黃牛和水牛源性成分同步檢測方法 實時熒光PCR法 編制說明

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編制說明 項目名稱： 黃牛和水牛源性成分同步檢測方法 實時熒光PCR法 項目編號： 內(nèi)質(zhì)監(jiān)標函〔2018〕307號 編制單位： 錫林郭勒職業(yè)學院 一、工作簡況 本項目來源于2018年第3批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標準制修訂項目（內(nèi)質(zhì)監(jiān)標函〔2018〕307號）。起草單位為錫林郭勒職業(yè)學院，協(xié)作單位為錫林郭勒食品檢驗檢測和風險評估中心。主要起草人：郭梁、李春冬、郭元晟、徐偉良、劉國強、羅建興。 二、制定標準的必要性和意義 水牛乳產(chǎn)量雖然較低，但奶中所含蛋白質(zhì)、脂肪，乳脂、維生素、微量元素等均高于牛奶，含有適宜兒童生長發(fā)育和抗衰老的鋅、鐵、鈣。作為一類高級營養(yǎng)食品，水牛乳制品日漸成人們消費的“新寵”。市場中存在用低價牛奶冒充高價水牛奶的欺詐違法行為。目前，已經(jīng)存在一項水牛源性檢測方法標準：食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第7部分：水牛成分檢測 實時熒PCR法（SN/T 3730.7-2013）。在采用上述檢測標準后發(fā)現(xiàn)：目前缺乏基于同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的黃牛和水牛源性成分同步檢測方法的相關(guān)標準。本標準是基于多重實時熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的黃牛和水牛源性成分同步檢測方法的相關(guān)標準，具有快速、高通量以及去除假陰性等特征。 三、主要起草過程 本標準制定工作從2018年10月開始，組織成立了標準起草團隊。起草團隊首先進行相關(guān)標準、專利以及論文的收集和整理工作，制定了基于多重實時熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的動物源性成分檢測標準體系的研發(fā)目標，計劃形成黃牛（Bos taurus）、水牛（Bubalus bubalis）、馬（Equus caballus）、山羊（Capra hircus）、綿羊（Ovis aries）、牦牛（Bos grunniens）、豬（Sus scrofa）、驢（Equus asinus）、雙峰駝（Camelus bactrianus）、梅花鹿（Cervus nippon）、雞（Gallus gallus）、鴨（Anas platyrhynchos）及鵝（Anser anser）等13個物種、針對肉（鮮肉、肉干及香腸）和乳（鮮乳、發(fā)酵乳、乳酪及乳粉）的常見動物源性成分檢測標準體系。 具體實驗過程如下： （一） 在NCBI中下載不同物種（黃牛、水牛、馬、山羊、綿羊、牦牛、豬、驢、雙峰駝、梅花鹿、雞、鴨及鵝等13個物種）的線粒體序列。為了保證引物和探針的物種適用性，每個物種下載5-20個品種或品系的線粒體序列；利用生物信息學軟件（Clustal X或MAGE 5）對所下載的線粒體序列進行比對。篩選物種間特異品種間保守的序列為目標靶向區(qū)域（5-10個），針對目標靶向區(qū)域設(shè)計5組引物和探針組合。上游引物的3’端距離探針的5’端為1-20 bp，探針的5’端避免出現(xiàn)G，探針Tm要高于引物Tm值10℃左右；不同物種的探針用不同的熒光基團標記（FAM、HEX、ROX以及CY5）；如果探針Tm值和引物Tm值接近，探針3’端可以選擇MGB基團； （二） 收集各種來源于不同動物的肉（鮮肉、肉干及香腸）和乳（鮮乳、發(fā)酵乳、乳酪及乳粉）。利用改良CTAB法提取樣品的DNA（A260 nm/A280 nm≈1.8，瓊脂糖凝膠電泳主帶無拖尾，Nanodrop和Qubit定量一致性較高）； （三） 特異性分析：利用實時熒光PCR對5組引物和探針進行檢測，有典型擴增曲線且Ct值≤35計為檢出。在陽性對照檢出、陰性對照未檢出、對5組引物和探針進行特異性的分析評價。反應體系（20 μL）：TransStart Probe qPCR SuperMix 10 μL（北京全式金生物技術(shù)有限公司），引物各1 μL，探針各0.5 μL，模板DNA 1 μL，補水至20 μL。反應條件：94℃、30 s，1個循環(huán)；94℃、5 s，60℃、31 s，40個循環(huán)； （四） 絕對靈敏度分析：以來源于不同肉乳制品的高質(zhì)量DNA為模板母液，用滅菌ddH2O稀釋模板母液，共稀釋10個梯度，稀釋后質(zhì)量濃度分別為100、10、1、0.1、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00001 ng/μL。以不同稀釋濃度的DNA為模板對5組引物和探針進行檢測，根據(jù)PCR反應的Ct值分析此方法對于不同濃度模板DNA的檢測靈敏度。檢出限（LOD）統(tǒng)計分析參照Probit analysis。比較5組引物和探針的絕對靈敏度，分析引物和探針的特異性和保守性與絕對靈敏度之間的相關(guān)性； （五） 摻假檢出限（相對靈敏度）分析：首先，制備模擬摻假混合樣品（0.1%、1%、10%、30%、70%、90%、99%、99.9%），以上述摻假組為模板對5組引物和探針進行檢測，根據(jù)PCR反應的Ct值分析此方法對于不同濃度摻假的摻假檢出限。檢出限（LOD）統(tǒng)計分析參照Probit analysis。比較5組引物和探針的摻假檢出限（相對靈敏度），分析引物和探針的特異性和保守性與摻假檢出限之間的相關(guān)性； （六） 定量分析：以模板質(zhì)量濃度和摻假濃度的對數(shù)為橫坐標，以Ct值為縱坐標，構(gòu)建絕對定量標準曲線和摻假定量標準曲線，分析引物和探針的特異性和保守性與擴增效率和相關(guān)系數(shù)的相關(guān)性；利用已知濃度的盲樣驗證定量標準曲線的適用性，通過擴增效率（90%-110%）、相關(guān)系數(shù)R2（≥0.99）以及回收率（90%-110%）評價5組引物和探針的定量分析能力，分析引物和探針的特異性和保守性與定量分析能力之間的關(guān)系； （七） 相關(guān)數(shù)據(jù)已經(jīng)進行論文投稿以及專利申請。目前發(fā)表SCI論文2篇，在投稿SCI論文3篇，中文核心論文8篇，申請國家發(fā)明專利8項（授權(quán)1項）。 最終通過上述實驗確定黃牛和水牛源性成分同步檢測的引物和探針以及絕對靈敏度（1 pg）和相對靈敏度（0.1-1%）。此方法具有黃牛和水牛源性的特異性，來源于黃牛和水牛的肉乳樣品均出現(xiàn)相應探針的典型擴增曲線，且特異性探針Ct值≤35.0，質(zhì)控探針Ct值≤35.0；來源于非黃牛和水牛的肉乳樣品均沒有出現(xiàn)相應探針的典型擴增曲線，或特異性探針Ct值≥40.0，質(zhì)控探針Ct值≤35.0。結(jié)合實驗室驗證試驗所獲得的數(shù)據(jù)，起草了標準討論稿，現(xiàn)面向?qū)＜艺髑笠庖姟? 四、制定標準的原則和依據(jù)，與現(xiàn)行法律、法規(guī)、標準的關(guān)系 （一）總體原則 1.合法性。嚴格遵循《食品安全法》等法律法規(guī)的有關(guān)規(guī)定。 2.科學性。按照有關(guān)食品安全國家標準和在開展指標驗證的基礎(chǔ)上，科學、合理制定該地方標準。 3.真實性。堅持公開透明，從標準立項、專家論證、征求意見等方面向社會公開征求意見和建議。 （二）編制原則：堅持先進性、實用性、可操作性、規(guī)范性、公開透明的原則。 五、主要條款的說明，主要技術(shù)指標、參數(shù)、試驗驗證的論述 本標準是基于多重實時熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的黃牛和水牛源性成分同步檢測方法。方法具有特異性，絕對靈敏度和相對靈敏度可以達到1 pg和0.1-1%。此方法具有黃牛和水牛源性的特異性，來源于黃牛和水牛的肉乳樣品均出現(xiàn)相應探針的典型擴增曲線，且特異性探針Ct值≤35.0，質(zhì)控探針Ct值≤35.0；來源于非黃牛和水牛的肉乳樣品均沒有出現(xiàn)相應探針的典型擴增曲線，或特異性探針Ct值≥40.0，質(zhì)控探針Ct值≤35.0。試驗驗證過程參考上述具體實驗過程以及相關(guān)發(fā)表論文材料與方法。經(jīng)過特異性分析、絕對靈敏度分析、摻假檢出限以及定量分析，檢出限（LOD）統(tǒng)計分析參照Probit analysis，此方法的各項參數(shù)指標（特異性、靈敏度、檢出限）均達到編制標準的要求。 六、 重大意見分歧的處理依據(jù)和結(jié)果 無 七、采用國際標準或國外先進標準的，說明采標程度，以及國內(nèi)外同類標準水平的對比情況 目前，已經(jīng)存在一項水牛源性檢測方法標準：食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第7部分：水牛成分檢測 實時熒PCR法（SN/T 3730.7-2013）。在采用上述檢測標準后發(fā)現(xiàn)：目前缺乏基于同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的黃牛和水牛源性成分同步檢測方法的相關(guān)標準。本標準是基于多重實時熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的黃牛和水牛源性成分同步檢測方法的相關(guān)標準，具有快速、高通量以及去除假陰性等特征。 八、其他應說明的事項 無 九、標準草稿征求意見情況匯總表 序號 意見 提出單位/專家 采納 不采納（說明原因） 1 1. 原理要針對本標準的檢測方法，具體的研發(fā)過程在編制說明中體現(xiàn)； 2. 所用試劑應該體現(xiàn)配制方法，體現(xiàn)可操作性和可重復性； 3. PCR混合液要寫出配方； 4. 兼并引物要用相應字母代替； 5. 目的基因（線粒體12S rRNA）的寫法有待商榷； 6. 儀器不能寫在一大段中，每個儀器設(shè)備是一段； 7. DNA提取實驗步驟要具體，比如樣品的起始質(zhì)量； 8. 每個PCR擴增反應需要兩個平行； 9. 反應程序不完整，修改格式以及增加收集熒光部分； 10. 缺乏PCR擴增序列信息； 11. 質(zhì)量控制中內(nèi)容應該修正為無熒光對數(shù)增長或Ct值≥40.0。 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心（呼和浩特）/任超 采納 2 1. 試樣制備，可添加試樣制備時的取樣方法：如固體樣品的取樣點數(shù)、總樣品的四分法，保證樣品的均一性與代表性；每份樣品應制備2個測試樣本提取DNA，即設(shè)立雙平行； 2. 各引物、探針可注明序列長度；擴增后的目的片段也可注明序列長度； 3. 擴增體系表中可注明模板的濃度； 4. CTAB法提取基因組，是否需要蛋白酶K，使得降解更加快速徹底； 5. 可增加附錄，使得使用者更方便配制各類溶液； 6. CTAB提取液中各成分標示應統(tǒng)一單位； 7. 5.1.3中，可標明各成分使用量，方便使用者可選擇自行配制或購買預成品試劑。 內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢驗檢測中心/張彥斌 采納 3 1. 標準中“4原理”部分：凝練對所制定標準物種源性的原理描述，其中“定性分析”描述不準確； 2. 標準中“5.1試劑與材料”部分：應添加“除特別說明外，試劑配制所用溶劑都為重蒸餾水”； 3. 標準中“5.1.1、5.1.2”部分：所用試劑部分應分開列明信息； 4. 標準中“5.1.3”部分：“實時熒光PCR反應混合液購買于具有資質(zhì)的試劑公司”宜改為“市售實時熒光PCR反應混合液” 5. 標準中“5.2儀器設(shè)備”部分：標注微量移液器與pH計的精度； 6. 標準中“5.3.1試樣制備”部分：試樣制備中“明顯脂肪”、“復原乳”“固狀”等詞用法有待商榷； 7. 標準中“5.3.2 DNA提取”部分：實驗具體操作步驟描述不符合標準制定要求，例如“消化”、“75%乙醇洗滌一次，晾干”、“上清與上清液”、“中間層”等； 8. 標準中“5.3.4.1 表2”部分：表2中體積“μL”可統(tǒng)一標注于“體積（μL）”； 9. 編制說明中應添加實驗數(shù)據(jù)，闡明所設(shè)計方法的有效性和可靠性。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學/田瑞華 采納