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1、課題3 血紅蛋白的提取和分離,,血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán),此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳,血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。,一、基礎(chǔ)知識(shí):,學(xué)生活動(dòng)1:,1 、分離生物大分子的基本思路是什么?,2 、不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異?,3 、本課題我們將利用血紅蛋白與雜質(zhì)蛋白哪方面的差異進(jìn)行提純?,4 、為什么不用雞的血紅細(xì)胞而用人的血紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料?,5 、用什么方法分離相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì) ?,一、基礎(chǔ)知識(shí)--蛋白質(zhì)提取和分離原理,蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì):,形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別。,(1)
2、原理: (2)材料,大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙,路程短,流動(dòng)快; 小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部,路程長,流動(dòng)慢。,多孔性的多糖類化合物,如葡聚糖、瓊脂糖。,(一)凝膠色譜法,(3)分離過程,洗脫:從色譜柱上端不斷注入緩沖液,促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。,(一)凝膠色譜法,1、什么是凝膠?,2、什么是凝膠色譜法?,學(xué)生活動(dòng)2:,3、凝膠色譜法的原理是什么?,4、請(qǐng)用自己的話總結(jié)出凝膠色譜法分離相對(duì)分子質(zhì)量不同蛋白質(zhì)的具體過程。,1 、什么是緩沖液?,2、 緩沖液的作用是什么?,學(xué)生活動(dòng)3:,3、 緩沖液是如何配制的?你所學(xué)過的人體 血液的緩沖物質(zhì)有哪些?,4、 本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液?為何要加緩
3、沖液?,(二)、緩沖溶液,由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。 如H2CO3/NaHCO3,醋酸/醋酸鈉,NaH2PO4/Na2HPO4等,緩沖溶液洗脫劑 組成: 配制: 作用:,調(diào)節(jié)緩沖劑的比例,可配制不同pH的緩沖液。,抵制外界酸堿對(duì)溶液pH的干擾而保持 pH穩(wěn)定。,(二)、緩沖溶液,1 、什么是電泳?,2、 影響電泳遷移速度的因素有哪些?,學(xué)生活動(dòng)4:,4、電泳分離各種分子的原理是什么?,(三)、電泳,3、 如何消除電荷對(duì)電泳遷移速度的影響?,5 、請(qǐng)描述電泳的過程?,2凝膠電泳法:,(1)原理:,不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同,在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同,導(dǎo)致不同蛋
4、白質(zhì)在電場中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。,影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素,(三)電泳,1.電泳的概念,指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程.,影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素,,,,,,,,在一定pH下,使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電;加入帶負(fù)電荷多的SDS,形成“蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物”,使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。,(2)分離方法: (3)分離過程:,瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。,(三)電泳,電泳檢測(cè)結(jié)果,,,,二、實(shí)驗(yàn)操作,蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步: (1)樣品處理:包括洗滌紅細(xì)胞;血紅蛋白釋放;離心分離等操作收集到的血紅蛋白溶液。 (2)粗分離:透析除去分子較小的雜質(zhì)。 (3)
5、純化:通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。 (4)純度鑒定:通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。,(一)樣品處理,1、紅細(xì)胞的洗滌: 目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固;離心將血液分層,用膠頭吸管吸出黃色血漿;用生理鹽水洗滌。 2、血紅蛋白的釋放: 在蒸餾水和甲苯作用下,紅細(xì)胞破裂釋放 3、分離血紅蛋白溶液: 離心分層;濾紙過濾去除脂溶性沉淀層;分液漏斗分出紅色透明液體。 4、透析:裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中(PH為7.0)透析。,二、實(shí)驗(yàn)操作,跳轉(zhuǎn),血液組成成分,閱讀思考: 血液由______和________兩部分組成。 血細(xì)胞中________細(xì)胞數(shù)量最多,紅細(xì)胞的含量
6、最高的有機(jī)化合物是_____________。 該化合物是由 _____________和____________構(gòu)成的,其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與O2和CO2結(jié)合的___________基團(tuán)。,返回,1.洗 滌 紅 細(xì) 胞,閱讀思考:洗滌的目的是什么? 洗滌過程:,血液 100mL,重復(fù)洗滌3次,直至上清液沒有黃色,采集得到雞血,初次離心后的結(jié)果,3次洗滌后的結(jié)果,返回,2.釋放血紅蛋白,閱讀思考: 釋放血紅蛋白過程中,在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)? 為了加速釋放過程,采取了什么措施?,目的分析: 蒸餾水的作用是______________________________。 加入甲苯的作
7、用是____________________________。 充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。,使紅細(xì)胞大量吸水脹裂,溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜,加速紅細(xì)胞的破裂,(2)血紅蛋白的釋放:,加蒸餾水到原血液體積,再加40體積的甲苯,置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘(加速細(xì)胞破裂),細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。,磁力攪拌器,返回,3.分離血紅蛋白,分離過程,紅細(xì)胞 混合液,,,,,,,,,,,燒杯,(3)分離血紅蛋白溶液:,過程:將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),以2000r/min的速度離心10 min。 試管中溶液層次:第1層(最上層):甲苯層(無色透明);第2層
8、(中上層):脂溶性物質(zhì)沉淀層(白色薄層固體);第3層(中下層):血紅蛋白的水溶液層(紅色透明液體);第4層(最下層):雜質(zhì)沉淀層(暗紅色)。 分離:用濾紙過濾,除去脂溶性沉淀層,于分液漏斗中靜置片刻后,分出下層的紅色透明液體。,甲苯層(無色透明),白色薄層固體,紅色透明液體,雜質(zhì)沉淀層(暗紅色),試管中溶液層次,返回,4.透析血紅蛋白,利用透析袋透析,透析過程,返回,純化凝膠色譜操作,1.凝膠色譜柱的制作:,2.凝膠色譜柱的裝填:,教材圖519,3.樣品的加入和洗脫,,,返回,(二)凝膠色譜操作,(1)凝膠色譜柱的制作: 取長40厘米,內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管,兩端需用砂紙磨平。 底塞的制作:
9、打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng),再用100目尼龍紗包好,插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng):底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面,否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng),還會(huì)導(dǎo)致液體殘留,蛋白質(zhì)分離不徹底。 頂塞的制作:打孔安裝玻璃管。 組裝:將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。 安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。,裝配好的凝膠柱,返回,材料:交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75;20mmol/L磷酸緩沖液 裝填:,2.凝膠色譜柱的裝填:,立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h,洗滌平衡,一次性緩慢倒入;輕輕敲打,裝填懸浮液,凝膠顆粒洗脫液沸水浴,凝膠顆粒蒸餾水充分溶脹,根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量,色譜柱垂直固定在支架上,配制懸浮液,計(jì)算稱
10、量凝膠,固定色譜柱,(2)凝膠色譜柱的裝填,凝膠的選擇:A、材料:交聯(lián)葡聚糖凝膠(G-75)。B、代表意義:“G”表示凝膠的交聯(lián)程度,膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值,即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。 凝膠的前處理:配制凝膠懸浮液:計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后,配成凝膠懸浮液。 凝膠色譜柱的裝填方法:A、固定:將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填:將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi),裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱,使凝膠填裝均勻。注意:1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密,以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在:因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序,降低分離效果
11、。,洗滌平衡:裝填完畢后,立即用緩沖液洗脫瓶,在50cm高的操作壓下,用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液(pH為7.0)充分洗滌平衡12小時(shí)。 注意:1、洗脫液面不要低于凝膠表面,否則可能有氣泡混入,影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干,露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。,返回,3.樣品加入與洗脫,調(diào)節(jié)緩沖液面:打開下端出口,使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊,關(guān)閉出口。 滴加透析樣品:吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端,滴加樣品時(shí),吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣,同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 樣品滲入凝膠床:加樣后打開下端出口,使樣品滲入凝膠床內(nèi),等樣品完全進(jìn)入凝膠
12、層后,關(guān)閉下端出口。 洗脫:小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度,連接緩沖液洗脫瓶,打開下端出口進(jìn)行洗脫。 收集:待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí),用試管收集流出液,每5ml收集一試管,連續(xù)收集。(在分離過程中,如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng),說明色譜柱制作成功) 注意:正確的加樣操作:1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。,3.樣品的加入和洗脫,,,,3.樣品加入與洗脫,注意:正確的加樣操作是:1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。,收集得到的純化后的血紅蛋白,注意事項(xiàng),1. 紅細(xì)胞的洗滌: 洗滌次數(shù)不能過
13、少;低速、短時(shí)離心。 2. 凝膠的預(yù)處理: 沸水浴法時(shí)間短,還能除去微生物和氣泡 3. 色譜柱的裝填: 裝填盡量緊密,降低顆粒間隙;無氣泡;洗脫液不能斷流。 4. 色譜柱成功標(biāo)志:紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。,,返回,觀察你處理的血液樣品離心后是否分層(見教科書圖5-18),如果分層不明顯,可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外,離心速度過高和時(shí)間過長,會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀,也得不到純凈的紅細(xì)胞,影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。,三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià),1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理?你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎?,2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生?你的色譜柱裝填得成
14、功嗎?你是如何判斷的?,由于凝膠是一種半透明的介質(zhì),因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈,檢查凝膠是否裝填得均勻。此外,還可以加入大分子的有色物質(zhì),例如藍(lán)色葡聚糖2000或紅色葡聚糖,觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整,說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡,輕輕敲打柱體以消除氣泡,消除不了時(shí)要重新裝柱。,如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話,能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整,隨著洗脫液緩慢流出;如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬,說明分離的效果不好,這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。,3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中,紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎?請(qǐng)描述紅色區(qū)帶
15、的移動(dòng)情況,并據(jù)此判斷分離效果?,知識(shí)總結(jié),血紅蛋白的提取和分離,教學(xué)反饋,1凝膠色譜法是根據(jù)( )分離蛋白質(zhì)的有效方法。 A分子的大小 B相對(duì)分子質(zhì)量的大小 C帶電荷的多少 D溶解度 2緩沖液的作用是:在一定范圍內(nèi),抵制外界的影響來維持( )基本不變。 A溫度 B pH C滲透壓 D氧氣濃度,B,B,3電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷( )的電極移動(dòng)。 A相同 B相反 C相對(duì) D相向 4. 哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的( )與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。 A血紅蛋白 B肌紅蛋白 C肌動(dòng)蛋白 D肌球蛋白,B,A,5血液由血漿和各種血細(xì)胞組成,其中(
16、)的含量最多。 A白細(xì)胞 B血小板 C紅細(xì)胞 D淋巴細(xì)胞 6為防止血液凝固,在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)? )。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸餾水 D.檸檬酸鈉,C,D,7將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中,離心后,可以明顯看到試管中的溶液分為4層,其中第3層是( ) A無色透明的甲苯層 B脂溶性物質(zhì)的沉淀層 C血紅蛋白的水溶液 D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物,C,1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代,對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入,首先要做的一步是 A 弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) B 弄清各種蛋白質(zhì)的功能 C 弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程 D 獲得高純度的蛋白質(zhì),練習(xí)鞏固,2、用凝膠色譜法分離蛋
17、白質(zhì)的過程中,關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述,正確的是 A 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) B 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) C 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) D 二者根本無法比較,3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中,不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于 A 電荷的多少 B 分子的大小 C 肽鏈的多少 D 分子形狀的差異 4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是 A 調(diào)節(jié)pH B 維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng) C 防止微生物生長 D 防止血液凝固,5、一分子血紅蛋白最多可攜帶的 O2分子數(shù)和CO2分子數(shù)分別是 A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1 6、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序自上而下是: 有機(jī)溶劑-----脂類物質(zhì)-----血紅蛋白溶液------紅細(xì)胞破碎物沉淀,