飼草中主要農(nóng)藥殘留及真菌毒素的測(cè)定　第2部分：飼草中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的測(cè)定　液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

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ICS65.120 B 25 DB37 山東省地方標(biāo)準(zhǔn) DB37/T XXXXX—XXXX 飼草中主要農(nóng)藥殘留及真菌毒素的測(cè)定　第2部分：飼草中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的測(cè)定　液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 Determination of main pesticide residues and mycotoxin in fodder grass—Part2：Determination of deoxynivalenol and zearalenone in fodder grassby high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry XXXX - XX - XX發(fā)布 XXXX - XX - XX實(shí)施 山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布 DB37/T XXXXX—XXXX 前言 DB37/T 《飼草中主要農(nóng)藥殘留及真菌毒素的測(cè)定》分為三個(gè)部分： ——第1部分：飼草中10種殺蟲(chóng)劑農(nóng)藥殘留量的測(cè)定　氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法； ——第2部分：飼草中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的測(cè)定　液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法； ——第3部分：飼草中伏馬毒素的測(cè)定方法　液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。 本部分為DB37/T 的第2部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009給出的規(guī)則起草。 本部分由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實(shí)施。 本部分由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。 本部分起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所。 本部分主要起草人：鄧立剛、李霞、李增梅、王峰恩、官帥、陳璐、楊琳琳、李香。 5 飼草中主要農(nóng)藥殘留及真菌毒素的測(cè)定　第2部分：飼草中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的測(cè)定　液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 警示：整個(gè)分析操作過(guò)程應(yīng)在指定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。該區(qū)域應(yīng)避光(陽(yáng)光)，具備相對(duì)獨(dú)立的操作臺(tái)和廢棄物存放裝置。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，操作者應(yīng)按照接觸劇毒物的要求采取相應(yīng)的保護(hù)措施。 1　 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼草中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于飼草中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的測(cè)定。 本方法檢出限：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為10 μg/kg和玉米赤霉烯酮為5 μg/kg；定量限：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為25 μg/kg和玉米赤霉烯酮為10 μg/kg。 2　 規(guī)范性引用文件 下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 6682　分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法 3　 原理 試樣經(jīng)乙腈-甲酸水溶液提取，經(jīng)QuEChERS萃取包凈化后，氮?dú)獯蹈?，甲?水溶液復(fù)溶，液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。 4　 試劑或材料 除非另有說(shuō)明，僅使用分析純?cè)噭?，水符合GB/T 6682一級(jí)水的規(guī)定。 4.1　 甲醇：色譜純。 4.2　 甲酸：色譜純。 4.3　 乙腈：色譜純。 4.4　 提取液：準(zhǔn)確量取乙腈（4.3）800 mL，加入甲酸（4.2）10 mL，用水定容至1 000 mL。 4.5　 甲醇溶液：量取甲醇（4.1）100 mL，加入水100 mL，混勻，備用。 4.6　 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON，C15H20O6，CAS：51481 - 10 - 8）標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL。 4.7　 玉米赤霉烯酮（ZEN，C18H22O5，CAS：17924 - 92 - 408）標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL。 4.8　 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇同位素內(nèi)標(biāo)（13C15-DON，13C15H20O6）溶液：25 μg/mL。 4.9　 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液溶液：準(zhǔn)確吸取1.0 mL脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.6）和0.1 mL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.7）于10 mL容量瓶中，用水定容，此時(shí)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇濃度為10 μg/mL，玉米赤霉烯酮濃度為1 μg/mL，于-20 ℃冰箱保存。 4.10　 同位素內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確吸取1.0 mL脫氧雪腐鐮刀菌烯醇同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.8）于10 mL容量瓶中，用水定容，此時(shí)濃度為2.5 μg/mL，于-20 ℃冰箱保存。 4.11　 QuEChERS鹽包：4.0 g硫酸鎂，1.0 g氯化鈉，1.0 g檸檬酸鈉，0.5 g檸檬酸二鈉鹽倍半水合物。 4.12　 微孔濾膜：有機(jī)相，0.22 μm。 5　 儀器設(shè)備 5.1　 液相色譜—三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：配電噴霧離子源（ESI源）。 5.2　 分析天平：感量0.01 g。 5.3　 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于8 000 r/min。 5.4　 氮吹儀，可控溫。 5.5　 粉碎機(jī)。 5.6　 渦旋混合器。 5.7　 恒溫振蕩器。 6　 試樣的制備 樣品粉碎后充分混勻，于–18 ℃下保存。 7　 測(cè)定步驟 7.1　 前處理 準(zhǔn)確稱(chēng)取平行試樣，干樣2 g或鮮樣5 g于50 mL離心管中，加入20 mL提取液（4.4），渦旋混勻后于恒溫振蕩器中振蕩30 min；加入QuEChERS鹽包（4.11），渦旋2 min，充分混勻，8 000 r/min離心5 min，取2 mL上清液，加20 μL同位素內(nèi)標(biāo)溶液（4.10），置于40 ℃水浴中氮吹至近干；用甲醇溶液（4.5）復(fù)溶，定容至0.5 mL，旋渦振蕩1 min，過(guò)微孔濾膜（4.12），用于測(cè)定。 7.2　 測(cè)定 7.2.1　 液相色譜參考條件 液相色譜參考條件如下： a) 色譜柱：C18色譜柱，柱長(zhǎng)100 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm，顆粒內(nèi)徑1.7?μm，或性能相當(dāng)者； b) 流動(dòng)相：0.1 %甲酸溶液（流動(dòng)相A），乙腈（流動(dòng)相B）； c) 流速：0.3 mL/min； d) 進(jìn)樣量：2.0 μL； e) 柱溫：40 ℃； f) 流動(dòng)相及梯度洗脫條件見(jiàn)表1。 表1　 流動(dòng)相梯度洗脫條件 時(shí)間 min 流動(dòng)相A 流動(dòng)相B 0 90 10 0.2 90 10 2.0 10 90 4.0 10 90 4.5 90 10 7.0 90 10 7.2.2　 質(zhì)譜參考條件 質(zhì)譜參考條件如下： a) 離子源：電噴霧離子源( ESI+）； b) 毛細(xì)管電壓：3.5 KV； c) 離子源溫度：120 ℃； d) 脫溶劑氣溫度：500 ℃； e) 掃描模式：正離子； f) 監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），監(jiān)測(cè)條件見(jiàn)表2。 表2　 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）條件 化合物 名稱(chēng) 母離子 m/z 錐孔電壓 V 定量離子 m/z 碰撞能量 eV 定性離子m/z 碰撞能量 eV DON 297.1 30 249.1 10 203.1 16 ZEN 319.1 20 283.1 19 187.1 11 13C15-DON 312.0 30 263.0 16 — — 7.2.3　 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和同位素內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇水溶液(4.5)配制成10?μg/L、20?μg/L、50?μg/L、100?μg/L、200?μg/L和500?μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，其中同位素內(nèi)標(biāo)溶液濃度為100?μg/L，上機(jī)測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 7.3　 定性及定量 7.3.1　 定性測(cè)定 通過(guò)試樣色譜圖的特征離子與相應(yīng)對(duì)照溶液各色譜峰的特征離子相對(duì)照定性。試樣與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的相對(duì)誤差不大于2.5 %；試樣特征離子的相對(duì)離子豐度與標(biāo)準(zhǔn)品特征離子的相對(duì)離子豐度一致，相對(duì)離子豐度偏差不超過(guò)表3的規(guī)定，則可判斷試樣中含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮。 表3　 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許誤差 相對(duì)離子豐度 ＞50 % ＞20 %～50 %（含） ＞10 %～20 %（含） ≤10 % 允許的相對(duì)偏差 20 25 30 50 7.3.2　 定量 外標(biāo)法定量。 7.4　 試樣溶液的測(cè)定 將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和試樣溶液依次注入液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀中，保留時(shí)間和定性離子定性，測(cè)定定量離子峰面積，待測(cè)樣液中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測(cè)的定量測(cè)定線性范圍之內(nèi)，超過(guò)線性范圍時(shí)應(yīng)根據(jù)測(cè)定濃度進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋后再進(jìn)行分析。 7.5　 空白試驗(yàn) 除不加試料外，按照7.1～7.4規(guī)定進(jìn)行平行操作。 8　 分析結(jié)果的表述 試料中被測(cè)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮?dú)埩袅恳再|(zhì)量分?jǐn)?shù)ω計(jì)，單位以微克每千克（μg/kg）表示，按公式（1）計(jì)算： (1) 式中： ——試料中被測(cè)物殘留量，單位為微克每千克（μg/kg）； ——從基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的樣液中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的質(zhì)量濃度，單 位為微克每升（μg/L）； V1 ——樣品提取液體積，單位為毫升（mL）； V2 ——待濃縮的上清液體積，單位為毫升（mL）； V3 ——試樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）； m ——試料的質(zhì)量，單位為克（g）。 計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 9　 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值的算數(shù)平均值的15 %。 A A 附　錄　A （資料性附錄） 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其同位素內(nèi)標(biāo)和玉米赤霉烯酮特征離子質(zhì)量色譜圖 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖1。 圖A.1　 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖（標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為：20?μg/L） _________________________________