DBS45 023-2015 食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 水牛乳及其制品中摻入牛屬乳的定性檢測 PCR法.doc

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ICS?點擊此處添加ICS號 點擊此處添加中國標(biāo)準(zhǔn)文獻分類號 ????? DBS45 廣西壯族自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn) DBS 45/023—20154 ????? 食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 水牛乳及其制品中摻入牛屬乳的定性檢測 PCR法 ???（報批稿）?? （ 審定稿報批稿） 2014 2015 - －XX 03- －XX05發(fā)布 2014 2015 - －XX 04 - －XX05實施 ?????廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生計生委廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會 發(fā)布 ????? ???發(fā)布 ????? DBS 45/023—20154 前??言 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1－2009的格式編寫。 本標(biāo)準(zhǔn)由廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會提出。 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：廣西壯族自治區(qū)水牛研究所、廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心。 本標(biāo)準(zhǔn)起草人：曾慶坤、林波、黎穎、李玲、盧安根、杜寒春、巫堅、黎德全、黃麗、劉永強。 10 水牛乳及其制品中摻入牛屬乳的定性檢測 PCR法 1　 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)適用于水牛乳及其制品中摻入牛屬乳的 PCR 定性檢測。 2　 規(guī)范性引用文件 下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 19495.2-—2004 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求 GB/T 6682—-2008 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法 3　 術(shù)語和定義 3.1 水牛乳 水牛屬動物（Bubalus bubalis ）乳腺分泌產(chǎn)生的乳白色液體物質(zhì)。 3.2 牛屬乳 牛屬動物（Bos taurus），包括荷斯坦和娟姍牛乳腺分泌產(chǎn)生的乳白色液體物質(zhì)及其制品。 3.3 水牛乳制品 以生水牛乳為原料，經(jīng)過相應(yīng)工藝加工制成的液態(tài)乳、發(fā)酵乳和干酪等各種產(chǎn)品的總稱。 3.4 PCR(聚合酶鏈反應(yīng)) 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）是一種在體外快速擴增特定基因或DNA片段的方法。由“熱變性→復(fù)性→延伸”三步反應(yīng)組成一個PCR循環(huán)，經(jīng)過多次循環(huán)反應(yīng)，使目標(biāo)DNA得以大量擴增。 3.5 特異性引物 針對特定模板 DNA 片段設(shè)計的兩段與模板兩端分別互補的一對寡核苷酸序列，在PCR反應(yīng)中與模板 DNA 兩端分別特異性結(jié)合。 3.6 陽性摻入對照 從生水牛乳與生牛屬乳比例為1：：1的混合乳中按照6.1.1的操作提取得到的總DNA，按照6.3的PCR程序擴增后，經(jīng)電泳檢測會在220bp和346bp位置各出現(xiàn)一條電泳條帶。 3.7 陰性摻入對照 從生水牛乳中按照6..1..1的操作提取得到的總DNA，按照6.3的PCR程序擴增后，電泳檢測僅在220bp位置出現(xiàn)一條電泳條帶。 3.8 陰性質(zhì)控對照 在PCR擴增時，用雙蒸水代替模板，其它操作相同。 4　 方法原理 采用DNA提取試劑或試劑盒，提取樣品中的DNA，以提取的DNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，對比DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量條帶，檢驗PCR產(chǎn)物是否有大小為220bp的水牛特異性條帶或346bp的牛屬特異性條帶，特異性條帶的核苷酸序列信息見附錄A，從而對水牛乳或水牛乳制品中是否摻入牛屬乳進行檢驗和判斷。 5　 試驗材料 5.1　 特異性引物 根據(jù)12S rRNA基因的核苷酸序列設(shè)計引物，其中一條為水牛與牛屬牛12S rRNA的通用引物，另兩條分別為擴增水牛12S rRNA基因與牛屬牛12S rRNA基因的特異性引物，擴增水牛12S rRNA基因片段大小為220bp ，擴增牛屬牛12S rRNA基因片段大小為346bp。引物序列見附錄 B.1，使用前先用滅菌雙蒸水稀釋，引物稀釋后分裝成小劑量置于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩? 5.2　 試劑 除另有規(guī)定外，所用生化試劑均為分析純，水為符合GB/T 6682-1992的滅菌雙蒸水或超純水。 5.2.1　 DNA抽提試劑 酚-氯仿-異戊醇法抽提DNA試劑如下:消化緩沖液（10 mmol/L Tris-Cl，pH7.6；2 mmol/L EDTA，pH 8.0；0.5% SDS；75 mmol/L NaCl）；20mg/mL 蛋白酶K；Tris飽和苯酚；氯仿；3 mol/L 乙酸鈉；無水乙醇；異丙醇；75%乙醇；TE緩沖液(10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)。 或用等效的食品專用DNA抽提試劑盒。 5.2.2　 PCR 試劑、電泳試劑、其它試劑 Taq DNA 聚合酶；dNTPs混合物：包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP；MgCl2；或 PCR Mix試劑盒。核酸染料GelRed；6×DNA電泳上樣緩沖液；1倍Tris-硼酸電泳緩沖液。滅菌雙蒸水；1 mol/L 滅菌 PBS，pH7.4。 5.2.3　 試劑配制方法 試劑配制方法見附錄 C。 5.3　 儀器設(shè)備及耗材 5.3.1　 儀器設(shè)備 PCR 儀；電泳儀；電泳槽；核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計；凝膠成像系統(tǒng)；低溫離心機；小型高速離心機；水浴鍋；旋渦振蕩器；掌上離心機；微量加樣器：100μL～1 000μL、20μL～200μL、10μL～100μL、0.5μL～10μL和0.1μL～2.5μL等多種規(guī)格。 5.3.2　 一次性耗材 一次性PE手套；離心管：1.5mL；PCR反應(yīng)管：0.2mL；吸頭：1 000μL、200μL、10μL等多種規(guī)格。 6　 操作程序 6.1　 待檢樣品的DNA抽提 6.1.1　 生水牛乳及液態(tài)水牛乳制品樣品的DNA提取 取50mL乳樣于50mL離心管中，2500r/min離心20min，用小勺撇去離心管上層的乳脂，再用吸管將上清液吸出，保留最底部的沉淀，用無菌棉球或棉簽擦除離心管壁上殘存乳脂；然后向離心管中加入20mL pH7.4的PBS，輕輕敲打離心管使沉淀懸浮，2500 r/min離心20 min，用吸管將上清液吸出，保留最底部的沉淀，再用無菌棉球擦除離心管壁上殘存乳脂；如果乳脂殘存過多，再次重復(fù)向離心管中加入20mL pH7.4 PBS、離心、除脂的操作步驟；最后將上清液吸出，保留最底部的沉淀；按照食品專用DNA抽提試劑盒中步驟抽提DNA。DNA提取除采用試劑盒外，也可采用酚-氯仿-異戊醇法(用酚-氯仿-異戊醇法提取DNA的步驟見附錄D)提取。DNA提取后置于-20℃保存。 6.1.2　 發(fā)酵水牛乳樣品的DNA提取 取一定量(約10 mL或10g)樣品于50mL離心管中，然后向離心管中加入20mL pH7.4的PBS，輕輕敲打離心管使沉淀懸浮，2500r/min離心20min，用小勺撇去離心管上層的乳脂，再用吸管將上清液吸出，保留最底部的沉淀，再用無菌棉球擦除離心管壁上殘存乳脂；如果乳脂殘存過多，再次重復(fù)向離心管中加入20mL pH7.4的PBS、離心、除脂的操作步驟；最后將上清液吸出，保留最底部的沉淀；按照食品專用 DNA 抽提試劑盒中步驟抽提DNA。DNA提取除采用試劑盒外，也可采用酚-氯仿-異戊醇法(用酚-氯仿-異戊醇法提取DNA的步驟見附錄D)提取。DNA提取后置于-20℃保存。 6.1.3　 水牛乳干酪樣品的DNA提取 取2g干酪樣品，充分研碎后置于50 mL離心管中；然后向離心管中加入20mL pH7.4的PBS，搗碎并劇烈震蕩使沉淀懸浮，2500r/min離心20min，用小勺撇去離心管上層的乳脂，再用吸管將上清液吸出，保留最底部的沉淀，再用無菌棉球擦除離心管壁上殘存乳脂；如果乳脂殘存過多，再次重復(fù)向離心管中加入20mL pH7.4的PBS、離心、除脂的操作步驟；按照食品專用DNA抽提試劑盒中步驟抽提DNA。DNA提取除采用試劑盒外，也可采用酚-氯仿-異戊醇法(用酚-氯仿-異戊醇法提取DNA的步驟見附錄D)提取。DNA 提取后置于-20℃保存。 注： 以酚-氯仿-異戊醇法或食品專用DNA抽提試劑盒提取酸乳和干酪DNA的過程中，如果使用蛋白酶K消化后，所得溶液比較渾濁的話，再次添加相同量的蛋白酶K，并延長一倍的孵化時間，以確保蛋白消化完全。 6.2　 DNA濃度和純度的測定 取5μL DNA溶液加雙蒸水稀釋至1mL，用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm 和280nm處的吸光值 A260和 A280。DNA的濃度按照式（1）計算： c=A×N×50/1000 ……………………（1） 式中： c——DNA 濃度，單位為微克每微升（μg/μL）； A——260 nm處的吸光值； N——核酸稀釋倍數(shù)。 當(dāng) A260/A280比值在1.7-1.9之間時，適宜于PCR擴增。 6.3　 PCR擴增 在冰浴條件下，按25μL的PCR反應(yīng)體系用量在PCR反應(yīng)管中分別加入各PCR試劑，每個樣本做三個平行，同時PCR擴增陽性摻入對照、陰性摻入對照和陰性質(zhì)控對照。25 μL的 PCR 反應(yīng)體系試劑用量如下：PCR Buffer（5×）5μL、MgCl2（25mmol/L）2.0μL、Taq DNA聚合酶（1U/μL）0.5μL、引物B1（10 μM/L）和B2（10 μM/L）各0.5μL、引物C1（10 μM/L）1μL、dNTPs 混合物（10 mM/L）0.5μL、模板 DNA（0.1 μg~1.0 μg）2μL、滅菌雙蒸水8μL。除按上述配制外，也可采用 PCR Mix試劑盒。加完試劑后瞬時離心混勻，將PCR反應(yīng)管均置于PCR儀內(nèi)，按下面反應(yīng)程序進行PCR反應(yīng)： 94℃，3min；然后進入94℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸45s的循環(huán)，共進行40個循環(huán)；72℃，10 min；4℃結(jié)束擴增。PCR 產(chǎn)物直接進行瓊脂糖凝膠電泳分析或置4℃保存?zhèn)溆谩? 6.4　 電泳 6.4.1　 1.5%瓊脂糖凝膠制備 制備方法見附錄 E。 6.4.2　 加樣 分別將樣品、陽性摻入對照、陰性摻入對照和陰性質(zhì)控對照的5μL PCR 產(chǎn)物與 1μL 6×DNA電泳上樣緩沖液混合均勻，加至瓊脂糖凝膠樣品孔中（如用含Loading dye 的PCR Mix試劑盒進行PCR反應(yīng)可直接上樣），同時設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) DNA 分子量對照。 6.4.3　 電泳條件 調(diào)整電泳儀至70V電泳約45min，直至溴酚藍指示劑到達離瓊脂糖凝膠末端 2cm～3cm 時停止。 7　 結(jié)果判定 將電泳后的瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察，與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量比較，只有陽性摻入對照、陰性摻入對照和陰性質(zhì)控對照結(jié)果正確時才能進行受檢樣品的結(jié)果判定，然后拍照保存。 如果樣品僅在220 bp位置出現(xiàn)水牛特異性條帶，判定為純水牛乳或純水牛乳制品。 如果樣品僅在346bp 位置出現(xiàn)牛屬特異性條帶或沒有條帶，則判為非水牛乳或非水牛乳制品。 如果樣品在 220bp位置出現(xiàn)水牛屬特異性條帶，且同時在346bp位置出現(xiàn)牛屬特異性條帶，則判為摻假水牛乳或摻假水牛乳制品。 注：檢測結(jié)果凝膠電泳圖見附錄B.2。 附　錄　A （規(guī)范性附錄） 水牛屬和牛屬特異性片段序列 A.1　 水牛屬特異性片段序列 CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCGATAGACCTCACCAATTCTTGCTAATGCAGTCTATATACCGCCATCTTCAGCGAACCCTAAAAAGGTACAAAAGTAAGCGCAATCACAACGCATAAAAACGTTAGGTCAAGGTGTAACCTATGAAATGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTACACCAAGAACACCCAACACGAAAGTTATTATGAAA A.2　 牛屬特異性片段序列 CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCGATAAACCTCACCAATTCTTGCTAATACAGTCTATATACCGCCATCTTCAGCAAACCCTAAAAAGGAAAAAAAGTAAGCGTAATTATGATACATAAAAACGTTAGGTCAAGGTGTAACCTATGAAATGGGAAGAAATGGGCTACATTCTCTACACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATTATGAAACCAATAACCAAAGGAGGATTTAGCAGTAAACTAAGAATAGAGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATGAAGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAATAGGATTCAGTGCATCTAACCCTATTTA 附　錄　B （規(guī)范性附錄） 特異性引物序列及檢測結(jié)果電泳圖示 B.1　 特異性引物序列 合成的特異性引物序列應(yīng)符合表 A.1 的要求。 表 A.1特異性引物序列 引物種類 引物名稱 特異性引物的核苷酸序列 片段長度 水牛特性引物 C1 5’-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3’ 220bp B1 5’-TTTCATAATAACTTTCGTGTTGGGTGT-3’ 牛屬特性引物 C1 5’-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3’ 346bp B2 5’-TAAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT-3’ B.2　 PCR 檢測結(jié)果電泳圖示 以水牛特異性引物和牛屬特異性引物進行雙重PCR的電泳圖 圖 A.21 PCR檢測結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖示 M、標(biāo)準(zhǔn) DNA 分子量（100 bp ladder DNA marker）； 1、陽性摻入對照； 2、純水牛乳或純水牛乳制品； 3和6、非水牛乳或非水牛乳制品； 4、摻假水牛乳或摻假水牛乳制品； 5、陰性摻入對照； 7、陰性質(zhì)控對照。 附　錄　C （規(guī)范性附錄） 試劑的配制 C.1　 1 mol/L PBS (pH 7.4) 的配制 1 mol/L PBS (pH 7.4) 按下列方法進行制備： —— 氯化鈉：8.0g； —— 氯化鉀：0.2g； —— 磷酸氫二鈉：1.42g； —— 磷酸二氫鉀：0.27g； —— 雙蒸水：定容至 1 000mL； 在 800 mL 雙蒸水中依次加入上述成分，用 1moL/L 鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水定容至1 000 mL，1.034×105 Pa 高壓滅菌 25 min。室溫保存。 C.2　 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 的配制 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 按下列方法進行配制： —— 二水乙二胺四乙酸二鈉 (EDTA-Na2·2H2O)：186.1 g； —— 氫氧化鈉：20.0 g； —— 雙蒸水：定容至1 000 mL； 在 800 mL 雙蒸水中加入 186.1g EDTA-Na2·2H2O，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0(約需 20.0 g 氫氧化鈉顆粒)，然后定容至 1 000 mL，分裝后 1.034×105 Pa 高壓滅菌 30 min。室溫保存。 C.3　 10% SDS 的配制 10% SDS 按下列方法進行配制： —— 十二烷基硫酸鈉 (SDS)：100.0g； —— 雙蒸水：定容至1 000 mL； 在 900 mL 雙蒸水中溶解 100.0 g 電泳級SDS，加熱至68 ℃助溶，用 1 moL/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1 000mL，分裝備用。室溫保存。 C.4　 20mg/mL 蛋白酶K的配制 20 mg/mL 蛋白酶K按下列方法進行配制： —— 蛋白酶K：200.0 mg； —— 雙蒸水：定容至10 mL； 將 200.0 mg 蛋白酶K加入9.5mL 的水中(為了減少變性，須加蛋白質(zhì)于水中，而非加水于蛋白質(zhì)中)，輕輕地搖動緊蓋的管子，直到蛋白酶K完全溶解為止。定容至終體積10 mL。用0.22 μm孔徑濾膜過濾除菌，分裝成小份于-20 ℃貯存。 C.5　 3 mol/L NaAc 的配制 3 mol/L NaAc 按下列方法進行配制： —— NaAc：257.5g； —— 雙蒸水：定容至1 000 mL； 在 800 mL 雙蒸水中加入 257.5g NaAc，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，調(diào)節(jié)溶液 pH 值至8.0，然后定容至1 000 mL，分裝后 1.034×105 Pa 高壓滅菌 30 min。室溫保存。 C.6　 TE 的配制 TE 按下列方法進行配制： —— 100 mmol/L Tris-Cl PH 7.6； —— 10 mmol/L EDTA pH 8.0； 分裝后 1.034×105 Pa 高壓滅菌 30 min。室溫保存。 C.7　 100mmol/L Tris-Cl pH7.6的配制 100mmol/L Tris-Cl pH7.6按下列方法進行配制： —— Tris堿：12.11 g； —— 雙蒸水：定容至 100 mL； 在 80 ml 雙蒸水中加入 12.11g Tris 堿，待溶液冷至室溫后，加入濃鹽酸調(diào) PH 值至7.6，然后定 容至 100 ml，分裝后 1.034×105 Pa 高壓滅菌 30min。室溫保存。 C.8　 Tris-硼酸電泳緩沖液的配制 C.8.1　 5 倍Tris-硼酸電泳緩沖液的配制 5 倍 Tris-硼酸電泳緩沖液按下列方法進行配制： —— Tris：54.0g； —— 硼酸：27.5g； —— 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)：20 mL； —— 雙蒸水：定容至 1 000mL。室溫保存。 C.8.2　 1 倍 Tris-硼酸電泳緩沖液的配制 1 倍 Tris-硼酸電泳緩沖液按下列方法進行配制： —— 5倍 Tris-硼酸電泳緩沖液：100 mL； —— 雙蒸水：400 mL。室溫保存。 附　錄　D （規(guī)范性附錄） 用酚-氯仿-異戊醇法提取DNA的步驟 D.1　 樣品的收集按照6.1； D.2　 根據(jù)最終離心獲得的沉淀量，每200mg沉淀量加入1mL的消化緩沖液，同時加入蛋白酶K至終濃度為100μg/mL,輕柔混勻后置于60℃水浴120min，不時旋轉(zhuǎn)粘滯的溶液； 注：在提取酸奶和干酪DNA的過程中，如果使用蛋白酶K消化后，所得溶液比較渾濁的話，再次添加相同量的蛋白酶K，并延長一倍的孵化時間，以確保蛋白消化完全。 D.3　 冷卻至室溫，2500rpm/mim離心5min后取1000μL上清液到一新的2mL EP管中，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（苯酚：氯仿：異戊醇=25：24：1），充分混勻，室溫靜置10min，12000rpm/min，離心15min； D.4　 取800μL上清液到一新的2mL EP管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（氯仿：異戊醇=24：1），充分混勻，室溫靜置3min，12000rpm/min，離心10min； D.5　 取700μL的上清于一新的1.5mL EP管中，加0.7倍體積的異丙醇和1/10體積的3 mol/L NaAc，充分混勻后置于-20℃沉淀DNA半小時以上； D.6　 12000rpm/min，4℃離心15min收集沉淀，小心傾去上清后加入1mL的75%乙醇洗滌沉淀2次； D.7　 室溫下晾干沉淀后加入適量的TE溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩? 附　錄　E （規(guī)范性附錄） 1.5% 瓊脂糖凝膠的制備 E.1　 將凝膠托架兩端用膠帶封閉并水平放置在工作臺上，放上梳子，使梳齒下沿距托架板 0.5mm～ 1.0mm。 E.2　 配制足夠量的凝膠：稱取 1.5g 瓊脂糖于三角瓶中，加入100mL 1 倍Tris-硼酸電泳緩沖液，加熱溶解瓊脂糖。 E.3　 待瓊脂糖溶液冷至 50 ℃ 時，加入核酸染料GelRed 10μL，充分混合(避免起泡)。將膠液沿托架膠板邊緩慢連續(xù)注入，讓膠液自由流向各方，凝膠厚度控制在3mm～5mm之間。待凝膠完全凝固后，撤去兩端膠帶。 E.4　 將托架放入電泳槽中，加入 1倍 Tris-硼酸電泳緩沖液，使之浸過膠面 2 mm，拔出梳子，以備加樣電泳待瓊脂糖溶液冷至 50 ℃ 時，加入核酸染料GelRed 10μL，充分混合(避免起泡)。將膠液沿托架膠板邊緩慢連續(xù)注入，讓膠液自由流向各方，凝膠厚度控制在3mm～5mm之間。待凝膠完全凝固后，撤去兩端膠帶。 E.5　 將托架放入電泳槽中，加入 1倍 Tris-硼酸電泳緩沖液，使之浸過膠面 2 mm，拔出梳子，以備加樣電泳。 E.6