質(zhì)粒DNA的提取和瓊脂糖凝膠電泳.doc

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化工專業(yè)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)名稱 質(zhì)粒DNA的提取與瓊脂糖凝膠電泳 班級(jí) 化21 姓名 張騰 學(xué)號(hào) 2012011864 成績(jī) 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 2014.12.26 同組成員 王乙汀、陳秉倫、梁有向 1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? （1）掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法 （2）掌握瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定DNA的原理和方法。 2 實(shí)驗(yàn)原理 2.1質(zhì)粒 質(zhì)粒（plasmid）是在細(xì)菌中以獨(dú)立于染色體之外的方式存在，是細(xì)菌染色體外的小型雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制子。理論上講，所有的細(xì)菌株系都含有質(zhì)粒，有些質(zhì)粒攜帶有幫助其自身從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)入另一個(gè)細(xì)胞的信息，即F質(zhì)粒，有些則表達(dá)對(duì)一種抗生素的抗性，即R質(zhì)粒，還有一些攜帶的是參與或控制一些不同尋常的代謝途徑的基因即降解質(zhì)粒。質(zhì)粒的大小不定，小的不到1kb，大的超過500kb，每個(gè)質(zhì)粒都有一段DNA復(fù)制起始點(diǎn)的序列，它幫助質(zhì)粒DNA在宿主細(xì)胞中復(fù)制。對(duì)細(xì)菌的某些代謝活動(dòng)和耐藥性表型具有一定的作用。目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細(xì)菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子(簡(jiǎn)稱cccDNA)。細(xì)菌質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量一般較小，約為細(xì)菌染色體的0.5%～3%。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類：較大一類的相對(duì)分子質(zhì)量是40×106以上，較小一類的相對(duì)分子質(zhì)量是10×106以下(少數(shù)質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量介于兩者之間)。每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。按照復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有1～2個(gè)質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有20個(gè)左右質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時(shí)和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)粒可以集多種有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點(diǎn)、抗生素耐藥性等。常用的人工質(zhì)粒運(yùn)載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環(huán)素基因(Tcr)和抗氨芐青霉素基因(Apr)，并含有5種內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)。如果將DNA片段插入EcoRI切點(diǎn)，不會(huì)影響兩個(gè)抗生素基因的表達(dá)。但是如果將DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切點(diǎn)，就會(huì)使抗四環(huán)素基因失活。這時(shí)，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細(xì)菌抗氨芐青霉素，但對(duì)四環(huán)素敏感。沒有DNA插入片段的pBR322會(huì)使宿主細(xì)菌既抗氨芐青霉素又抗四環(huán)素，而沒有pBR322質(zhì)粒的細(xì)菌將對(duì)氨芐青霉素和四環(huán)素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒有抗氨芐青霉素基因和PstI切點(diǎn)。質(zhì)粒運(yùn)載體的最大插入片段約為10 kb(kb表示為千堿基對(duì))。 圖1. 質(zhì)粒作為載體在基因工程中的應(yīng)用 應(yīng)用質(zhì)粒作為基因克隆的載體分子，攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)，一個(gè)重要前提條件是要獲得批量純化的質(zhì)粒DNA分子。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個(gè)主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解。在質(zhì)粒DNA的分離和純化過程中，毫無疑問，宿主細(xì)胞的裂解是分離質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)操作的關(guān)鍵步驟。常用的質(zhì)粒DNA分離方法有3種：堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法。前兩種方法比較劇烈，它們可以破壞堿基配對(duì)，使宿主細(xì)胞的線性染色體DNA變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA由于拓?fù)淅p繞，兩條鏈不會(huì)互相分離。當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，質(zhì)粒的DNA雙鏈又迅速恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，其大小范圍在1KB至200kb以上不等。所以，質(zhì)粒DNA提取與純化是最基本的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其中，堿裂解法提取的質(zhì)粒產(chǎn)量高、純度好，是一種最為常用的方法。 2.2堿裂解法 堿裂解法提取質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)原理是在pH 12.0 ~ 12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，收集上清即可得到富集的質(zhì)粒DNA。 近年來，隨著基因治療和DNA疫苗的發(fā)展，質(zhì)粒逐漸成為一種新型的生物大分子醫(yī)藥產(chǎn)品，藥用質(zhì)粒的大規(guī)模制備成為生物下游過程的重要研究課題。 采用此堿裂解法制備高拷貝數(shù)質(zhì)粒（如pUC系列）時(shí)，質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量通常約為3～5μg/ml菌液。隨著生化技術(shù)的發(fā)展，市場(chǎng)上出現(xiàn)了商品化的試劑盒用于提取及純化質(zhì)粒，有些試劑盒采用了傳統(tǒng)的SDS堿裂解法，結(jié)合DNA制備膜技術(shù)，具有高效、快速、方便之特點(diǎn)。還有些試劑盒利用層析的原理純化質(zhì)粒DNA，DNA分子中磷酸二酯鏈骨架在高鹽作用下脫水，使得暴露的磷酸基團(tuán)吸附硅膠，經(jīng)水溶性緩沖液重新水化后，DNA能從層析柱上回收。大多數(shù)試劑盒分離純化的原理為先使經(jīng)過分離的質(zhì)粒DNA吸附在柱或膜上，然后常規(guī)用乙醇洗滌，最后用水將吸附在柱上或膜上的DNA用水溶解下來。實(shí)驗(yàn)中采用的普通質(zhì)粒提取試劑盒為Tiangen 普通質(zhì)粒小提試劑盒。 下圖為質(zhì)粒DNA制備的原理。 圖 質(zhì)粒DNA制備原理 2.3凝膠電泳 電泳技術(shù)是分離、純化DNA和鑒定DNA大小的重要方法。生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)、多糖等，在一定的pH條件下，可以解離成帶電荷的離子。在電場(chǎng)中這些帶電荷的離子，可以根據(jù)電荷的性質(zhì)向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種帶電荷物質(zhì)在電場(chǎng)中向其相反電極泳動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。在電泳過程中通常要考慮泳動(dòng)率，泳動(dòng)率又稱遷移率，是指帶電荷顆粒單位時(shí)間荷單位電場(chǎng)強(qiáng)度下，在電泳介質(zhì)中泳動(dòng)的距離。泳動(dòng)率與樣品分子荷電密度、電場(chǎng)中電壓及電流成正比，與樣品的分子大小、電泳介質(zhì)黏度與電阻成反比。不同大小的帶電分子具有不同的泳動(dòng)率。不同的電泳介質(zhì)具有對(duì)樣品不同的分辨效果。在進(jìn)行核酸電泳時(shí)，注意DNA分子的構(gòu)象，在分子質(zhì)量相同時(shí)，以高度超螺旋的DNA泳動(dòng)速度最快，隨著超螺旋程度降低，相應(yīng)DNA泳動(dòng)速度依次變慢，最慢者為線狀雙鏈DNA。在通常情況下，線狀DNA分子在一定濃度瓊脂糖介質(zhì)中泳動(dòng)的速度與其分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成反比。因此，利用DNA分子長(zhǎng)度（bp）的負(fù)對(duì)數(shù)與泳動(dòng)距離作圖，對(duì)于DNA片斷分子質(zhì)量測(cè)定方便而準(zhǔn)確。緩沖液是電場(chǎng)中的導(dǎo)體，其種類、pH及離子強(qiáng)度會(huì)直接影響電泳效果。通常要選擇緩沖離子泳動(dòng)速度應(yīng)和樣品的泳動(dòng)速度一致，否則會(huì)引起帶型不均一或不對(duì)稱峰的出現(xiàn)。在分離核酸時(shí)，常選用較高的pH值，使樣品帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。以電泳支持介質(zhì)主要可以分為聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠，以電泳方式可以分成垂直型和水平型。一般來說，聚丙烯酰胺凝膠電泳用來分離較短的核酸片斷（5～500bp），分辨率高于瓊脂糖凝膠電泳，而后者多用于0.1～60kb的較大核酸片斷。垂直型電泳裝置分離效果比水平型略好，多用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。水平型電泳幾乎為所有的瓊脂糖電泳所采用，其優(yōu)點(diǎn)是灌膠、制板及加樣等操作都較為方便且不會(huì)因機(jī)械壓力引起低濃度凝膠的破裂。 圖.水平電泳裝置結(jié)構(gòu)示意圖 瓊脂糖凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速，分離范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長(zhǎng)度為200bp至50kb的DNA。 瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線型高聚物。瓊脂糖凝膠的制備是將瓊脂糖在所需緩沖液中熔化形成清澈、透明的溶液，然后將溶液倒人膠模中，令其凝固。凝固后，瓊脂糖形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在外加電場(chǎng)作用下，帶負(fù)電荷的DNA分子向陽極遷移，遷移速率由以下參數(shù)決定：①DNA的分子大小；②瓊脂糖濃度；③DNA的構(gòu)象；④所加電壓；⑤電場(chǎng)方向；⑥堿基組成與溫度；⑦嵌入染料的存在；⑧電泳緩沖液的組成。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為受DNA的堿基組成或凝膠電泳溫度的影響不明顯，瓊脂糖凝膠電泳一般在室溫下進(jìn)行。瓊脂糖濃度和所加電壓對(duì)遷移速率的影響比較值得注意。一個(gè)給定大小的線狀DNA片段，其遷移速率在不同濃度的瓊脂糖中各不相同，采用不同濃度的凝膠有可能分辨長(zhǎng)度范圍廣泛的DNA分子。在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增大，高分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)。因此，隨著電壓的增大，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍縮小。 圖. 電泳上樣示意圖 樣品經(jīng)電泳后形成的條帶必須經(jīng)過染色后才能被顯示出，以進(jìn)行分析和檢測(cè)。觀察瓊脂糖凝膠中DNA的最簡(jiǎn)便方法是利用熒光染料進(jìn)行染色。熒光物質(zhì)含有一個(gè)可以嵌入DNA堿基之間的平面基團(tuán)，DNA與之結(jié)合后在紫外線照射下呈現(xiàn)熒光。 實(shí)驗(yàn)室中最常用的熒光染料是溴化乙錠（EB）。其原理是在紫外線照射時(shí)，核酸的吸收波長(zhǎng)為254nm的紫外線并將能量傳遞給溴化乙錠，同時(shí)嵌入在核酸堿基間的溴化乙錠吸收302nm和366nm波長(zhǎng)的紫外線，來自兩方面的能量最終激發(fā)出波長(zhǎng)為590nm的紅橙色的可見熒光。通常用水將EB配制成l mg/mL的貯存液，于室溫下避光保存。該染料通常以0.5 μg/mL的濃度摻人到凝膠和緩沖液里，電泳后直接觀察。也可在不加EB的條件下進(jìn)行凝膠電泳，電泳完成后將凝膠浸在含EB(0.5 μg/mL)的電泳緩沖液或水中，于室溫下染色20 min左右后觀察。EB的存在將使線狀雙鏈DNA的電泳遷移率降低近15％。應(yīng)該注意的是，溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑，并有中度毒性，取用這種染料的溶液時(shí)務(wù)必帶上防護(hù)手套。如不慎與皮膚接觸，應(yīng)立即用清水徹底沖洗，含有溴化乙錠的溶液在使用后，不得隨意丟棄。 出于安全性的考慮，本實(shí)驗(yàn)對(duì)凝膠的染色未采用溴化乙錠，而是選擇了更加安全低毒的GoldViewTM核酸染料。它是一種新型的核酸染料，采用瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA時(shí)，GoldView與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào)，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同。 經(jīng)過熒光染料染色后的凝膠，在暗室條件下，經(jīng)過紫外燈照射激發(fā)可以出現(xiàn)相應(yīng)的可見熒光。實(shí)驗(yàn)者可通過肉眼或儀器進(jìn)行觀察，紫外線投（反）射儀原理如圖。隨著科技的發(fā)展，各種自動(dòng)化很高的相關(guān)儀器，設(shè)備相繼問世。這些先進(jìn)儀器的使用使得測(cè)量結(jié)果更加接近真實(shí)值，凝膠掃描儀和圖像分析系統(tǒng)就是具有代表性的儀器。凝膠掃描儀主要用來對(duì)樣品單向電泳后的區(qū)帶進(jìn)行掃描，從而得出定量的結(jié)果。凝膠掃描儀的出現(xiàn)大大縮短了電泳結(jié)果的分析時(shí)間，更主要的是提高了電泳結(jié)果分析的準(zhǔn)確性。掃描儀所得的圖譜通過計(jì)算機(jī)進(jìn)一步進(jìn)行數(shù)據(jù)加工處理，提高了數(shù)據(jù)的分辨率、準(zhǔn)確度和靈敏度，特別是在背景扣除、積分方法等數(shù)據(jù)處理上可以根據(jù)情況來選定，從而使得測(cè)量結(jié)果與真實(shí)情況更加接近。而圖像分析系統(tǒng)將凝膠譜圖攝制下來，進(jìn)一步將信息數(shù)字化，同時(shí)輸入到計(jì)算機(jī)中再進(jìn)行分析，使測(cè)定結(jié)果更加迅速、精確?，F(xiàn)在的凝膠成像以及圖像分析系統(tǒng)不但可以做蛋白質(zhì)定量，而且也可以做熒光和放射自顯影測(cè)量，大大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的研究進(jìn)展。凝膠掃描儀的原理和結(jié)構(gòu)與分光光度計(jì)基本一致。其結(jié)構(gòu)分為光源、單色器（或?yàn)V光片）、樣品室、光電倍增管、結(jié)果顯示等幾部分。樣品室是為專門放置凝膠板而設(shè)計(jì)的。根據(jù)設(shè)置的不同光源，掃描儀可有不同的功能，如為紫外光源，可以掃描未經(jīng)染色的凝膠。而采用可見光源的掃描儀只能對(duì)于染色凝膠進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)掃描儀視光路的不同，有透射方式測(cè)定和反射方式測(cè)定兩種，前者能掃描可以透光的凝膠，而后者因光束方向可以改變，則可以掃描不透明的電泳轉(zhuǎn)移膜、層析板等。 2.4大腸桿菌及質(zhì)粒載體 大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無芽孢。能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進(jìn)入腸道，與人終身相伴，其代謝活動(dòng)能抑制腸道內(nèi)分解蛋白質(zhì)的微生物生長(zhǎng)，減少蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物對(duì)人體的危害，還能合成維生素B和K，以及有殺菌作用的大腸桿菌素。它的主要特點(diǎn)有以下幾點(diǎn)：1、大腸桿菌是細(xì)菌，屬于原核生物；具有由肽聚糖組成的細(xì)胞壁，只含有核糖體簡(jiǎn)單的細(xì)胞器，沒有細(xì)胞核有擬核；細(xì)胞質(zhì)中的質(zhì)粒常用作基因工程中的運(yùn)載體。2、大腸桿菌的代謝類型是異養(yǎng)兼性厭氧型。3、人體與大腸桿菌的關(guān)系：在不致病的情況下（正常狀況下），可認(rèn)為是互利共生（一般高中階段認(rèn)為是這種關(guān)系）；在致病的情況下，可認(rèn)為是寄生。4、培養(yǎng)基中加入伊紅美藍(lán)遇大腸桿菌，菌落呈深紫色，并有金屬光澤，可鑒別大腸桿菌是否存在。5、大腸桿菌在生物技術(shù)中的應(yīng)用：大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，遺傳背景清楚，技術(shù)操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛，最成功的表達(dá)體系，常做高效表達(dá)的首選體系。6、大腸桿菌在生態(tài)系統(tǒng)中的地位，假如它生活在大腸內(nèi)，屬于消費(fèi)者，假如生活在體外則屬于分解者。7、它的基因組DNA為擬核中的一個(gè)環(huán)狀分子。同時(shí)可以有多個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒DNA。TOP10菌株屬于大腸桿菌，它適用于高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增，能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。 質(zhì)粒載體pET系統(tǒng)可以使各種目的蛋白得以最優(yōu)化表達(dá)。受噬菌體T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯(可選擇)信號(hào)控制；表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7 RNA 聚合酶誘導(dǎo)。T7 RNA 聚合酶機(jī)制十分有效并具選擇性：充分誘導(dǎo)時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個(gè)小時(shí)，目的蛋白通常可以占到細(xì)胞總蛋白的50%以上，但非充分誘導(dǎo)時(shí)，能很容易地通過降低誘導(dǎo)物的濃度來削弱蛋白表達(dá)。在非誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄。用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的可能毒性造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定。 3 實(shí)驗(yàn)材料 3.1 主要器材 電子天平，冰箱，超凈工作臺(tái)，搖床，高速離心機(jī)，旋渦振蕩器，制冰機(jī)，微量移液器，微量離心管，微波爐，瓊脂糖凝膠電泳儀（DYY-6C型，北京市六一儀器廠），紫外凝膠成像系統(tǒng)（DNR Bio-Imaging Systems），封口膜，一次性手套。 3.2 主要試劑 (1) 菌種：含有PET28a質(zhì)粒的大腸桿菌Top10，卡納霉素抗性。含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿,菌氨芐青霉素抗性。 (2) LB液體培養(yǎng)基：酵母浸膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0 (3) 卡納霉素：100 mg/mL (4) Plasmid mini kit質(zhì)粒小量提取試劑盒（Biomiga公司） (5) 瓊脂糖：電泳級(jí) (6) DNA Marker IV，由6條線狀雙鏈DNA條帶組成，分別為7000、5500、3500、2000、1000和500bp (7) GoldViewTM核酸染料（賽百盛） (8) TAE溶液：40 mmol/L Tris-乙酸鹽，1 mmol/L EDTA (9) 10×點(diǎn)樣緩沖液（Loading Buffer, Takara） 4 實(shí)驗(yàn)方法 4.1菌體培養(yǎng)（前期準(zhǔn)備工作） 將50μL甘油中保存的菌液接入固體LB平板37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接入10mL液體LB培養(yǎng)基（其中卡納霉素的濃度為50 ug/mL），37℃，200rpm過夜培養(yǎng)。 4.2質(zhì)粒提取 按照Plasmid mini kit質(zhì)粒小量提取試劑盒（Biomiga公司）進(jìn)行操作： 1. 37℃過夜培養(yǎng)的菌液1~4 mL 13000 rpm離心1 min，收集菌體，并盡可能的去除上清，以防止后面菌液裂解不充分和沉淀不完全的情況； 2. 使用250 μl Buffer A1充分重懸沉淀； 3. 加入250 μl BufferB1后反轉(zhuǎn)離心管使液體混合均勻，然后靜置4 min，最好出現(xiàn)溶液粘稠且澄清的現(xiàn)象，否則可以考慮加大B1的量或者減少菌液的量； 4. 加入350 μl 冰箱預(yù)冷的Buffer N1后立即反轉(zhuǎn)多次至溶液充分混勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀后放置于冰浴上靜置2min； 5. 室溫下13000 rpm離心10 min，一次到多次直至上清中沒有沉淀為止，然后將上清轉(zhuǎn)入帶有已平衡好的DNA柱中，放置于收集管中室溫下13000 rpm離心1 min，，重復(fù)兩次后棄濾液； 6. 向DNA柱中加入500 μl Buffer KB，室溫13000 rpm 離心1 min，倒掉收集管中的濾液； 7. 向DNA柱中加入500 μl DNA Wash Buffer，13000 rpm室溫離心1 min，重復(fù)兩次后棄濾液； 8. 開蓋后室溫13000 rpm離心5min，或者置于超凈臺(tái)中風(fēng)干殘留的乙醇，以保證最后的洗脫效率； 9. 將純化柱置于新的1.5 ml離心管中，加入50μl預(yù)熱的Elution Buffer。室溫下放置2 min后13000 rpm離心1 min，重復(fù)兩次后，收集洗脫液。 10. 測(cè)定得到的純化產(chǎn)物的濃度，保存于-20℃冰箱中待用。 4.3 瓊脂糖凝膠電泳 A 制膠 a) 利用1×TAE溶液配制1.0%瓊脂糖25ml(濃度由目的條帶大小決定)，微波加熱使之溶化； b) 加入2.5μL GoldView，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡； c) 將制膠床放入水平放置的制膠托盤中，插好梳子，倒入融好的瓊脂糖凝膠； d) 待凝膠充分凝固(30min)后，拔下梳子。 B 加樣 e) 將制膠床連同凝膠一起放入電泳槽中； f) 加入電泳緩沖液TAE，浸沒膠面1mm左右； g) 10μL的樣品和2μL點(diǎn)樣緩沖液在封口膜上混和，然后點(diǎn)在點(diǎn)樣孔中； h) 將4μL 的DNA Marker點(diǎn)在點(diǎn)樣孔中。 C 電泳 i) 蓋上透明上蓋； j) 接通電源線，選擇工作電壓，120V，30min，打開電泳開關(guān)； k) 當(dāng)加樣緩沖液中的溴酚藍(lán)遷移至足夠分離DNA片段的距離時(shí)，關(guān)閉電源，將凝膠在紫外燈下觀察，并用凝膠成像系統(tǒng)成像保存電泳圖。（請(qǐng)注意觀察，如溴酚藍(lán)已經(jīng)接近另一端時(shí)可及時(shí)停止） l) 如需要進(jìn)行切膠回收，需要盡量保證目的DNA片段暴露在紫外燈下的時(shí)間比較短。 5 注意事項(xiàng) (1) 瓊脂糖溶液微波加熱時(shí)間不易過長(zhǎng)，以免液體大量蒸發(fā)； (2) 所用器具需要高壓滅菌； (3) 堿裂解過程中混和的動(dòng)作要溫和，切勿振蕩。 (4) 將融好的凝膠倒入制膠床前需要冷卻至70℃以下，高溫凝膠會(huì)使制膠床變形； (5) 凝膠放入電泳槽時(shí)點(diǎn)樣孔靠近陰極側(cè)（通電后氣泡較多的一側(cè)）； (6) 上蓋的小凸塊應(yīng)插入槽體，并壓下安全按鈕； (7) 本實(shí)驗(yàn)中使用的染色劑的是GoldView，無毒。但實(shí)驗(yàn)中依然應(yīng)注意戴手套操作，且接觸染料的手不要隨意接觸其他器皿，養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣。 6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （1） 菌液OD值 提取菌液在稀釋四倍后（1ml菌液，3ml水）的吸光度為：pUC：0.443， pET：0.824。 （2） 在可見光區(qū)測(cè)定提取的質(zhì)粒吸光度 兩份樣品得到結(jié)果分別為： 結(jié)果整理如下： 表1 提取質(zhì)粒各項(xiàng)指標(biāo) 質(zhì)粒種類 質(zhì)粒濃度/ng/uL Abs A-260 10 mm path A-280 10 mm path 260/280 260/230 pET 21.5 0.343 0.429 0.225 1.91 1.25 pUC 28.7 0.361 0.573 0.300 1.91 1.59 （3）電泳 瓊脂凝膠中瓊脂糖的濃度為1.0% 電泳得到的圖片為： 從左至右依次為同組實(shí)驗(yàn)者的跑膠結(jié)果，較暗區(qū)域內(nèi)的是我做的結(jié)果，左邊兩條可能濃度較低而顯得稍暗，但各個(gè)條帶均是清晰可見的。 根據(jù)DNA Marker可以讀出四條膠帶的bp值： 表2 電泳結(jié)果 序號(hào) 1 2 3 4 樣品 pET（酶切） pET pUC（酶切） pUC bp值 5200 3300 2300 1800 參考值 5369 / 2686 / 從電泳結(jié)果可以看出，這次質(zhì)粒提取比較成功，得到了較為理想的質(zhì)粒并成功的進(jìn)行了酶切，從電泳結(jié)果來看效果很好。但提取出的兩份質(zhì)粒的濃度均不是很高，可能是由于實(shí)驗(yàn)過程中某些操作不理想導(dǎo)致了一些損失。 酶切后的線性片段與環(huán)狀質(zhì)粒相比，明顯可以看出環(huán)狀質(zhì)粒的表觀分子量更小，但實(shí)際上二者是相同的，之所以電泳結(jié)果不同，是由于環(huán)狀質(zhì)粒在凝膠電泳中由于自身環(huán)化使其在凝膠中的阻力變小，在凝膠中運(yùn)動(dòng)的更快，所以表現(xiàn)出更“輕”的現(xiàn)象。 同時(shí)與同組的其他實(shí)驗(yàn)者相比較，與我同組的另一實(shí)驗(yàn)者（從左至右第二組）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我的結(jié)果非常相近，但卻與另外兩組的結(jié)果卻相差較大。分析實(shí)驗(yàn)過程，結(jié)果相近的兩組均為同步進(jìn)行的操作，添加的試劑與時(shí)間均完全相同，所以這可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)差異的原因。 7 思考題 （1）溶液I、II和III中各成分在裂解過程中的作用是什么？ 所謂溶液I、II和III指的就是：Buffer A1、Buffer B1、Buffer N1 Buffer A1 中含有：葡萄糖、EDTA、Tris-Cl、RNase A。葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，減少抽提過程中的機(jī)械剪切作用，防止破壞質(zhì)粒DNA；EDTA的作用是絡(luò)合掉Mg2+等二價(jià)金屬離子，防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用；Tris-Cl能使溶菌液維持溶菌作用的最適pH范圍；RNase A的作用是降解RNA。 Buffer B1中含有：SDS、NaOH。SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性；NaOH(pH>12)的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性。 Buffer N1：KAc、HAc?？梢灾泻虰uffer B1的堿性,使DNA復(fù)性，而由于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的性質(zhì)的不同，將導(dǎo)致兩種DNA的分離，即染色體DNA相互纏繞，而質(zhì)粒DNA復(fù)性成環(huán)；K+會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去。溶液中的染色體DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS形成相互纏繞的大分子物質(zhì)，很容易與小分子的質(zhì)粒DNA分離，此外，高鹽溶液也有利于各種沉淀的形成,但需在后續(xù)的步驟中出去鹽。 （2）沉淀法濃縮核酸可以采用的有機(jī)溶劑有哪些？試分析各種溶劑沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)。 溶劑沉淀法是指某些有機(jī)溶劑能降低溶液的電解常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，使溶解度的降低，同時(shí)，由于有機(jī)溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中可以分離出去。常使用的有機(jī)溶劑多為乙醇、丙酮、異丙醇和甲醇等。 各種溶劑沉淀法比較： 1、金屬離子沉淀法要求純度高，且耗電量大； 2、等電點(diǎn)法 轉(zhuǎn)置復(fù)雜，要求純度也較高； 3、鹽析法的電解裝置不易清洗； 4、有機(jī)溶劑沉淀法成本較低，但可能有較大毒性。 （3）所提取的質(zhì)粒樣品中可能含有哪些雜質(zhì)，如何去除？ 所提取的質(zhì)粒樣品中可能混有蛋白質(zhì)、RNA、相關(guān)鹽離子等。 對(duì)于蛋白質(zhì)：酚-氯仿抽提：酚和氯仿可以使蛋白質(zhì)變性，離心后變性蛋白質(zhì)存在于有機(jī)相和水相之間的界面，吸取上層含有DNA與水相，繼續(xù)用氯仿抽提可以進(jìn)一步使殘留的蛋白質(zhì)變性并去除水相中殘留的酚。由此得到純度較高的DNA水溶液，可以加鹽和乙醇最后經(jīng)高速離心得到DNA沉淀。 對(duì)于RNA：可重新加入一定量RNase A酶，切斷RNA，并再次重復(fù)進(jìn)行離心過濾等操作，可除去RNA。 鹽離子：清洗、離心。 （4）質(zhì)粒樣品中含有的各種雜質(zhì)在瓊脂糖中的泳動(dòng)速度次序？ 在制得的質(zhì)粒樣品中，可能會(huì)混有寡糖苷酸、RNA、染色體DNA等雜質(zhì)。 泳動(dòng)速度由大到小為：寡糖核苷酸>RNA>染色體DNA。 （5）超螺旋、開環(huán)和線性質(zhì)粒的電泳速度次序，凝膠濃度對(duì)其影響？ 電泳時(shí)，影響不同分子在凝膠中的移動(dòng)速率不同的主要因素在于各種不同分子的結(jié)構(gòu)與分子量的不同。物質(zhì)分子的體積越大，或者分子量越大，其所受阻力越大，遷移的越慢。 當(dāng)分子量相同的時(shí)候，遷移速度為：超螺旋質(zhì)粒>開環(huán)質(zhì)粒>線性質(zhì)粒。 凝膠濃度越大，對(duì)DNA分子的粘滯力越大，DNA移動(dòng)速率越慢。 （6）除瓊脂糖凝膠電泳之外，質(zhì)粒的分析鑒定方法還有哪些？試分析各種分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)。 抗生素篩選：抗生素篩選操作簡(jiǎn)單，但工作量大，并可能出現(xiàn)假陽性； 基因測(cè)序：基因測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確，但操作較復(fù)雜，而且設(shè)備昂貴。 8 自評(píng) 這次實(shí)驗(yàn)總體進(jìn)行的比較順利，沒有出現(xiàn)大的實(shí)驗(yàn)問題，但這次試驗(yàn)由于前期準(zhǔn)備不夠充分，自己對(duì)生化實(shí)驗(yàn)的了解也不夠，所以在實(shí)驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)的整體把握還不夠，沒能理清實(shí)驗(yàn)的思路，對(duì)實(shí)驗(yàn)的方法和操作也比較生疏，所以實(shí)驗(yàn)過程中一直在摸著石頭過河。但是通過這次實(shí)驗(yàn)之后，我對(duì)這個(gè)實(shí)驗(yàn)有了較為清晰的理解，這也是實(shí)驗(yàn)中的最大的收獲，同時(shí)通過這次實(shí)驗(yàn)也接觸到了一點(diǎn)生化實(shí)驗(yàn)方面的基礎(chǔ)，雖然只是鳳毛麟角，但相信這會(huì)給之后的學(xué)習(xí)帶來一些幫助。