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1、 重組重組DNADNA技術技術 RECOMBINANT DNA TECHNOLOGYRECOMBINANT DNA TECHNOLOGY第第 二二 十十 四四 章章n基因重組基因重組 是指是指DNADNA片段在細胞內、細胞間，甚至片段在細胞內、細胞間，甚至在不同物種之間進行交換，交換后的片段仍然在不同物種之間進行交換，交換后的片段仍然具有復制和表達的功能。具有復制和表達的功能。n分為三個水平：分為三個水平：整體水平（如整體水平（如 生物有性雜交）生物有性雜交）細胞水平（如細胞水平（如 單克隆抗體技術）單克隆抗體技術）分子水平（如分子水平（如 構建重組體）構建重組體）克隆克隆(clone)(cl
2、one)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為獲取同一拷貝的過程稱為克隆化克隆化(cloning)(cloning)，即即無性繁殖無性繁殖。（一）（一）DNADNA克隆克隆技術水平：技術水平：分子克隆分子克隆(即即DNA DNA 克隆克隆 )細胞克隆細胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮﹤€體克?。▌游锘蛑参铮妹笇W的方法，在體外將各種來源的遺傳應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNADNA）與載體）與載體DNADNA接合成一具有自我復接合
3、成一具有自我復制能力的制能力的DNADNA分子分子復制子復制子(replicon)(replicon)，繼而，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一D N AD N A 分 子，也 稱分 子，也 稱 基 因 克 隆 或 重 組基 因 克 隆 或 重 組 D N A D N A(recombinant DNA)(recombinant DNA)。定義定義DNADNA克隆克隆乳腺生物反應器：乳腺生物反應器：n將外源基因導入載體，將外源基因導入載體，位于位于乳球蛋白基因乳
4、球蛋白基因啟動子下游，使得該目啟動子下游，使得該目的基因只能在哺乳動物的基因只能在哺乳動物組織中表達組織中表達第第 一一 節(jié)節(jié) 常用工具酶常用工具酶Enzymes as tools inDNA Recombination Technique n 限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶n DNADNA連接酶連接酶n DNADNA聚合酶聚合酶n 堿性磷酸酶堿性磷酸酶n 反轉錄酶反轉錄酶n 末端轉移酶末端轉移酶n TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶重組重組DNA技術中常用的工具酶技術中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADN
5、A連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使使DNA切口封合或使兩個切口封合或使兩個DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補填補3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，第二鏈合成，雙鏈雙鏈DNA 3
6、 末端標記等末端標記等反轉錄酶反轉錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進行填補，標記或進行填補，標記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標記探針羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶末端轉移酶在在3 羥基末端進行同質多聚物加尾羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶(restriction endonuclease,RE)(restriction endonuclease,RE)限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶:是識別是識別DNADNA的特異序列的特異序
7、列,并并在識別位點或其周圍切割雙鏈在識別位點或其周圍切割雙鏈DNADNA的一類內切酶。的一類內切酶。GGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGG GCCTAGCCTAGGATCCGATCC G GBam Bam HH定義定義、基因工程技術中常用基因工程技術中常用型，型，特點是特點是識別位點與切割位點一致識別位點與切割位點一致分類分類與甲基化酶共同構成細菌的限制修與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源飾系統(tǒng)，限制外源DNADNA，保護自身保護自身DNADNA。作用作用第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，
8、用小寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名命名Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回文結構回文結構(palindrome)(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口鈍性末端鈍性末端粘性
9、末端粘性末端來源不同的限制酶，但能識別和切割來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同一位點，這些酶稱同功異源酶同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同功異源酶同功異源酶有些限制性內切酶雖然識別序列不完全有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割相同，但切割DNADNA后，產生相同的粘性末端，后，產生相同的粘性末端，稱為稱為同尾酶同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為。這兩個相同的粘性末端稱為配配伍末端伍末端(compatible end)(compatible end)。GGATCC CCTAG
10、G AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A同尾酶同尾酶切割會受其他因素的影響切割會受其他因素的影響 限制性內切酶通常不能切割在識別位點內有特限制性內切酶通常不能切割在識別位點內有特異堿基甲基化的序列。異堿基甲基化的序列。緩沖液或環(huán)境溫度也會影響一些酶的特異性。緩沖液或環(huán)境溫度也會影響一些酶的特異性。例如，例如，EcoR I在正常情況下識別在正常情況下識別“-GAATTC-”序列，但在序列，但在甘油濃度大于甘油濃度大于5%（v/v）或反應溫度較低時識別序列可變）或反應溫度較低時識別序列可變?yōu)闉椤?AATT-”或或“-嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶
11、-”，這種現(xiàn)象稱為，這種現(xiàn)象稱為星號活性（星號活性（star activity），以），以EcoR I*表示。表示。名稱名稱 識別序列及切割位點識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點名稱識別序列及切割點切割后產生切割后產生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后產生切割后產生3突出末端突出末端:
12、Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后產生平末端切割后產生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性內切核酸酶限制性內切核酸酶催化兩個相鄰的催化兩個相鄰的3-OH和和5-磷酸基團形成磷酸基團形成3，5-磷酸二酯鍵，磷酸二酯鍵，從而使從而使DNA片段或單鏈斷裂形成的缺口連接起來。片段或單鏈斷裂形成的
13、缺口連接起來。DNA DNA連接酶（連接酶（DNA ligaseDNA ligase）在在末端轉移酶末端轉移酶(terminal transferase)(terminal transferase)的作的作用下，在用下，在DNADNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。造出粘性末端，再進行粘端連接。末端轉移酶末端轉移酶5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機械剪切限制酶或機械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA3 5-核酸外切
14、酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉移酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體同聚物加尾連接同聚物加尾連接可用32P標記的ATP特異地標記多核苷酸的5末端。多核苷酸激酶多核苷酸激酶堿性磷酸酶堿性磷酸酶n分子生物學中主要用作核酸的去磷酸化。因為分子生物學中主要用作核酸的去磷酸化。因為DNADNA通常會在通常會在55端結合磷酸基團，用端結合磷酸基團，用ALPALP去磷去磷酸化能防止酸化能防止DNADNA分子分子55端與端與33端連接。端連接。第二節(jié)第二節(jié) 目的目的DNADNA的獲取的獲取目的
15、基因目的基因n cDNA(complementary DNA)cDNA(complementary DNA)n基因組基因組DNA(genomic DNA)DNA(genomic DNA)目的基因的獲取目的基因的獲取1.1.化學合成法化學合成法2.2.基因組基因組DNADNA文庫文庫 (genomic DNA library)(genomic DNA library)3.cDNA3.cDNA文庫文庫 (cDNA library)(cDNA library)4.4.聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(PCR)(PCR)*化學合成法獲取目的基因化學合成法獲取目的基因要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的要求
16、：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列氨基酸序列 。一般用于小分子基因的合成一般用于小分子基因的合成組織或細胞染色體組織或細胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉化菌含重組分子的轉化菌限制性內切酶限制性內切酶受體菌受體菌*從基因組從基因組DNADNA文庫文庫獲取目的基因獲取目的基因限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應連接反應 體外包裝體外包裝
17、 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫基因文庫基因組基因組DNADNA文庫（文庫（genomic DNA librarygenomic DNA library）將某一基因組將某一基因組DNADNA用適當的限制酶切斷用適當的限制酶切斷后，與載體后，與載體DNADNA重組，再全部轉化宿主細胞，重組，再全部轉化宿主細胞，存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組基因組DNADNA的集合的集合稱為稱為G G文庫文庫cDNAcDNA文庫文庫(cDNA l
18、ibrary)(cDNA library)：以某種細胞的全部以某種細胞的全部mRNAmRNA為模板，利用為模板，利用逆轉逆轉錄酶合成與錄酶合成與mRNAmRNA互補的互補的DNADNA（cDNAcDNA）再復制成再復制成雙鏈雙鏈cDNA,cDNA,與適當的載體連接后與適當的載體連接后轉化入受體菌，轉化入受體菌，得到含得到含全部表達基因全部表達基因的種群，稱為的種群，稱為C-C-文庫文庫(cDNA library)(cDNA library)。C-C-文庫具有文庫具有組織細胞特異性組織細胞特異性。如已知目的基因兩如已知目的基因兩端的序列，則可采端的序列，則可采用 聚 合 酶 鏈 反 應用 聚 合
19、 酶 鏈 反 應（PCRPCR）技術，在）技術，在體外合成目的基因。體外合成目的基因。但此法可能會造成但此法可能會造成克隆的目的基因堿克隆的目的基因堿基序列的改變?；蛄械母淖?。利用利用PCR合成合成：第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNA技術中的技術中的DNA載體載體DNA Vectors in Recombinant DNA Technology 載體（載體（vectorvector）是為攜帶感興趣的外源是為攜帶感興趣的外源DNADNA，實現(xiàn)，實現(xiàn)外源外源DNADNA在受體細胞中的無性繁殖或表達有意義的在受體細胞中的無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些蛋白質所采用的一些DNADNA分子分子 按功
20、能分按功能分克隆載體（克隆載體（cloning vector）表達載體（表達載體（expression vector）按基本元件按基本元件的來源不同的來源不同質粒載體質粒載體噬菌體載體噬菌體載體黏粒載體黏粒載體病毒載體病毒載體人工染色體載體等人工染色體載體等載體概述載體概述克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴增而特意序列被擴增而特意設計的載體稱為設計的載體稱為克隆載體?？寺≥d體。表達載體表達載體(expression vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉錄和翻譯序列可轉錄和翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為成多肽鏈而特意設
21、計的載體稱為表達載體。表達載體。一、克隆載體用于外源一、克隆載體用于外源DNADNA的克隆和無性繁殖的克隆和無性繁殖（一）克隆載體應具備的主要特點（一）克隆載體應具備的主要特點n至少有一個至少有一個復制起點復制起點（origin of replication,ori）n至少有一個至少有一個選擇性標志選擇性標志（selection marker）n有適宜的限制性內切酶的有適宜的限制性內切酶的單一單一切點：稱為切點：稱為多克隆多克隆位點位點（multiple cloning sites，MCS）n應有較高的拷貝數。應有較高的拷貝數。pBR322質粒圖譜質粒圖譜 1.1.質粒質粒(plasmid)特
22、點：能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些特點：能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。（二）（二）常用克隆載體有多種常用克隆載體有多種質粒的特性質粒的特性分子較小分子較小自主復制自主復制可轉移性可轉移性不相容性不相容性選擇性標記選擇性標記多克隆位點多克隆位點pUC系列質粒圖譜系列質粒圖譜噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用于系列（插入型，適用于cDNA克?。┛寺。〦MBL系列（置換型，適用于基因組系列（置換型，適用于基因組DNA克?。┛寺。ヽos位點位點:噬菌體噬菌體DNA為線性雙鏈分子，兩端各有一條為
23、線性雙鏈分子，兩端各有一條由由12個堿基組成、彼此完全互補且個堿基組成、彼此完全互補且5單鏈突出的序列單鏈突出的序列（即粘性末端），稱（即粘性末端），稱cos位點位點 2.噬菌體噬菌體(phage)M13噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列3.穿梭載體（穿梭載體（shuttle vector）人工構建，含有不止一個復制起點，能攜帶外人工構建，含有不止一個復制起點，能攜帶外源源DNA序列在不同種類宿主細胞中復制、擴增。序列在不同種類宿主細胞中復制、擴增。u 表達載體是指用來在宿主細胞中表達外源基因表達載體是指用來在宿主細胞中表達外源基因的載體的載體u
24、依據其宿主細胞的不同可分為依據其宿主細胞的不同可分為:原核表達載體（原核表達載體（prokaryotic expression vectorprokaryotic expression vector）真核表達載體（真核表達載體（eukaryotic expression vectoreukaryotic expression vector）二、表達載體用于外源二、表達載體用于外源DNA的表達的表達（一）（一）原核表達載體用于在原核細胞中表達外原核表達載體用于在原核細胞中表達外源基因源基因 從克隆載體發(fā)展而來，其除了具備克隆載體的一般特點外，從克隆載體發(fā)展而來，其除了具備克隆載體的一般特點外，還
25、需有還需有調控外源基因有效轉錄和翻譯的序列調控外源基因有效轉錄和翻譯的序列，如啟動子、核糖，如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止序列等。目前應用最廣泛的原核表達載體結合位點、轉錄終止序列等。目前應用最廣泛的原核表達載體是大腸桿菌表達載體。原核表達載體的基本組成如下：體是大腸桿菌表達載體。原核表達載體的基本組成如下：R：調節(jié)序列；：調節(jié)序列；P：啟動子；：啟動子；SD：SD序列；序列；TT：轉錄終止序列：轉錄終止序列大腸桿菌表達載體大腸桿菌表達載體（二）真核表達載體用于在真核細胞中表（二）真核表達載體用于在真核細胞中表達外源基因達外源基因 真核表達載體包括在大腸桿菌中起作用的復制起始位真核表達載體
26、包括在大腸桿菌中起作用的復制起始位點、抗生素抗性基因、多克隆位點等。點、抗生素抗性基因、多克隆位點等。真核表達載體中還具有：真核表達載體中還具有：真核表達調控元件：包括啟動子、增強子、轉錄終真核表達調控元件：包括啟動子、增強子、轉錄終止序列、止序列、poly A 加尾信號等加尾信號等 真核細胞復制起始序列真核細胞復制起始序列 真核細胞藥物抗性基因真核細胞藥物抗性基因 真核表達載體的基本組成真核表達載體的基本組成 OriPro：原核復制起始序列；P：啟動子；MCS：多克隆位點；TT：轉錄終止序列；orieuk：真核復制起始序列。酵母表達載體酵母表達載體昆蟲表達載體昆蟲表達載體哺乳類細胞表達載體哺
27、乳類細胞表達載體根據真核宿主細胞的不同，真核表達載體可主要根據真核宿主細胞的不同，真核表達載體可主要分為分為 ：載體上的常用標志或標簽n載體上的標志（載體上的標志（marker）：通常用于重組子或陽性克隆的）：通常用于重組子或陽性克隆的篩選、鑒定篩選、鑒定n常見的標志有：常見的標志有：抗生素抗性基因抗生素抗性基因 a.用于細菌重組子篩選的抗生素抗性基因用于細菌重組子篩選的抗生素抗性基因 b.用于哺乳類細胞陽性克隆篩選的抗生素抗性基因用于哺乳類細胞陽性克隆篩選的抗生素抗性基因 酶的編碼基因酶的編碼基因 營養(yǎng)缺陷選擇標志營養(yǎng)缺陷選擇標志第四節(jié)第四節(jié) DNADNA克隆的基本過程克隆的基本過程Proc
28、edure of DNA CloningProcedure of DNA Cloning 目的目的DNA的分離獲?。ǚ郑┑姆蛛x獲取（分）載體的選擇與準備（擇）載體的選擇與準備（擇）（目的（目的DNA和載體的酶切（切）和載體的酶切（切）目的目的DNA與載體連接（接）與載體連接（接）重組重組DNA轉入受體細胞（轉）轉入受體細胞（轉）重組體的篩選與鑒定（篩）重組體的篩選與鑒定（篩）DNA克隆的基本過程克隆的基本過程三、外源基因與載體的連接（接）三、外源基因與載體的連接（接）1.1.粘性末端連接粘性末端連接方式：方式：(1)(1)同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接(2)(2)不同限制酶切位點連接
29、不同限制酶切位點連接配伍末端連接配伍末端連接非配伍末端連接非配伍末端連接二、克隆載體的選擇和構建（擇）二、克隆載體的選擇和構建（擇）或或者切者切一、分離獲取目的一、分離獲取目的DNADNA有多種方法（分）有多種方法（分）載體載體插入插入DNA片段片段宿主細胞宿主細胞質粒質粒510kb細菌，酵母細菌，酵母噬菌體載體噬菌體載體20kb細菌細菌黏粒黏粒50 kb細菌細菌BAC400kb細菌細菌YAC3 Mb酵母酵母不同載體的克隆容量及適宜宿主細胞不同載體的克隆容量及適宜宿主細胞 三、外源基因與載體的連接（接）三、外源基因與載體的連接（接）1.1.粘性末端連接粘性末端連接方式：方式：(1)(1)同一限
30、制酶切位點連接同一限制酶切位點連接(2)(2)不同限制酶切位點連接不同限制酶切位點連接配伍末端連接配伍末端連接非配伍末端連接非配伍末端連接Bam H切割反應切割反應 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAG
31、GATCCGGATCCG載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點切割位點GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位點切割位點AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+Bg l雙酶切雙酶切Eco R+Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情況和同一限制酶
32、切位點連限制酶切位點連接相似。接相似。2.2.平端連接平端連接適用于：適用于：限制性內切酶切割產生的平端限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因目的基因載體載體限制性內切酶限制性內切酶限制性內切酶限制性內切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連3.3.同聚物加尾連接同聚物加尾連接在在末端轉移酶末端轉移酶(terminal transferase)(terminal transferase)的作用下，在的作用下，在DNADNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。制
33、造出粘性末端，再進行粘端連接。5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機械剪切限制酶或機械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA3 5-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉移酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體4.4.人工接頭人工接頭(linker)(linker)連接連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端
34、，而進行粘端連接。除產生粘性末端，而進行粘端連接。人工接頭及其應用人工接頭及其應用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受體菌條件受體菌條件安全安全宿主菌宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于處于感受態(tài)感受態(tài)(competent)(competent)感受態(tài)細胞：受體細胞經處理后處于最適攝取和容忍感受態(tài)細胞：受體細胞經處理后處于最適攝取和容忍重組體的狀態(tài)。重組體的狀態(tài)。四、重組四、重組DNADNA轉入受體細胞（轉）轉入受體細胞（轉）轉化（轉化（transformation）質粒質粒酵母菌（真核細胞）酵母菌（真核細胞）轉染（轉染（tran
35、sfection）外源外源DNA真核細胞（酵母除外）真核細胞（酵母除外）噬菌體噬菌體DNA感受態(tài)細菌感受態(tài)細菌 感染（感染（infection）噬菌體顆粒噬菌體顆粒細菌細菌 病毒顆粒病毒顆粒哺乳細胞哺乳細胞導入方式導入方式將重組將重組DNA轉入受體細胞的常用方法轉入受體細胞的常用方法n化學法：化學法：氯化鈣化學轉化氯化鈣化學轉化 脂質體轉染脂質體轉染n物理法：物理法：電擊法電擊法 顯微注射法顯微注射法 等等n生物法：生物法：病毒介導的感染病毒介導的感染 電擊法（電穿孔法）顯微注射法（五）重組體的篩選（五）重組體的篩選 1.1.直接選擇法直接選擇法針對基因設計的篩選方法針對基因設計的篩選方法(1
36、)(1)抗藥性標記選擇抗藥性標記選擇(2)(2)標志補救標志補救(marker rescue)(marker rescue)(3)(3)分子雜交法分子雜交法 原位雜交原位雜交 SouthernSouthern印跡印跡2.2.免疫學方法免疫學方法針對表達的產物設計的方法針對表達的產物設計的方法如：免疫化學方法及酶免檢測分析等如：免疫化學方法及酶免檢測分析等(插入失活法插入失活法)抗藥性標記選擇抗藥性標記選擇組氨酸缺陷組氨酸缺陷型大腸桿菌型大腸桿菌無組氨酸無組氨酸的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因酸脫水酶基因促進組氨酸合成促進組氨酸合成 DNADNA重組體重組體標志補救標志補
37、救藍白選擇藍白選擇 互補的檢測互補的檢測標志補救標志補救MCS有插入片段MCS無插入片段-半乳糖苷酶X-Gal 藍色Lac Z基因MCS載體上有載體上有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端編碼序列端編碼序列，細菌染色體細菌染色體DNA有有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端編碼序列端編碼序列-互補（藍互補（藍-白篩選）白篩選）原原位位雜雜交交Southern印跡印跡雞的雞的肌球蛋白的克隆和檢出肌球蛋白的克隆和檢出序列特異性篩選序列特異性篩選(1)RERE酶切法酶切法(2)PCR法法(3)核酸雜交法核酸雜交法(4)DNA測序法測序法 重組重組DNA技術操作的主要步驟技術操作的主要步驟載體載體質粒質粒噬菌體噬菌體病毒
38、病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產物產物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉化轉化體外包裝，轉染體外包裝，轉染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交表達體系的建立表達體系的建立表達載體的構建表達載體的構建受體細胞的建立受體細胞的建立表達產物的分離純化表達產物的分離純化（六）克隆基因的表達（六）克隆基因的表達優(yōu)點：優(yōu)點：選擇標志選擇標志強啟動子強啟動子 翻譯調控序列翻譯調控序列多接頭克隆位點多接頭克隆位點缺點：缺點：不宜表達
39、真核基因組不宜表達真核基因組DNADNA不能加工表達的真核蛋白質不能加工表達的真核蛋白質表達的蛋白質常形成不溶性包涵體表達的蛋白質常形成不溶性包涵體 (inclusion body)(inclusion body)很難表達大量可溶性蛋白很難表達大量可溶性蛋白1.1.原核表達體系原核表達體系 （E.coliE.coli表達體系最為常用）表達體系最為常用）mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白無誘導物（無誘導物（IPTG）時）時在天然狀態(tài)下，呈低限轉錄水平在天然狀態(tài)下，呈低限轉錄水平（以乳糖操縱子的啟動子（以乳糖操縱子的啟動子Plac為例）為例）IDNAOPpol阻遏基因阻遏基因外源基因外源基因mRNA阻遏蛋白
40、阻遏蛋白有誘導物（有誘導物（IPTG）時）時IDNAOPpol啟動轉錄啟動轉錄mRNAIPTG外源基因外源基因可通過可通過IPTG誘導增強其轉錄水平誘導增強其轉錄水平IPTG誘導目標蛋白的表達優(yōu)點：優(yōu)點：可表達克隆的可表達克隆的cDNAcDNA及真核基因組及真核基因組DNADNA可適當修飾表達的蛋白質可適當修飾表達的蛋白質表達產物分區(qū)域積累表達產物分區(qū)域積累缺點：缺點：操作技術難、費時、經濟操作技術難、費時、經濟轉染轉染 將表達載體導入真核細胞的過程將表達載體導入真核細胞的過程 磷酸鈣轉染磷酸鈣轉染DEAEDEAE葡聚糖介導轉染葡聚糖介導轉染電穿孔電穿孔 脂質體轉染脂質體轉染 顯微注射顯微注射
41、 2.2.真核表達體系真核表達體系 酵母、昆蟲、乳類動物細胞酵母、昆蟲、乳類動物細胞 方法的選擇決定方法的選擇決定于細胞的種類、特性于細胞的種類、特性及表達載體的性質及表達載體的性質表達載體表達載體pFASTBACI 的物理圖譜的物理圖譜（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克?。ㄒ唬┘膊』虻陌l(fā)現(xiàn)與克隆根據基因定位克隆之并研究其性質，而認根據基因定位克隆之并研究其性質，而認識疾病的分子機制。識疾病的分子機制。三、重組技術與醫(yī)學的關系三、重組技術與醫(yī)學的關系（二）生物制藥（二）生物制藥 美國美國Eli Lilly公司于公司于1982年首先利用重組年首先利用重組DNA技術合技術合成人胰島素并投放市場，標志著生物
42、工程藥物時代的成人胰島素并投放市場，標志著生物工程藥物時代的開始。迄今為止，已有開始。迄今為止，已有50多種基因工程藥物上市，近多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個巨大的高新技術產業(yè)，千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個巨大的高新技術產業(yè)，產生了不可估量的社會效益和經濟效益。產生了不可估量的社會效益和經濟效益。重組重組DNA醫(yī)藥產品醫(yī)藥產品產 品功 能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂
生物化學與分子生物學：18 重組DNA技術
