酶快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第一章

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1、酶快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué),Kinetics of Fast Enzyme Reaction,第一章 緒論,Introduction to Enzyme Kinetics,酶反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)和瞬變動(dòng)力學(xué) 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是解釋酶反應(yīng)機(jī)制具有代表性的方法。酶動(dòng)力學(xué)包括 兩個(gè)方面，即酶的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)（Steady-state kinetics）和預(yù)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué) （Pre-steady state kinetics），后者也叫瞬變動(dòng)力學(xué)（Transient kinetics）。 酶的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)的基本目標(biāo)是對(duì)酶催化的總反應(yīng)進(jìn)行測(cè)量與分析， 只涉及底物與產(chǎn)物，而不考察酶分子本身。 預(yù)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)可以直接研究總反應(yīng)

2、中所包含的分步反應(yīng)。研究者的 興趣所在是酶分子本身所發(fā)生的變化或能夠反映這種變化的變化上。 兩種動(dòng)力學(xué)方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)由于所要求酶制劑用量 少，且不需要使用特殊的儀器設(shè)備，因而長久以來獲得了廣泛的應(yīng)用。 這種方法的缺點(diǎn)在于研究人員所獲得的信息是間接的，有時(shí)也是不確切 的。預(yù)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)由于測(cè)量快速反應(yīng)，而需要特殊的儀器設(shè)備（例如， 停流裝置）。它的優(yōu)點(diǎn)是可以提供用來解釋復(fù)雜反應(yīng)機(jī)制的信息。應(yīng)該 指出，兩種方法是相輔相成的，對(duì)于研究酶反應(yīng)來說都很重要。,從二十世紀(jì)60年代起，測(cè)量快速反應(yīng)的技術(shù)發(fā)展很快，性能越來越好的 測(cè)量快速反應(yīng)的裝置（如，停流分光光度計(jì)等）被不斷推出，這給研究

3、酶反應(yīng)的瞬變動(dòng)力學(xué)提供了很大的方便。 第一節(jié) 研究酶反應(yīng)的歷史 一. Henri 的工作 Henri 在1902年發(fā)表了一篇論文。他首次引入了一個(gè)十分重要的概 念，既酶與底物符合物的概念，并把它用到速度方程的推導(dǎo)中。隨后， 他討論和闡述了重要的酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征，涉及到三種酶反應(yīng)： 1. 蔗糖轉(zhuǎn)化酶(Invertase) 催化蔗糖的轉(zhuǎn)化； 2. 淀粉酶(Amylase)催化糊精的水解； 3. 苦杏仁酶(Emulsin)催化水楊苷的水解。 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸納成如下幾個(gè)要點(diǎn)： 1. 當(dāng)?shù)孜餄舛鹊蜁r(shí)，酶催化的水解速度隨底物濃度的增加而增加；,當(dāng)?shù)孜餄舛雀邥r(shí)， 水解速度保持恒定。 2. 反應(yīng)速

4、度與酶濃度成正比； 3. 產(chǎn)物的加入引起反應(yīng)速度的減少，在低底物濃度時(shí)，減少尤明 顯。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以用下面兩種反應(yīng)機(jī)制解釋, 機(jī)制 I: (1.1.1) (1.1.2) 機(jī)制 II: (1.1.3) (1.1.4),如果考慮產(chǎn)物與酶結(jié)合生成EP，那么要把下述平衡包括到上述每 一個(gè)機(jī)制中去， (

5、1.1.5) 在上述兩種機(jī)制中，ES符合物的形成是共同的， 然而所起的作用 卻是完全不同的。在機(jī)制 I 中，產(chǎn)物的形成是通過一個(gè)雙分子過程（1. 1.2式），即酶與底物的碰撞。在此種情況下，ES符合物是無意義的， 它通過減少E濃度而降低產(chǎn)物的形成速度。另一方面，在機(jī)制 II中， ES 是至關(guān)重要的符合物，經(jīng)過一個(gè)單分子過程（1.1.4式），ES復(fù)合物形成 產(chǎn)物。 下面要推導(dǎo)出能同時(shí)滿足上述兩種機(jī)制的速度方程。當(dāng)考慮EP復(fù) 合物的形成時(shí)，酶以三種形式存在： E, ES 和 EP。 因此，酶的總濃度為 e0 = E0 = E + ES

6、 + EP (1.1.6) 假定在酶反應(yīng)中，下述平衡迅速建立起來,應(yīng)用質(zhì)量作用定律， 有,(1.1.7),(1.1.8),其中，m和n 為平衡常數(shù)， x為底物在時(shí)間t時(shí)的濃度，那么， S=a-x， 這里a為底物起始濃度。P=x, 這是兩個(gè)可以測(cè)量的量。 式1.1.6,1.1.7和1.1.8 組成一個(gè)聯(lián)立方程組， 含有三個(gè)未知量。 E和ES的表達(dá)式為，,(1.1.9),(1.1.10),利用1.1.9和1.1.10式，產(chǎn)物P生成的速度方程可以推倒如下， 對(duì)于機(jī)制 I, P通過一個(gè)雙分子過程形成，產(chǎn)物的生成速度為(下面式子應(yīng)為k+1) 對(duì)于機(jī)制 II，

7、 產(chǎn)物以單分子過程形成(1.1.4式) ，產(chǎn)物的生成速度 為： (1.1.11)和(1.1.12)式僅差一個(gè)常數(shù)。 為簡化起見，只考慮反應(yīng)的初相，可忽略產(chǎn)物的形成，因而 P=x 可以略去。 在t=0時(shí)，初始速度為 ，初始底物濃度為s0，ES解離常數(shù)為Ks=1/m,,(1.1.11),(1.1.12),那么，我們可以把(1.1.11)和(1.1.12)式簡化成如下形式， 其中，k0為比例常數(shù)，具有sec-1因次。 對(duì)機(jī)制 I ： k0 = Ks 為E和S間雙分子反應(yīng)速度常數(shù)； Ks為ES復(fù)合物解離常數(shù)。 值得注意的是Henri機(jī)制II（1.1.3和1.1.4

8、式）和速度方程1.1.13式與著名 的Michaelis-Menden 機(jī)制和米氏方程相同。Henri是第一個(gè)得到為人熟 知的速度方程的人。 Henri 工作的特點(diǎn)： 由不同的反應(yīng)機(jī)制出發(fā)得到了形式相同的速度 方程。換句話說，機(jī)制 I 和機(jī)制 II 不能用這里討論的動(dòng)力學(xué)方法加以區(qū) 別，因?yàn)槲覀儫o法估計(jì)速度方程中經(jīng)過推導(dǎo)而演繹出的常數(shù)。這說明了 動(dòng)力學(xué)方法的固有的限制，盡管兩種機(jī)制可以借助于不同的動(dòng)力學(xué)技術(shù) 加以區(qū)別。,(1.1.13),二. Michaelis and Menten 的工作 1913年Michaelis and Menten 重新做了蔗糖反應(yīng)轉(zhuǎn)化酶催化的蔗 糖水解反

9、應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。他們改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)條件，克服了Henri實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)，采 取了如下的措施： 1. 控制水溶液的pH，使用了pH4.5的醋酸buffer; 2. 考慮了產(chǎn)物的變旋影響，使用NaOH終止反應(yīng)，加速產(chǎn)物的變旋作 用。 典型的實(shí)驗(yàn)曲線如Fig.1.1.1所示，,Fig.1.1.1蔗糖反應(yīng)轉(zhuǎn)化酶催化的蔗 糖水解反應(yīng)的時(shí)間過程 最大底物濃度為0.333M; 最小底物濃度為0.0052M; 曲線1,2,3,.代表不同的底物濃度； : 產(chǎn)物完成變旋后反應(yīng)混合物旋光度 的變化。 產(chǎn)物：Glucose and fructose.。,Henri在他的實(shí)驗(yàn)中測(cè)量的是反應(yīng)速度常數(shù)，而Michaelis and

10、 Meten 建議利用反應(yīng)初速度作為反應(yīng)速度的一種測(cè)量。測(cè)量反應(yīng)初速度的優(yōu)點(diǎn) 在于可以消除產(chǎn)物可能產(chǎn)生的抑制作用以及在反應(yīng)進(jìn)行期間酶的鈍化。 基于與Henri 機(jī)制 II相同的圖示， （ 1.1.14) M-Menten 利用與Henri使用的基本相同的方法得到了一個(gè)速度方程。推 導(dǎo)如下： 假定E和S的結(jié)合是處于快速平衡，即 則ES的解離常數(shù) （ 1.1.15),由物種守恒，有 e0 E0 = E + ES （ 1.1.16) 因只考慮反應(yīng)初速度，固EP項(xiàng)可漏掉， 反應(yīng)速度

11、（初速度）為 = k+2 ES （1.1.17) 由1.1.15- 1.1.17式，有 （1.1.18) 其中 V=k+2 e0 為最大反應(yīng)速度。與Henri 機(jī)制 II 比較，k0= k+2, 則 （1.1.18)式與(1.1.13)式相同。 1.1.18式就是Henri, Michaelis 和menten 推導(dǎo) 出的第一個(gè)討論酶反應(yīng)的速度方程。 快速平衡法的基本假定是下述平衡,迅速地建立起來，以致于ES E + P 并不影響這一平衡。而由ES到 產(chǎn)物生成這一步是反應(yīng)的限速步驟。解離常數(shù)Ks的倒數(shù)可以作為酶對(duì)底 物的一

12、種測(cè)量。 然而，應(yīng)該指出，快速平衡法的基本假定有時(shí)不能成立，因?yàn)橛械?反應(yīng) E + S ES是不成立的。后來，穩(wěn)臺(tái)法對(duì)這一點(diǎn)做了改進(jìn)。 三. Brigg 和Haldane的工作 在H-M-M法中，假定 中的k-1k+2 ，這是一種特殊的限制。1925年 Brigg 和Haldane對(duì)-M- M法做了改進(jìn)，他們?cè)谕茖?dǎo)速度方程時(shí)把 k-1k+2這一假定取消了。他們 的方法就是現(xiàn)在大家熟知的穩(wěn)態(tài)法或稱為穩(wěn)態(tài)近似。 在酶反應(yīng)的過程中，中間產(chǎn)物ES一直穩(wěn)定存在。ES的濃度變化可 用下式表示 dES/dt = k+1ES ( k-1 + k+2 )ES (1.1. 19),,,在反

13、應(yīng)剛開始時(shí)，我們可以近似地認(rèn)為反應(yīng)速度= k+2 ES 是不變的， 因?yàn)镋S也不變。換句話說， dES/dt 與反應(yīng)的總速度比較起來可以忽 略不計(jì)。 故有 dES/dt=0 則1.1. 19式變成 k+1ES ( k-1 + k+2 )ES = 0 （1.1.20) 這個(gè)式子代替了迅速平衡法中的1.1.15式(Ks=ES/ES)。 利用物種守恒 e0 = E0 = E + ES （1.1.21) 由（1.1.20) 和（1.1.21)式得到ES復(fù)合物表達(dá)式 （1.1.22) 將（1.1.22) 代入速度方程

14、= k+2 ES, 則 （1.1.23),在該法中唯一的假定是dES/dt = 0, 取消了快速平衡法中的兩個(gè)假定 這意味著穩(wěn)態(tài)法較快速平衡法優(yōu)越。容易看出（1.1.18)式為（1.1.23) 式 的特例，即當(dāng)k-1 k+2 時(shí)， （1.1.23) 式變成了（1.1.18)式。 第二節(jié) 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方法 一. 速度參數(shù)(Rate parameters) 由H-M-M 酶反應(yīng)機(jī)制 導(dǎo)出的速度方程有下面的形式,快速平衡,限速步驟,(1.2.1),其中和是常數(shù)。 這個(gè)方程預(yù)示著： 1. 在底物濃度不變的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比； 2.

15、 在底物濃度低時(shí)，s ，反應(yīng)速度達(dá)到一常量e0 。 反應(yīng)速度與酶濃度的關(guān)系，以及與底物濃度的關(guān)系如1.2.1和1.2.2所示，,Fig. 1.2.1 反應(yīng)初速度與酶的 總濃度的關(guān)系,Fig.1.2.2 反應(yīng)初速度與底物濃度 關(guān)系,如果定義兩個(gè)變量x和y， x = + s y = e0 （1.2.2) 那么，(1.2.1)式可以變成如下形式， xy = e0 這是矩形雙曲線，極值為 V = e0 與e0 呈正比。 常數(shù)為當(dāng)= V時(shí)，所對(duì)應(yīng)的底物濃度，成為Michaelis 常數(shù)， 用Km值表示。 = V/ e0 表示單位時(shí)

16、間內(nèi)一個(gè)酶分子可以轉(zhuǎn)化的底物分 子數(shù)，稱為分子活力（Molecular activity), 用k0 表示。 對(duì)于寡聚酶來說，常使用催化中心活力的術(shù)語，即單位時(shí)間內(nèi)酶分 子中每個(gè)催化中心所能轉(zhuǎn)化的底物分子數(shù)，用kcat（Catalytic center Activity) 表示。Kcat = k0 / n 。有時(shí)，把分子活力或催化中心活力叫轉(zhuǎn)化 數(shù)（turnover number)。 這些在實(shí)驗(yàn)上可以測(cè)得的參數(shù)是進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析的基本常數(shù)，通常成 為速度參數(shù)或動(dòng)力學(xué)常數(shù)，包括 Km, k0 (or kcat)。,現(xiàn)在，我們用Km , V, k0(or kcat)代替速度方程 中的和，那么速度

17、方程有如下形式 （1.2.3) 對(duì)大多數(shù)酶反應(yīng)來說，速度方程有如（1.2.3) 式的形式，但也有例外， 變構(gòu)酶，反應(yīng)速度對(duì)底物濃度關(guān)系為s型曲線，而非雙曲線。 應(yīng)該指出，在實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的速度參數(shù)或動(dòng)力學(xué)常數(shù)是表觀的，它們 的真實(shí)物理意義并不清楚。僅當(dāng)我們把經(jīng)驗(yàn)的速 度方程（empirical Rate equation) 與由假定的機(jī)制推導(dǎo)的力學(xué)方程（mechanistic rate Equation)相比較時(shí)，這些參數(shù)如Km 和 k0（empirical constants)，它們 的物理意義才清楚：,empirical rate equation

18、 （1.1.18) 由快速平衡法推導(dǎo)的方程 （1.2.3) k0 = k=2 是ES復(fù)合物分解成產(chǎn)物的速度常數(shù)； Km = Ks是ES復(fù)合物解l離常數(shù)。 比較（1.1.18) 和（1.1.23)兩式， empirical rate equation （1.1.18) 由穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)的方程 （1.1.23),則 有所不同，不在是ES的解離常數(shù)。 因此，速度參數(shù)的物理意義不僅取決于反應(yīng)機(jī)制，也取決于推導(dǎo) 速度方程的方法。換句話說，要說明速度參數(shù)的物理意義，必須知道 反應(yīng)機(jī)制；

19、反過來，速度參數(shù)也可以對(duì)了解反應(yīng)機(jī)制提供某些線索。 例如，當(dāng)我們把Km解釋成ES的解離常數(shù)（Ks)時(shí)，并把k0看成ES 分解為產(chǎn)物的速度常數(shù)k+2，那么暗示，反應(yīng)符合H-M-M機(jī)制， 而且，k+2<< k-1。 二. 速度參數(shù)的測(cè)定 通過重排（1.1.18) 式,可以得到三種不同形式的速度方程，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以求出Km 和Vmax 。 其中，涉及三種作圖法，即 1. Lineweaver- Burk作圖法（或雙倒數(shù)作圖法）； 2. Woolf 或Hofstee作圖法; 3. Eadie作圖法。 利用這些作圖法可以檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論曲線（=Vs/(Km+s))的情況 （見Fig. 1.

20、2.1)。,Fig. 1.2.1 三種作圖法實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù)與理論曲線擬合情況 Lineweaver- Burk作圖法; (b) Woolf 或Hofstee作圖法; (c) Eadie作圖法。,各種作圖法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。不過，從統(tǒng)計(jì)學(xué)觀點(diǎn)（點(diǎn)的分布）來看 S/對(duì)s圖是三種作圖法中最好的一種，但 人們已習(xí)慣用雙倒數(shù) 作圖法。 三. 進(jìn)行酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究的基本程序和步驟 在文獻(xiàn)中，已經(jīng)發(fā)表了不少從各類酶反應(yīng)機(jī)制推導(dǎo)出的速度方程， 但不少人可能不太熟悉推導(dǎo)這些方程的基本程序和步驟。 1. 推導(dǎo)速度方程的基本程序 首先，寫出代表一個(gè)反應(yīng)的機(jī)制的示意圖 如 然后，由示意圖出發(fā)推導(dǎo)速度方程。速度方程

21、應(yīng)包括物質(zhì)濃度（ 如e0和s）和速度常數(shù)。在速度方程中，反應(yīng)速度是對(duì)其產(chǎn)生影響的物 質(zhì)濃度和速度常數(shù)的函數(shù)。 e0和s是實(shí)驗(yàn)中可測(cè)量的量。通常，在速度 方程中，不包括游離酶的濃度，因其在實(shí)驗(yàn)中不易測(cè)得到。,2. 影響酶反應(yīng)速度的物質(zhì) （1）催化劑（酶），反應(yīng)后復(fù)原； （2）底物和產(chǎn)物，經(jīng)歷化學(xué)變化； （3）效應(yīng)劑，能與酶分子按計(jì)量結(jié)合，而又不發(fā)生任何化學(xué)變化 來影響反應(yīng)速度。 3. 在文章中如何討論酶反應(yīng)機(jī)制 如果所提出的一種酶反應(yīng)機(jī)制不能解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果的話，那么可以說 所提出的反應(yīng)機(jī)制是不正確的。另一方面，應(yīng)該注意，即使由某一機(jī)制 推導(dǎo)的速度方程與實(shí)驗(yàn)上得到的數(shù)據(jù)相符，也不能肯

22、定地說這一機(jī)制是 正確的。例如Henri 機(jī)制 I 盡管由它推導(dǎo)的速度方程在形式上與由Henri 機(jī)制 II推導(dǎo)出的一樣，也不能說Henri 機(jī)制 I 是正確的。除非我們能夠證 明沒有任何其他機(jī)制可以解釋實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，否則我們還是不能說，這個(gè)機(jī) 制就是正確的。在處理動(dòng)力學(xué)文章中，常常看到如下說法“結(jié)果與機(jī)制相 符”，“結(jié)果與機(jī)制相符”，“ 結(jié)果可以根據(jù)這一機(jī)制來解釋。” “ 解釋 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最小可能機(jī)制是”等。,如上所說，解釋某一反應(yīng)機(jī)制的酶動(dòng)力學(xué)的基本方法之一是研究底 物，酶和效應(yīng)劑濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響。因此，濃度因子是影響酶反應(yīng) 速度的因素之一。研究濃度的影響可以使我們check由假定的反應(yīng)機(jī)

23、制導(dǎo) 出的速度方程的可靠性，可以使我們examine假定的反應(yīng)機(jī)制是否可以 解釋由實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響，也可以使我們evaluate速 度參數(shù)。進(jìn)一步由假定的機(jī)制賦予速度參數(shù)某種物理意義?？疾煲种苿?或激活劑的濃度影響，可以確定它們的抑制或活化機(jī)制，計(jì)算酶-效應(yīng)劑 復(fù)合物的解離常數(shù)。一般來說，人們也把抑制常數(shù)（ki)或活化常數(shù)（ka) 也稱為速度參數(shù)。 4. 影響速度參數(shù)的因素 一般來說，速度參數(shù)（表觀的）是指反應(yīng)機(jī)制示意圖中涉及的基本過 程速度常數(shù)的結(jié)合。因此，由濃度因素的研究得到的速度參數(shù)受下面兩 個(gè)因素的影響： （1）外部的或環(huán)境的因素：溫度、壓力、介質(zhì)的物理性質(zhì)，如溶

24、劑 的介電常數(shù)、離子強(qiáng)度和黏度等。,（2）內(nèi)部結(jié)構(gòu)因子：a. 底物與效應(yīng)劑的分子結(jié)構(gòu)；b.酶分子結(jié) 構(gòu)， 包括化學(xué)結(jié)構(gòu)、構(gòu)象（受溫度、壓力、pH和變性劑的影響），和 物理狀態(tài)（如，固定化）。 概括起來說，影響酶反應(yīng)速度的因素有三類： 濃度因素； 外部因素（環(huán)境因素）； 內(nèi)部因素（結(jié)構(gòu)因素）。 5. 進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究的基本程序 下面的框圖歸納了進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)研究的基本程序：,Fig. 1.2.2進(jìn)行酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究的基本程序示意圖,第三節(jié) 酶反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)和瞬變動(dòng)力學(xué) 一. 酶反應(yīng)的瞬變相 符合Henri-Michaelis-Menten機(jī)制的酶反應(yīng)是最簡單 的酶反應(yīng)，可以用1.

25、3.1式來表示， (1.3.1) 這是一個(gè)單底物，不可逆反應(yīng)。,根據(jù)酶反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)近似，在酶反應(yīng)過程中，中間產(chǎn)物ES復(fù) 合物一直穩(wěn)定存在。ES的濃度變化速率可以用1.3.2式表示， 其中 = ES， e =E， s = S。在酶反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)階段，dx/dt = 0。 dx/dt = k+1es (k -1 + k+2) (1.3.2) 我們現(xiàn)在感興趣的是在E和S混合后，達(dá)到穩(wěn)態(tài)前的過程。為此必須 解出微分方程1.3.2 式，以便討論ES復(fù)合物形成與分解的時(shí)間過程。 酶與底物物種守衡要求 e0 = e + （1.3.

26、3） s0 = s ++ p (1.3.4) 產(chǎn)物的時(shí)間過程可以用下面的微分方程表示， dp/dt = k+2 （1.3.5） 由1.3.2式, 1.3.3-1.3.5式原則上至少可以得到表示e，，s 和 p的時(shí)間過程表達(dá)式。,作為一種定性的討論，我們做如下處理： 當(dāng)?shù)孜餄舛缺让笣舛却筮^量時(shí)，即 e0e0 )，至少在反應(yīng)剛開始時(shí)， p<

27、0 + （k -1 + k+2） = a - k 其中， a = k+1e0s0 (1.3.7) k = k -1s0 +（k -1 + k+2） (1.3.8) 解出微分方程11.6式, = (a/k)(1 - e - k t ) (1.3.9) 1.3.9式表示ES復(fù)合物的時(shí)間過程, 如Fig.1.3.1所示。,Fig.1.3.1 酶-底物復(fù)合物ES的時(shí)間過程 曲線A代表S濃度不變的情況；曲線B代表真實(shí)情況,曲線A表示ES復(fù)合物從零時(shí)以一級(jí)反應(yīng)（指數(shù)曲線）增加。當(dāng)t 1/k

28、(因?yàn)閑-kt<< 1)時(shí)，ES增至平臺(tái)值（a/k）。 在平臺(tái)處，ES 的形成速度 f = k+1es，等于它的分解速度b =（k -1 + k+2）。此時(shí)， d/dt = 0， 這是ES的穩(wěn)態(tài)。穩(wěn)態(tài)前的那一相，可以近似為一級(jí)過程，稱為預(yù)穩(wěn)態(tài)。 曲線B表示反應(yīng)的真實(shí)情況。在上述處理中，我們假定底物濃度在反應(yīng) 過程中不變。,二. 產(chǎn)物形成的時(shí)間過程 對(duì)1.3.5式積分，得到P = t0 k+2dt。產(chǎn)物的時(shí)間過程示于Fig. 1.3.2中。圖中的曲線A和B 分別代表當(dāng)S=常數(shù)和S隨時(shí)間減少的產(chǎn)物 時(shí)間過程。Fig.1.3.2中反應(yīng)初相的遲滯部分相應(yīng)于ES的預(yù)穩(wěn)態(tài)。遲滯 相的出現(xiàn)反映了主要中間

29、體ES復(fù)合物的形成，即在酶分子上發(fā)生的變化。,Fig. 1.3.2 產(chǎn)物P的時(shí)間過程,如果產(chǎn)物的形成不是經(jīng)過ES復(fù)合物，而是經(jīng)過E和S雙分子碰撞，情 況會(huì)如何呢？我們從下述機(jī)制出發(fā)進(jìn)行討論， 產(chǎn)物的微分方程有如下形式， （1.3.12） 對(duì)1.3.12 式積分后得到的產(chǎn)物濃度時(shí)間關(guān)系用圖1.3.3表示。從圖中的曲 線可以看出，反應(yīng)初相有一個(gè)“爆發(fā)”(曲線I )，而不是遲滯（曲線II）。原 因在于，根據(jù)這一機(jī)制，產(chǎn)物形成的最大速度應(yīng)是E最大時(shí)，即反應(yīng)剛 開始時(shí)，因而觀察到一個(gè)“爆發(fā)”。 上述例子清楚

30、地說明預(yù)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)如何可以區(qū)別導(dǎo)致相同穩(wěn)態(tài)動(dòng)力 學(xué)的不同機(jī)制。,Fig.1.3.3 產(chǎn)物在預(yù)穩(wěn)態(tài)的時(shí)間過程與反應(yīng)機(jī)制相關(guān),三. 非穩(wěn)態(tài)（Non-Steady-State) 如果Soe0 條件不成立，那么情況如何呢？Chance研究了過氧化 物酶的預(yù)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)。在e0和S0濃度數(shù)量級(jí)相同時(shí)，微分方程1.3.13 和1.3.14 dx/dt = k+1 e s ( k1 _+ k+2)x ( 1.3.13) dp/dt = k+2 x ( 1.3.14) 不能解析解出。這些方程的模擬解(analog)或數(shù)字解給出EX = x 和 p = p 的時(shí)間

31、過程。,Fig. 1.3.4過氧化物酶催化的反應(yīng)曲線(Stopped-flow),ES/uM,P/uM,很明顯，由Fig. 1.3.4 看不到反映ES形成的平臺(tái)。換句話說， ES穩(wěn) 態(tài)不再明顯出現(xiàn)。這種狀態(tài)被稱為非穩(wěn)態(tài)。預(yù)穩(wěn)態(tài)和非穩(wěn)態(tài)通常稱為酶 反應(yīng)的瞬變相。 四. 瞬變相出現(xiàn)的時(shí)間范圍 由 式= (a/k)(1 - e-kt)可以估計(jì)預(yù)穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)的時(shí)間。假如ES達(dá) 到它終值的90%，那么所需的時(shí)間t0.9 可以由下面的推導(dǎo)而獲得。 當(dāng) t= t0.9時(shí), 有=0.9 (a/k)=a/k(1 - e-kt) 整理上式，把t寫成有t0.9，則有 t0.9 = ln10/k =

32、 2.303/k = 2.303/k+1s0 +(k-1+k+2) < 2.303/k+2 = 2.303/k0 < 1 sec,k0為分子活力, 在100到107sec-1之間，因而t0.9在秒到微秒之間。這說明 如此快的反應(yīng)需要特殊技術(shù)來測(cè)量。酶反應(yīng)瞬變相的觀察要求很高的探 測(cè)靈敏度和適當(dāng)?shù)拿笣舛纫约翱焖俜磻?yīng)測(cè)量技術(shù)。在穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)中使用 的酶濃度范圍為10-5-10-10mol/L，但這個(gè)濃度對(duì)瞬變動(dòng)力學(xué)來說太低了， 通常要求10-4-10-6mol/L。 五. 酶穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)的限制 酶穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)比較適合研究多底物酶反應(yīng)，在這方面Cle

33、land早在 1963 年就總結(jié)了基于濃度因子的動(dòng)力學(xué)方法。對(duì)于雙底物雙產(chǎn)物的可逆 反應(yīng)已經(jīng)提出四種反應(yīng)機(jī)制：有序雙雙，Theorell-Chance，無序雙雙和 乒乓機(jī)制。由于四種機(jī)制給出四種形式不同的速度方程，因此從動(dòng)力學(xué) 上可以區(qū)別。表1.3.1列出了由上述四種機(jī)制推導(dǎo)的速度方程中分母的函 數(shù)形式。,表1.3.1雙雙機(jī)制速度方程分母的函數(shù)形式,盡管穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)對(duì)于區(qū)別多底物酶反應(yīng)是有用的工具，使我們知道哪種 底物先結(jié)合到酶分子上，哪種產(chǎn)物先從酶分子上解離下來。然而，對(duì)穩(wěn)態(tài) 動(dòng)力學(xué)來說有一個(gè)明顯的限制。例如，在有序雙雙機(jī)制中，,括弧里的過程 表示在酶的活性部位，底物分子被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。從化學(xué)意義上說，這很 重要。Cleland 把這種過程叫作中心復(fù)合物“異構(gòu)化”過程。穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)無 法把下面的多步機(jī)制 與一步機(jī)制 無法區(qū)別開。它只能處理由這些反應(yīng)機(jī)制出發(fā)得到的總的速度方程。 顯然，直接研究總反應(yīng)的基本階段可以消除這種限制。瞬變動(dòng)力學(xué)的 基本目標(biāo)就是觀察發(fā)生在酶分子上的變化，弄清反應(yīng)的基本步驟。這是 瞬變動(dòng)力學(xué)的重要性所在。測(cè)定溶液中快速反應(yīng)的技術(shù)對(duì)瞬變動(dòng)力學(xué)來說是重要的，因?yàn)榭偡磻?yīng)中的基本階段通常僅發(fā)生在幾秒鐘內(nèi)。利用停 流或溫度跳躍（Temperature jump）裝置可以測(cè)量如此快的反應(yīng)。,