備 （1）實(shí)驗(yàn)材料 蛋白質(zhì)溶液 （2）實(shí)驗(yàn)設(shè)備

46、速凍設(shè)備（-38℃以下）、真空冷凍干燥機(jī)、冷凍縮濃機(jī)、天平等。 四、操作方法 1.工藝流程 真空冷凍干燥可按如下工藝流程圖進(jìn)行： 原料→前處理→速凍→真空脫水干燥→后處理 2.操作要點(diǎn) 1）前處理。采用冷凍濃縮的方法將蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行濃縮，并把樣品分裝在玻璃模子瓶、玻璃管子瓶或安，裝量要均勻，蒸發(fā)表面盡量大而厚度要盡量薄一些，產(chǎn)品厚度不要超過10mm。 2）速凍。將裝好的蛋白質(zhì)溶液速凍，溫度-35℃左右，時間約2.0h。凍結(jié)終了溫度約在-30℃，使物料的中心溫度在共晶點(diǎn)以下（溶質(zhì)和水都凍結(jié)的狀態(tài)稱為共晶體，凍結(jié)溫度成為共晶點(diǎn)）。 速凍的目的是將樣品內(nèi)的水分固化，并使凍干后產(chǎn)品與凍

47、結(jié)前具有相同的形態(tài)，以防止在升華過程中由于抽真空而使其發(fā)生濃縮、氣泡、收縮等不良現(xiàn)象。一般來說，凍結(jié)越快，物品中結(jié)晶越小，對細(xì)胞的機(jī)械損壞作用也越小。凍結(jié)時間短，蛋白質(zhì)在凝聚和濃縮作用下不會發(fā)生變質(zhì)。 3）真空脫水干燥。包括升華干燥和解析干燥兩個階段。 a.升華干燥。凍結(jié)后的樣品需迅速進(jìn)行真空升華干燥。樣品在真空條件下吸熱，冰晶就會升華成水蒸氣而從樣品表面逸出。升華過程是從樣品表面開始逐漸向內(nèi)推移，在升華過程中，由于熱量不斷被升華熱帶走，要及時供給升華熱能，來維持升華溫度不變。當(dāng)樣品內(nèi)部的冰晶全部升華完畢，升華過程便完成。首先，將冷阱預(yù)冷至-35℃，打開干燥倉門，裝入預(yù)冷好的樣品瓶并關(guān)上倉

48、門，啟動真空機(jī)組進(jìn)行抽真空，當(dāng)真空度達(dá)到30～60Pa左右時，進(jìn)行加熱，這時凍結(jié)好的物料開始升華干燥。但加熱不能太快或過量，否則溫度過高，超過共熔點(diǎn)，冰晶融化，會影響質(zhì)量。所以，料溫應(yīng)控制在-20～25℃之間，時間約為3～5h。 b.解析干燥。升華干燥后，樣品中仍含有少部分的結(jié)合水，較牢固。所以必須提高溫度，才能達(dá)到產(chǎn)品所要求的水分含量。料溫由-20℃升到45℃左右，當(dāng)料溫與板層溫度趨于一致時，干燥過程即可結(jié)束。 真空干燥時間約為8～9h。此時水分含量減至3%左右，停止加熱，破壞抽真空，出倉。如此干燥的樣品能在80～90s內(nèi)用水復(fù)原，復(fù)原后仍具有類似于干燥前樣品的質(zhì)地。 4）后處理。當(dāng)倉

49、內(nèi)真空度恢復(fù)接近大氣壓時打開倉門，開始出倉，將已干燥的樣品立即進(jìn)行檢查、稱重、包裝等。 3.實(shí)驗(yàn)設(shè)計 在真空凍干過程中影響因素很多，如物料厚度、預(yù)凍溫度和升華真空度等條件，可進(jìn)行多因素多水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳工藝參數(shù)。 五、試驗(yàn)報告 （1）做出凍干曲線 以溫度為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)做出凍干曲線（把產(chǎn)品和板層的溫度、冷凝器溫度和真空度對照時間畫成的曲線稱為凍干曲線）。 （2）產(chǎn)品的評價 a.感官指標(biāo)。外觀形狀飽滿（不塌陷）；斷面呈多孔海綿樣疏松狀；保持了原有的色澤；具有濃郁的芳香氣味。復(fù)水較快，復(fù)水后芳香氣味更濃。 b.衛(wèi)生指標(biāo)。應(yīng)符合國家標(biāo)準(zhǔn)。 六、討論題 1.加熱升華時溫度是不是越低約好？為什么？ 2.凍干法與傳統(tǒng)干燥法相比有哪些優(yōu)點(diǎn)？ - 21 -