細胞培養(yǎng)基本技術ppt課件

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第四章 細胞培養(yǎng)的基本技術,1,細胞培養(yǎng)技術平臺,基因治療 基因診斷 試管嬰兒 組織工程 藥物篩選 致病機理,,2,主要內容,基本操作技術和要求 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)和細胞系的維持 細胞凍存與復蘇 細胞培養(yǎng)污染的檢測和排除,3,細胞是生命活動的基本單位,1665年英國學者Robert Hooke，用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片，第一次發(fā)現(xiàn)植物的細胞結構，并首次借用拉丁文Cella（小室）詞. 1983-39德國植物學家施萊登和動物學家施旺確立了“細胞學說”的基本原則。 （１）細胞是有機體，動植物都是由細胞發(fā)育來的； （２）每個細胞都作為一個相對的獨立單位，有自己 的“生命”。 （３）新的細胞可以通過老的細胞繁殖產生。 進化論，遺傳學和細胞學說定為現(xiàn)代生物學的三大基 石，而細胞學說又是后二者的“基石“。,4,組織（細胞）培養(yǎng),從生物體內取出細胞（組織），模擬體內生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存、生長并維持其結構和功能的方法 。 細胞（組織），包括器官培養(yǎng)終歸是離體培養(yǎng)，缺少生物整體的嚴密聯(lián)系，不能代表整個機體。在進行醫(yī)學生物實驗過程及對結果的評估是都必須考慮這些。,5,1 基本操作技術和要求,由于體外培養(yǎng)的細胞沒有抗感染能力， 因此防污染是決定培養(yǎng)成功的首要條件。 一切操作需要保證無菌和有條不紊。,6,1 .1 培養(yǎng)室內的無菌技術,培養(yǎng)前的準備：按實驗計劃和程序 準備 物品，作到心中有數(shù) 培養(yǎng)室和超凈臺：定期全面徹底消毒 培養(yǎng)用品的無菌處理：高壓滅菌、過濾、酒精消毒 實驗中無菌培養(yǎng)操作：均在火焰近處進行，實驗用品需火焰滅菌，冷卻后接觸培養(yǎng)細胞，以防燒死細胞。,7,1.2 培養(yǎng)細胞的 取材,基本要求： 取材組織用培養(yǎng)液浸泡，4度運送，24h內盡快培養(yǎng)。 取材無菌操作，避免對組織的機械損傷，盡量去除脂肪、神經、結締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素和制霉菌素漂洗。 原代取材同時保留組織學和電鏡標本，對供體來源、部位及一般情況做記錄。,8,1.2.3 皮膚和粘膜的取材,皮膚和粘膜是上皮細胞培養(yǎng)的重要來源。 取材方法似斷層皮片手術，面積2-3mm2. 盡可能去除皮下和粘膜下組織。 因分布在體表，故細菌、霉菌很多，需嚴格消毒，可用較高濃度抗菌素漂洗。,9,1.2.4 內臟和實體瘤的取材,內臟除消化道和泌尿管道外基本是無菌的，明確取材部位，去除結締組織。 腫瘤組織取材避免壞死液化和結締組織， 標本應按污染組織處理。,10,1.2.5 血細胞的取材,血細胞培養(yǎng)可用于造血干細胞移植、免疫活性細胞的治療和染色體分析等。 取血抗凝劑量過大易導致溶血，肝素常用濃度為20U/ml, 針管用較高濃度肝素500U/ml濕潤。,11,1.3 組織材料的分離,欲從組織中獲得大量生長良好的細胞，須將組織分散開，使細胞解離出來。 常用方法有機械法和化學法。,12,1.3.1 細胞懸液的分離方法,離心法：血液和體液等細胞懸液500-1000rpm 轉速 5-10分鐘。離心速度過大、時間過長，會造成細胞損傷和死亡。 密度梯度離心法：用離心法將細胞分到不同密度的梯度介質中，再分別吸出各層細胞。適于分離密度不等的的細胞。常用介質有Ficoll 400, Percoll, 泛影葡胺等。。,13,1.3.2.1 機械分散法,適于較柔軟的組織，如腦、肝、脾、淋巴結、胸腺、胚胎組織和腫瘤組織等。 剪切組織為1mm3碎塊 后，置于組織勻漿研磨，或用吸管反復吹打分散組織細胞 組織液放在注射器內通過針頭壓出。 注射器針芯擠壓后，用PBS液洗滌，分別通過不銹鋼篩網(wǎng)80,150,400目孔徑篩網(wǎng)。 記數(shù)活細胞數(shù)，制成細胞懸液接種。,14,1.3.2.3 消化分離法,消化法是結合生化和化學手段把已剪切成較小體積的組織進一步分化，獲得細胞懸液直接進行培養(yǎng),15,1.3.2.3.1 胰蛋白酶法,主要作用是對細胞間蛋白質水解，使細胞離散。 活性以消化酪蛋白的能力測定，常用1：250 消化效果與pH值、溫度、酶濃度和組織塊大小與硬度有關， 對細胞分離作用與細胞的類型與性質關系密切 鈣鎂離子和血清抑制活性 常用劑量為0.25% （0.1-0.5%），pH值 8（8-9）溫度 37。 4度配制應用液。,16,1.3.2.3.2 膠原酶法,只對細胞間質膠原組織起消化作用，使上皮細胞與膠原成份分離 產品有I-V VII -IX等型，分別適用于分離肝細胞、胰島、脂肪細胞腎及纖維組織 鈣鎂離子和血清不影響活性, pH.6.5-7 常用劑量為200單位/ml或0.1μg/ml ~0.3 μg/ml,17,1.3.2.3. 3 EDTA法,EDTA（二乙烯四乙酸二鈉）作用較緩和。 主要作用：能從組織生長環(huán)境中吸取維持組織完整的鈣鎂離子。 單獨使用不能使細胞完全分散， 常用1:1的EDTA（0.02%）和胰蛋白酶0.25%混合液,18,2 原代培養(yǎng),也稱初代培養(yǎng), 是從供體取得組織細胞后在體外進行的首次培養(yǎng)。 細胞保持原有的基本性質，仍具二倍體遺傳物性。最接近和反映體內生長特性。適合作藥物測試，細胞分化研究。 原代培養(yǎng)細胞部分生物學特征尚不穩(wěn)定，供體和細胞間有很大差異。,19,2. 1 組織塊培養(yǎng)法,將組織剪成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶，24小時貼壁后，細胞就從組織周圍長出。 培養(yǎng)瓶底預先涂以膠原薄層，以利上皮細胞的生長。 如需做組織染色或電鏡檢查，可將組織可放入小蓋玻片上后再放進培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。 換液需輕巧，以免組織塊漂起，細胞死亡,20,2. 2 消化培養(yǎng)法,采用前述的組織消化分散法。將妨礙細胞生長的細胞間質去除，使細胞分散，形成懸液，按不同濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。,21,3 傳代培養(yǎng)和細胞系的維持,培養(yǎng)細胞增殖長滿瓶壁時，既達到所謂的飽和密度。此時正常細胞則不再生長；惡性細胞重疊生長，易于從瓶壁上成片脫落,，為此傳代勢在必行。,22,培養(yǎng)細胞的生長過程,1） 原代（初代）培養(yǎng)期：從機體取下組織培養(yǎng)到第一次傳代，此代細胞保持異質性，細胞種類較多，接近原組織細胞種類。維持時間，因細胞種類不同，一般1-4周。 2） 傳代期培養(yǎng)：初代培養(yǎng)的細胞生長到一定程度，即可連接傳代，使其連續(xù)生長。 一般正常二倍體細胞，不加附加條件，可傳代30-50代，此時可發(fā)生染色體丟失、突變、細胞增殖變慢、停止分裂，進入衰退期，我們稱之有限細胞系。這一轉折點有人稱之危象臨界點（crisis） 有些細胞的少數(shù)后代，或通過人工條件轉化的細胞可通過這一期，獲得持久的增殖傳代能力，我們稱細胞系，或無限細胞系，即一般通稱的細胞系。,23,,（3） 衰退期：傳代細胞到達一定代數(shù)，即發(fā)生增殖緩慢，逐 漸停止，進而發(fā)生衰退、死亡，多數(shù)傳代細胞（或叫有限細胞系），不能通過所謂的“crisis（危象臨界點），導致最終死亡，這一現(xiàn)象可能說明生物學衰老的細胞學基礎。 人胚胎成纖維細胞可以進行60代增殖，而80歲老人的肺成纖維細胞僅傳代了16代后便死亡。表皮細胞壽命4-10天；紅細胞3周-3個月，白細胞5-7天，神經細胞數(shù)年或更多。,24,密度抑制（Density inhibition）或接觸抑制（Ccontact inhibition）,1958年Abercrombie 等學者提出的一種現(xiàn)象，培養(yǎng)細胞再生長過程中多發(fā)生分裂增殖，細胞移動而相互靠近，這時某些細胞可移向其他方向，保證細胞不會重疊，一但接觸，這種活動即可停止。 所謂接觸抑制實際使細胞匯合形成單層時，細胞變得擁擠，與培養(yǎng)液接觸的表面區(qū)域也相應減少，營養(yǎng)成分消耗，其分裂也將停止。,25,細胞生長曲線,細 胞 數(shù) 量,生長天數(shù),緩慢生長期,對 數(shù) 生 長 期,平 衡 期,26,,（1） 遲緩期（或延遲期） 當細胞接種到培養(yǎng)瓶后，細胞逐漸貼附于瓶底，并恢復貼壁形狀，代謝開始旺盛，出現(xiàn)細胞分裂及增殖，但生長緩慢。 （2） 對數(shù)生長期：此期幾乎所有的細胞都在進行分裂，細胞數(shù)目迅速增長。期細胞倍增時間（TD）等于細胞周期時間（TC）長度。這一期常用細胞倍增時間及細胞分裂指數(shù)來判定。 （3） 平衡期（平坦期）這期細胞數(shù)目雖然在增加，但其增加速度在減慢，直至細胞數(shù)量不再增加，處于平衡狀態(tài)。,27,3.1 原代細胞培養(yǎng)的傳代,細胞由培養(yǎng)瓶內分離再培養(yǎng)稱之為傳代, 進行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代。 原代培養(yǎng)的首次傳代是建系的關鍵時期，細胞需覆蓋大部分瓶底后再傳代。 首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些，使細胞能盡快適應新環(huán)境而利于細胞生存和增殖。,28,3.2 細胞傳代方法,貼壁生長的細胞用消化法傳代； 部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代； 懸浮生長的細胞采用離心分離后傳代，,29,3.2.1 貼壁細胞傳代步驟,吸除瓶內舊培養(yǎng)液；加入1ml消化液；37C或室溫25 C消化2 ~ 5分鐘 顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質回縮、細胞間隙增大后； 直接加少許含血清的培養(yǎng)液，終止消化； 細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液計數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內。,30,3.2.2 懸浮細胞的傳代,直接傳代即讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清洗掉1/2 ~ 1/3，然后用吸管吹打形成細胞懸液后，再傳代。 離心法：離心800 ~ 1000rpm，5min，除上清，加新的培養(yǎng)液，然后傳代接種。 部分貼壁生長細胞直接吹打傳代或需消化后傳代,31,3.3 細胞系的維持,是通過換液、傳代和細胞凍存實現(xiàn)的： 建立檔案：記錄組織來源，生物學特性，培養(yǎng)液要求、傳代、換液時間和規(guī)律，細胞的遺傳學標志，生長形態(tài)，常規(guī)病理染色的標本等。,32,3.3 細胞系的維持,防細胞之間的交叉污染，傳代時所用器械要編號或做好標記 每一種細胞系都應有充足的凍存儲備，以防絕種； 另外二倍體細胞等有限細胞系如果暫時不用最好凍存以免傳代太多，造成細胞衰老或發(fā)生改變,33,4.3.4 培養(yǎng)細胞的純化,自然純化 自然純化 即利用某一種類細胞的增殖優(yōu)勢，而排除其它細胞生長，靠自然的增殖潛力最后留下生長優(yōu)勢細胞，去除其它細胞，達到細胞純化的目的。,34,4.3.4.2 人工純化,利用人為手段造成對某一細胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其它細胞的生長，從而達到純化細胞的目的。,35,3.4.2.1 酶消化法,酶消化法：由于上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同,，成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當長的時間才脫壁，利用這種差異采用多次差別消化方法將上皮細胞和成纖維細胞分開。,36,3.4.2 .2 機械劃除法,機械劃除法：上皮細胞和成纖維細胞多數(shù)都同時出現(xiàn)，混雜生長常常分區(qū)呈片，采用機械的方法去除不需要的細胞區(qū)域，而保留需要的細胞。,37,3.4.2 .3 反復貼壁法,成纖維細胞和上皮細胞相比，其貼壁過程快，大部分細胞常能在短時間內大約10 ~ 30min完成附著過程（但不一定完全伸展）；而上皮細胞大部分細胞在短時間內不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，這樣可以利用此差別來純化細胞,38,3.4.2 .4 克隆法,將細胞分成單個細胞，使之分別生長成克隆，然后對每一克隆進行測試，選擇出所需要的克隆。,39,3.4.2 .5 培養(yǎng)基限定方法,某些細胞在生長過程中必須存在或必須去除某種物質，否則將無法生長。而其它細胞與之相反，可以利用這種技術來純化細胞。如雜交瘤技術常用的HAT培養(yǎng)液，就用來篩選雜交瘤細胞而抑制其它細胞。,40,4.1 細胞的凍存,凍存細胞要緩慢冷凍。 減少細胞內冰晶的形成是減少細胞損傷的關鍵。 冷凍保護劑的使用，可使細胞免受冰晶形成和滲透壓改變而致的損傷。常用二甲基亞砜和甘油。 凍存細胞最好每三個月復蘇一次，檢測細胞原特性是否改變。,41,細胞凍存步驟,取生長對數(shù)期的細胞消化成細胞懸離心 細胞記數(shù) 2.5x106/ml凍存液 加含10%DMSO凍存液熔封 置4度數(shù)小時，負20度過夜 或 -70°C放置2-3h 移入液氮罐中 記錄,42,細胞復蘇步驟,取出安瓶立即放入37°C水中 消毒安瓶開封后將細胞 移入離心管中加培養(yǎng)液離心 記數(shù) 接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng),43,4.3培養(yǎng)細胞的運輸,冷凍儲存運輸，即利用特殊容器內盛液氮或干冰凍存 充液法：（1）選擇生長狀態(tài)良好的細胞。一般以生長1/3 ~ 1/2瓶底壁為宜，換新液，保留微量空氣，擰緊瓶蓋（2）用棉花等做防震防壓處理,44,5細胞培養(yǎng)污染的檢測和排除,培養(yǎng)細胞的污染概念包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存生存有害的成份和造成細胞不純的異物（真菌、細菌、病毒和支原體）、化學物質及細胞,45,微生物污染的途徑,空氣：一般培養(yǎng)室環(huán)境中每立方米含菌數(shù)不應超過1 ~ 5個 器材：CO2溫箱 操作 血清 組織樣本,46,微生物污染的檢測,真菌污染 細菌污染 支原體污染：可做如下檢測 （1）相差顯微鏡檢測 （2）熒光染色法 （3）電鏡檢查 （4）DNA分子雜交或支原體培養(yǎng)等方法,47,微生物污染的防治,防止的關鍵在于嚴格無菌操作，把好每一個關口，盡可能禁止其它污染的物品進入培養(yǎng)操作環(huán)節(jié)：,48,微生物污染的防治,抗生素：一般用常用量的5 ~10倍作沖擊療法。用藥24 ~ 48h后，再換常規(guī)培養(yǎng)液。 加溫處理：根據(jù)支原體對熱敏感的特點，將受支原體污染的細胞放置在41 °C作用5 ~ 10h，最長不超過18h，以殺滅支原體。 動物體內接種：將支原體污染的細胞接種在同種動物的皮下或腹腔，借動物體內的免疫系統(tǒng)消滅支原體。待一定時間后取出細胞，做原代培養(yǎng)再進行繁殖。,49,細胞交叉污染,有效防止細胞交叉污染： 所有器具要嚴格區(qū)分 不要觸及培養(yǎng)液瓶瓶口 細胞系都要在早期留有充足的凍存儲備，可以復蘇早期凍存細胞使用。,50,流式細胞儀分離法,流式細胞儀可根據(jù)細胞核酸含量、某些物質含量或細胞結構大小等參數(shù)來將細胞分離成不同的群體。,51,培養(yǎng)細胞生長狀態(tài)的觀察,貼附生長型 為能附著于底物表面生長的細胞， 懸浮生長型 懸浮狀態(tài)即可生長，如血、骨髓 脾細胞。,52,培養(yǎng)細胞的生長特性,貼附：附著于底物如其它細胞、膠元、玻璃或塑料，促細胞附著物質如基膜素、纖維連接素、膠元、血清擴展因子可能參加細胞的粘附過程。 接觸抑制：當兩個細胞相互接觸時，細胞不再移動，細胞膜皺褶樣活動停止。 密度依賴性：細胞稀少時生長迅速，融合成片后，分裂停止。,53,常規(guī)觀察,需每天觀察細胞生長過程中出現(xiàn)的變化： 1. 培養(yǎng)液的顏色與透明度 2 .細胞形態(tài)變化 3.細胞生長狀態(tài) 4. 微生物污染,54,細胞形態(tài)變化的觀察,相差顯微鏡：利用光通過不同物質時 的折射和物體厚度差別，產生衍射而引起光程改變，產生相位差的特性，用于觀察培養(yǎng)細胞的附著、貼壁、伸展、移動、有絲分裂等形態(tài)活動。 狀態(tài)好的細胞透明度大，折光性強，輪廓清楚，分裂期細胞多見。 狀態(tài)差的細胞，失去原來的特點，胞質出現(xiàn)空泡、顆粒，細胞變形，出現(xiàn)死亡。,55,細胞計數(shù),它是 了解細胞生長狀態(tài)的量化指標。 制備細胞懸液，密度不低于10000細胞/ ml，用10x物鏡觀察計數(shù)板四角大方格的細胞數(shù) 計數(shù)：細胞數(shù)/ml原液＝（4大格細胞數(shù)之合/4）X 10000 注意：細胞分散均勻制成單個細胞懸液。,56,活細胞的染料排除檢測法,細胞損傷或死亡時，細胞膜通透性發(fā)生變化，某些染料可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA結合，使其著色，而活細胞能排出進入細胞內的染料，或阻止這類染料進入細胞內，因而不易著色。借此可以鑒別死活細胞。,57,細胞活力測定的MTT比色法,原理：活細胞的線粒體脫氫酶能將染料MTT（二甲基噻唑二笨基四唑溴鹽）轉變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙滋骖w粒，后者被酸性異丙醇溶解后所呈現(xiàn)的色度（用OD值表示）反映出生活細胞的代謝水平。死亡細胞則無此酶活性。,58,,細胞培養(yǎng)技術的商業(yè)化：對于生物技術所使用的各種細胞株的價值，很難作出評價。1998年，美國市場就達3.5-4億美元，而且還以6-8%的速度在增長。下邊介紹幾家美國細胞株供應公司和機構。,59,美國細胞株供應公司和機構,名 稱 網(wǎng) 址 Invitrogan www.I 有關不同細胞株的用戶論壇 ATCC www.atcc.org 各種細胞株的主要供應者 www.nci.nih.gov 提供有關細胞株的篩選 Cellsalive 生產各種細胞感染、 凋亡其它細胞過程的錄象和圖片 Gentest 藥物代謝試驗用的酶和肝細胞主要供應者 Expession Systems 桿病毒細胞株的主要供應者 Life Tech 供應基礎研究用的特異化細胞株,60,方法與結果,96孔板培養(yǎng)細胞， 加入20ul MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸去上清液， 加入100ul二甲基亞楓 酶標儀測定光吸收，波長490nm.,61,細胞分裂指數(shù),計算分裂細胞占全部細胞中比例的方法， 以表示細胞的增值程度。一般要計算和觀察1000個細胞中的細胞分裂相數(shù)。 方法：細胞接種于放置小玻片的培養(yǎng)瓶內，每24h取出一個小玻片，95％酒精固定，吉姆薩染色。計算出1000個細胞中分裂相平均數(shù)值和所占百分比。按所測的百分數(shù)逐日順序繪制成圖。,62,細胞生長曲線,利用細胞計數(shù)法進行 同一種密度準確接種細胞，以7－10天能長滿而不發(fā)生生長抑制為度 每天取三瓶細胞計數(shù)，連續(xù)1－2周， 以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)為縱軸（對數(shù)）， 生長曲線上細胞數(shù)量增加1倍時間為細胞倍增時間,63,