動(dòng)物墊料中肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)方法 編制說(shuō)明

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DB15/T XXXXX—XXXX 編制說(shuō)明 項(xiàng)目名稱(chēng)：動(dòng)物墊料中肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)方法 項(xiàng)目編號(hào)： 內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函（2019）170號(hào)-2 編制單位： 呼和浩特海關(guān) 編制時(shí)間： 2019.5-2020.4 一、工作簡(jiǎn)況 本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局關(guān)于下達(dá)2019年第一批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃的通知》[內(nèi)市監(jiān)標(biāo)準(zhǔn)字〔2019〕170號(hào)]，本標(biāo)準(zhǔn)是由呼和浩特海關(guān)提出并歸口，項(xiàng)目計(jì)劃編號(hào)為2。呼和浩特海關(guān)牽頭成立由相關(guān)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員和具有標(biāo)準(zhǔn)化專(zhuān)業(yè)知識(shí)的人員組成的標(biāo)準(zhǔn)起草組。起草組在充分調(diào)查研究、綜合分析和試驗(yàn)驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，起草標(biāo)準(zhǔn)初稿和編制說(shuō)明，并廣泛征求意見(jiàn)。對(duì)意見(jiàn)進(jìn)行匯總整理，修改完善標(biāo)準(zhǔn)初稿，形成地方標(biāo)準(zhǔn)送審稿。 起草單位：中華人民共和國(guó)呼和浩特海關(guān)。主要起草人：王海艷、靳木子、趙治國(guó)、郝廣福、敖威華、云華、崔強(qiáng)、陳林軍、延涵、郭文秀、陳宇飛。 二、標(biāo)準(zhǔn)制定的背景及意義 動(dòng)物墊料與動(dòng)物關(guān)系密切。近年來(lái)隨著生物科學(xué)研究的飛速發(fā)展，動(dòng)物作為其研究中不可缺少的重要組成部分，備受各國(guó)政府的重視和科學(xué)家的關(guān)注。墊料是為動(dòng)物營(yíng)造舒適的人工環(huán)境，進(jìn)行環(huán)境控制的基礎(chǔ)條件和必要材料，是對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生直接作用和影響的環(huán)境因素。動(dòng)物墊料與動(dòng)物健康、福利息息相關(guān)，同時(shí)也對(duì)養(yǎng)殖業(yè)、動(dòng)物及其相關(guān)科研方面甚至社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有十分重大的影響。因此，墊料的質(zhì)量評(píng)定與控制非常必要。 我國(guó)動(dòng)物墊料標(biāo)準(zhǔn)化、商品化尚處于初級(jí)階段。歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家早已實(shí)行墊料商品化生產(chǎn)，有專(zhuān)業(yè)的工廠，并且各道工序的質(zhì)量要求非常嚴(yán)格。而我國(guó)對(duì)動(dòng)物墊料的研究還處于初級(jí)階段，與墊料相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道甚少，墊料生產(chǎn)監(jiān)管環(huán)節(jié)薄弱，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)缺乏。近年來(lái)我國(guó)政府及從業(yè)人員逐漸認(rèn)識(shí)到動(dòng)物墊料中存在的問(wèn)題，開(kāi)始對(duì)墊料質(zhì)量評(píng)價(jià)方面的問(wèn)題進(jìn)行改進(jìn)。因此要想使動(dòng)物的質(zhì)量管理與國(guó)際接軌，動(dòng)物墊料生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化管理就變得至關(guān)重要。 我國(guó)動(dòng)物墊料標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量管理相對(duì)滯后，影響相關(guān)行業(yè)發(fā)展。我國(guó)對(duì)動(dòng)物墊料的研究才剛剛起步，現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)管理?xiàng)l例中，對(duì)動(dòng)物墊料的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定幾乎空白，稀數(shù)資料對(duì)于墊料的規(guī)定只有：應(yīng)選用吸濕性好、塵埃少、無(wú)異味、無(wú)毒性、無(wú)油脂的材料；須經(jīng)消毒、滅菌后方可使用。如此籠統(tǒng)的規(guī)定在一定程度上制約了我國(guó)動(dòng)物墊料標(biāo)準(zhǔn)不能緊跟國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)限制了藥品、生物制品、動(dòng)物等產(chǎn)品的出口，還使科研論文將不能被同行接受。因此要想提高相關(guān)學(xué)科競(jìng)爭(zhēng)力，就必須加強(qiáng)墊料標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量管理，從動(dòng)物墊料微生物指標(biāo)監(jiān)測(cè)入手。 我國(guó)動(dòng)物墊料微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)幾乎空白，亟待建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。近年來(lái)，我國(guó)政府及從業(yè)人員逐漸認(rèn)識(shí)到動(dòng)物墊料對(duì)動(dòng)物健康及下游產(chǎn)業(yè)的重大意義，墊料相關(guān)研究報(bào)道逐年增多，積累了一定的理論基礎(chǔ)。但目前，我國(guó)尚未對(duì)國(guó)內(nèi)墊料質(zhì)量建立統(tǒng)一評(píng)價(jià)體系、風(fēng)險(xiǎn)分析、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及配套法規(guī)。其中，墊料中微生物特別是致病微生物對(duì)動(dòng)物健康、福利和產(chǎn)品等影響重大，但目前動(dòng)物墊料中微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)屬于空白，亟待建立科學(xué)完善的動(dòng)物墊料微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，該工作將對(duì)國(guó)內(nèi)墊料建立統(tǒng)一質(zhì)量評(píng)價(jià)體系、風(fēng)險(xiǎn)分析及產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)等有力促進(jìn)。 動(dòng)物墊料中肺炎克雷伯菌對(duì)動(dòng)物的危害極大。肺炎克雷伯菌是腸桿菌科克雷伯氏菌屬中最為重要的一類(lèi)菌（俗稱(chēng)肺炎桿菌），其所致疾病占克雷伯氏菌屬感染的95%以上。肺炎克雷伯菌廣泛分布于自然界，近年來(lái)成為僅次于大腸桿菌的最重要的條件致病菌,主要存在于人和動(dòng)物腸道、呼吸道、泌尿生殖道，肺炎克雷伯菌可在全身各部位發(fā)生感染，但最高的發(fā)病率在尿路和呼吸道。當(dāng)機(jī)體免疫力降低或長(zhǎng)期大量使用抗生素導(dǎo)致菌群失調(diào)時(shí)可引起感染，引發(fā)肺炎、腦膜炎、肝膿腫、眼內(nèi)炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎、傷口感染、全身敗血癥等，給臨床治療帶來(lái)了很大困難，發(fā)病死亡率極高,肺炎克雷伯菌是新生兒、免疫低下宿主、經(jīng)外科途徑感染的易感患者、糖尿病、腫瘤患者的主要危脅。肺炎克雷伯菌是醫(yī)院獲得性肺炎（HAP)的常見(jiàn)致病菌。馬來(lái)西亞檳城肺炎克雷伯菌為醫(yī)院獲得性肺炎的第二大致病菌，占7.2%。我國(guó)肺炎克雷伯菌醫(yī)院獲得性肺炎發(fā)病率高，占3.33%,重癥加強(qiáng)護(hù)理病房是肺炎克雷伯菌肺部感染的高發(fā)區(qū)，尤其是機(jī)械通氣的患者，研究表明機(jī)械通氣相關(guān)肺炎（VAP)發(fā)生率為9%-45%。南美發(fā)展中國(guó)家重癥加強(qiáng)護(hù)理病房?jī)?nèi)肺炎克雷伯菌肺炎發(fā)病率高達(dá)27%,俄羅斯早產(chǎn)兒機(jī)械通氣相關(guān)肺炎克雷伯菌檢出率更高達(dá)31%,新生兒病區(qū)也易于發(fā)生和流行肺炎克雷伯菌肺炎。在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)，造成化膿性肝膿腫的菌株中，以肺炎克雷伯菌最為常見(jiàn)。在糖尿病患者合并肝膿腫的致病菌株分析中發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌占所有分離菌株的97%,而大腸桿菌與其他的腸內(nèi)菌分別只占2%與1%。各種動(dòng)物均可感染肺炎克雷伯菌，動(dòng)物體內(nèi)排出的肺炎克雷伯氏菌，可通過(guò)食物食物鏈傳染給人，動(dòng)物墊料中肺炎克雷伯氏菌對(duì)動(dòng)物的危害極大，是影響動(dòng)物健康和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的國(guó)際公認(rèn)的重要環(huán)境因素之一，因此動(dòng)物墊料中肺炎克雷伯氏菌的檢測(cè)十分重要。 建立動(dòng)物墊料肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，保障動(dòng)物健康急不可待。動(dòng)物墊料與動(dòng)物糞便直接接觸，容易滋生細(xì)菌，尤其是腸道致病微生物，致使墊料被肺炎克雷伯氏菌污染，從而威脅動(dòng)物的健康與福利，并且對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展與國(guó)際間動(dòng)物及產(chǎn)品貿(mào)易帶來(lái)巨大的影響，甚至威脅到人類(lèi)社會(huì)的生產(chǎn)與生活。但是對(duì)于動(dòng)物墊料肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)幾乎空白，還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方法，所以建立動(dòng)物墊料肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)已刻不容緩。 本實(shí)驗(yàn)室具有多年微生物檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn)，本方法的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，在檢測(cè)技術(shù)方面填補(bǔ)我區(qū)的空白、彌補(bǔ)了自治區(qū)沒(méi)有現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的不足，能夠使動(dòng)物墊料中肺炎克雷伯氏菌的檢測(cè)更加高效、準(zhǔn)確、安全。本方法的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用將會(huì)使我區(qū)在動(dòng)物墊料中肺炎克雷伯氏菌的檢測(cè)先進(jìn)性方面達(dá)到國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平，為我區(qū)動(dòng)物墊料質(zhì)量安全管理部門(mén)更快更好的管控提供可靠保障。因此，加強(qiáng)動(dòng)物墊料中肺炎克雷伯氏菌的檢測(cè)對(duì)確保全區(qū)農(nóng)業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 三、主要起草過(guò)程 2019.05-2019.07 地標(biāo)前期基礎(chǔ)工作：收集動(dòng)物墊料樣本，查閱肺炎克雷伯氏菌資料，檢索肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)。 2019.08-2019.11 前期實(shí)驗(yàn)條件的摸索：包括前處理方法的優(yōu)化、對(duì)照，不同墊料中肺炎克雷伯氏菌的檢出率，最終確定實(shí)驗(yàn)方案，編寫(xiě)編制說(shuō)明。 2019.12-2020.02 編寫(xiě)地標(biāo)并定初稿并征求意見(jiàn)，驗(yàn)證單位進(jìn)行驗(yàn)證。 2020.03 意見(jiàn)匯總并完善標(biāo)準(zhǔn)，完成標(biāo)準(zhǔn)送審稿送審。 四、現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系 本標(biāo)準(zhǔn)遵循GB/T 1.1-2009 《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)》和GB/T 20001.4-2015 《標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則 第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)則編寫(xiě)。還參照相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)指南的要求。 在編制本標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)程中參考了以下標(biāo)準(zhǔn)：GB 14925-2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》、GB/T 14926.13-2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦炎克雷伯桿菌檢測(cè)方法》、SN/T 1962-2007《食品中克雷伯氏菌檢測(cè)方法》、SN/T 25529-2010《乳及乳制品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)方法 第9部分：克雷伯氏菌檢驗(yàn)》、SN/T 27548-2011《出口食品中數(shù)病菌環(huán)介導(dǎo)檢溫?cái)U(kuò)增（LAMP)檢測(cè)方法》、SN/T 2206.3-2009《化妝品微生物檢驗(yàn)方法 第3部分：肺炎克雷伯氏菌》；綜合參考了現(xiàn)行與肺炎克雷伯桿菌檢測(cè)相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，力求該標(biāo)準(zhǔn)能夠高效準(zhǔn)確的檢測(cè)墊料中腦炎克雷伯桿菌，同時(shí)兼顧標(biāo)準(zhǔn)的廣泛應(yīng)用。 本標(biāo)準(zhǔn)完全符合現(xiàn)行法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，不存在任何與現(xiàn)行法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)相違背之處。相關(guān)強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)2項(xiàng)：GB 14925-2010 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施》，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)備和環(huán)境的技術(shù)要求及檢測(cè)方法，同時(shí)規(guī)定了墊料、飲水和籠具的原則要求。但針對(duì)墊料該標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了“墊料的材質(zhì)應(yīng)符合動(dòng)物的健康和福利要求，應(yīng)滿(mǎn)足吸濕性好、塵埃少、無(wú)異味、無(wú)毒性、無(wú)油脂、耐高溫、耐高壓等條件；墊料必須經(jīng)滅菌處理后方可使用” 。本地標(biāo)適用于墊料中肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)，明確規(guī)定了不同類(lèi)別墊料取樣方法，標(biāo)準(zhǔn)中肺炎克雷伯氏菌鑒定過(guò)程增加了新的鑒定手段，確保檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。 5、 主要內(nèi)容及檢測(cè)方法的確定 5.1 取樣方法的確定及優(yōu)化 根據(jù)動(dòng)物墊料的物理性狀將其分為顆粒狀/粉末狀墊料和平面狀墊料，針對(duì)不同性狀的墊料采取不同的取樣方法。 5.1.1 顆粒狀或粉末墊料樣品取樣方法 國(guó)內(nèi)外食品和飼料中肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)法中常用的取樣方法為稱(chēng)取法，本標(biāo)準(zhǔn)中針對(duì)顆粒狀或粉末墊料樣品（木屑、玉米芯、秸稈、紙屑等）參考通用做法采用稱(chēng)取25 g的方法進(jìn)行取樣。 5.1.2 平面墊料樣品取樣方法 針對(duì)平面墊料（膠墊、托盤(pán)等）采用表面涂抹取樣法，無(wú)菌操作將涂抹25 cm2～100 cm2平面樣品的棉拭子置入裝有 25 mL～100 mL 無(wú)菌0.85 %生理鹽水中，混勻作為原液。 5.2 培養(yǎng)基的選擇 5.2.1 選擇性增菌培養(yǎng)基 國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)和資料中用到的選擇性增菌培養(yǎng)基主要有：SCDLP液體培養(yǎng)基和腸桿菌增菌肉湯（EE肉湯）。SCDLP液體培養(yǎng)基是肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)法中常用的培養(yǎng)基，且是一步增菌法；腸桿菌增菌肉湯（EE肉湯）主要用于食品樣品克雷伯氏菌屬細(xì)菌的檢驗(yàn)，是在預(yù)增菌之后使用，目的是使食品加工生產(chǎn)過(guò)程中亞致死損傷的細(xì)菌得到修復(fù)；而墊料中的細(xì)菌損傷程度沒(méi)有食品加工生產(chǎn)中細(xì)菌的損傷程度大，無(wú)需預(yù)增菌修復(fù)，因此為操作簡(jiǎn)單方便，本標(biāo)準(zhǔn)采用選用SCDLP液體培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性增菌。 5.2.2 分離培養(yǎng)基 本標(biāo)準(zhǔn)選用的肺炎克雷伯氏菌分離培養(yǎng)基為目前現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)通用的膽硫乳瓊脂（DHL)，保證檢測(cè)結(jié)果的同時(shí)，兼顧所用培養(yǎng)基的一致性，節(jié)約實(shí)驗(yàn)室成本。 5.3 典型或可疑菌落的鑒定 本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)典型或可疑菌落的鑒定過(guò)程，參考了現(xiàn)行肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)等成熟做法，綜合了生化反應(yīng)等必要鑒定過(guò)程，并囊括了全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)快速方法，增加了飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)方法，做到了與國(guó)際接軌，縮短檢測(cè)時(shí)間，增加檢測(cè)通量，減少檢測(cè)人員工作量。 5.4 培養(yǎng)時(shí)間和溫度 本標(biāo)準(zhǔn)將繼續(xù)采用我國(guó)常用的36 ℃1 ℃對(duì)肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行檢測(cè)培養(yǎng)。培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)間也與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)相統(tǒng)一。 5.5 其他 本標(biāo)準(zhǔn)增加了肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)常用培養(yǎng)基保存期限與保存方式，對(duì)檢測(cè)人員具有實(shí)際指導(dǎo)意義，確保檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量。 六、方法驗(yàn)證 為驗(yàn)證本方法的有效性和適用性，選擇5家不同行業(yè)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)本方法進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證內(nèi)容為方法的適用性、準(zhǔn)確度、檢出率及相關(guān)樣品的檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法穩(wěn)定可靠，符合相關(guān)要求。 七、結(jié)論 綜上所述，本標(biāo)準(zhǔn)在制定過(guò)程中所涉及到的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均經(jīng)過(guò)方法學(xué)的驗(yàn)證，并切實(shí)可行，完全達(dá)到了編制標(biāo)準(zhǔn)的要求。 八、重大意見(jiàn)分歧的處理依據(jù)和結(jié)果 未發(fā)生。 九、國(guó)內(nèi)外情況簡(jiǎn)要說(shuō)明 國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。檢索國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1項(xiàng)和地方標(biāo)準(zhǔn)2項(xiàng)：GB 14925-2010 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施》、江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T 2129-2012 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 墊料》、北京市地方標(biāo)準(zhǔn)DB11/T 1126-2014《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 墊料》。 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古自治區(qū)內(nèi)有相關(guān)單位從事這項(xiàng)研究。 10、 標(biāo)準(zhǔn)草稿征求意見(jiàn)情況匯總表 序號(hào) 意見(jiàn) 提出單位/專(zhuān)家 采納 不采納（說(shuō)明原因） 1 建議在標(biāo)準(zhǔn)適當(dāng)位置增加檢測(cè)流程圖 包頭海關(guān)技術(shù)中心（原包頭出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心）/張鵬翔 采納 2 建議將附錄A培養(yǎng)基和試劑配制中每種成分的數(shù)量單位靠后對(duì)齊。 赤峰海關(guān)技術(shù)中心（原赤峰出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心）/曹旭 采納 3 建議文中數(shù)量和單位之間空一格 蘭州海關(guān)技術(shù)中心（原甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心）/張宇霞 采納 4 建議按照《標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則》的要求修改標(biāo)準(zhǔn)格式。 二連浩特海關(guān)技術(shù)中心（原二連浩特出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心）/楊帆 采納 5 無(wú)修改建議。 滿(mǎn)洲里海關(guān)技術(shù)中心（原滿(mǎn)洲里出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心）/楊東來(lái) 參考文獻(xiàn)： [1] GB/T 1.1-2009, 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則[S]. 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