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1、生物芯片技術(shù)及其進(jìn)展 侯治富 吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部 中日聯(lián)誼醫(yī)院 生物芯片技術(shù)的主要內(nèi)容 生物芯片的概念 生物芯片的基本原理 生物芯片的分類(lèi) 生物芯片的發(fā)展歷程 生物芯片的技術(shù)方法 生物芯片的應(yīng)用 生物芯片的定義 生物芯片 （ Biochip或 Bioarray） 是指包 被在固相載體上的高密度 DNA、 抗原 、 抗 體 、 細(xì)胞或組織的 微點(diǎn)陣 (microarray） 。 生物芯片的種類(lèi)：包括 DNA芯片、抗原芯 片、抗體芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等。 1998年世界十大科技突破之一。 未來(lái)十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。 生物芯片的定義
2、 Bio： 詞素 生 ...， 生物 ...; Chip： 屑晶片 , 薄片 ; 電子 集成電路片 ; 英漢計(jì)算機(jī)名詞 芯片 Array： 陣 ,列 ,排列 ,配置 ,系 ,組 ,級(jí)數(shù) ,芯片 生物芯片的概念 集成 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Oncogene Targets On the AmpliOnc I Biochip PDGFB EGFR1 PDGFRA MET FGFR2 WNT1 MYB HER2 YES1 HRAS1 CND1 RAF1 GLI MYC MDM2
3、20q13 REL MYCL1 FGR FES ABL INT2 PIK3CA NMYC AKT2 FGFR1 JUNB AKT1 KRAS2 CDK4 AR 生物芯片基本原理 生物芯片的特點(diǎn) 高度并行性：提高實(shí)驗(yàn)進(jìn)程、利于顯示圖 譜的快速對(duì)照和閱讀。 多樣性：可進(jìn)行樣品的多方面分析，提高 精確性，減少誤差。 微型化 ：減少試劑用量和反應(yīng)液體積，提 高樣品濃度和反應(yīng)速率。 自動(dòng)化 ：降低成本，保證質(zhì)量。 高通量 生物芯片的分類(lèi) 尚未統(tǒng)一 。 廣義上：矩陣型芯片、處理型芯片 固化材料：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、 細(xì)胞芯片、組織芯片 用途分類(lèi) 生物芯片研
4、究的歷史 1991 Affymatrix公司 Stephen Fodor:光刻與光化 學(xué)技術(shù)、 多肽和寡聚核苷酸微陣列。 DNA Chip概念 Stanford大學(xué) Brown實(shí)驗(yàn)室：預(yù)先合成 ， 機(jī)械手陣列 1995 Schena等 ：基因表達(dá)譜 1996 Chee et al： DNA測(cè)序 1996 Cronin et al： 突變檢測(cè) 1996 Sapolsley & Lipshutz： 基因圖克隆 1996 Shalon et al： 復(fù)雜 DNA樣本分析 1996 Shoemaker et al： 缺省突變定量表型分析 分類(lèi)（根據(jù)應(yīng)用）
5、 基因變異檢測(cè)芯片 疾病檢測(cè) (如 HIV、 P53基因、結(jié)核桿菌 ) 法醫(yī)鑒定 (如 DNA指紋圖譜 ) 表達(dá)譜芯片 腫瘤相關(guān)基因 (正常與腫瘤組織表達(dá)差異 ) 藥物篩選 (培養(yǎng)細(xì)胞藥物刺激前后表達(dá)差異 ) 發(fā)育 (同一組織不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)差異 ) 組織發(fā)生 (不同組織或器官的基因表達(dá)差異 ) 分類(lèi)（根據(jù)工藝和載體） 原位合成法： 密集程度高，可合成任意序 列的寡聚核苷酸，但特異性較差，寡聚核苷 酸合成長(zhǎng)度有限，且隨長(zhǎng)度增加，合成錯(cuò)誤 率增高。成本較高，設(shè)計(jì)和制造較煩瑣費(fèi)時(shí)。 DNA微矩陣法 ： 成本低，易操作，點(diǎn)樣密度 通常能滿(mǎn)足需要。芯片的載體需表面緊質(zhì)、
6、光滑的固體，如硅，陶，玻璃等， DNA微矩陣 芯片常用玻片為載體。 D N A C h i p s Pr o te i n C h i p s L a b C h i p s B i o c h i p s 分類(lèi)（根據(jù) DNA成分） 寡聚核苷酸或 DNA片段：約 2025個(gè)核 苷酸堿基，常用于基因類(lèi)型的分析， 如突變、正常變異（多態(tài)性）。 全部或部分 cDNA： 約 5005000個(gè)核苷 酸堿基，通常用于兩種或以上樣本的 相關(guān)基因表達(dá)分析。 Comparison of DNA Chip Technologies Sensitivity of DNA chip based a
7、ssays is a function of: Probe and target DNA/RNA (Complexity) Chip surface (autofluorescence & non-spec. bkg) Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency & crosshyb.) Hybridization efficiency (lots of factors) Detection technology (signal type, efficiency, noise) Oligo-Chip cDNA-Chip
8、 Genomic Chip 8 n or 20 n 50,000 n sequencing expression expression genomic analysis 基因芯片的種類(lèi) Science Chip： 生物分析和診斷。 Nutri Chip： 食物分析、轉(zhuǎn)基因、污染檢測(cè)。 Leuko Chip： 血液分析、病毒分析、 HLA分析。 Aqua Chip： 水質(zhì)分析。 Secure Chip： 含 DNA的物質(zhì)鑒定。 Chromo Chip： 基因分析和染色體序列。 Prokaryo Chip： 原核生物、獸醫(yī)、環(huán)保等。 生物芯片技術(shù)
9、主要環(huán)節(jié) 芯片制備：微點(diǎn)陣 樣本制備： DNA提純、擴(kuò)增、標(biāo)記 雜交：樣本與互補(bǔ)模板形成雙鏈 檢測(cè)：共聚焦掃描，雙色激光 數(shù)據(jù)處理：定量軟件，數(shù)據(jù)庫(kù)檢索， RNA印跡等。 結(jié)果分析 細(xì)胞 對(duì) mRNA進(jìn)行標(biāo)記 雜交 基因表達(dá)資料 生物芯片的制作步驟 生物芯片分析 1、測(cè)定過(guò)程應(yīng)包括五個(gè) 基本步驟： 需解決的生物學(xué)問(wèn)題 樣本制備 生物化學(xué)反應(yīng) 檢測(cè) 數(shù)據(jù)分析 Tumor Sample Normal Sample 2、生物學(xué)系統(tǒng)控制必須精確地與檢測(cè)目的相匹配。 3、生物學(xué)樣本必須精確地與生物學(xué)種類(lèi)相匹配。 4、所有基因
10、分析必須平行處理。 5、基因分析技術(shù)必須適合微型化和自動(dòng)化。 6、平行格式必須精確的依據(jù)生物學(xué)樣本的次序。 7、檢測(cè)系統(tǒng)必須能精確地獲得數(shù)據(jù)。 8、檢測(cè)系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)必須能被精確地控制和重復(fù)。 9、兩種或以上平行數(shù)據(jù)組比較應(yīng)受到單 個(gè)實(shí)驗(yàn)所固有特性的限制。 10、絕對(duì)比例關(guān)系只存在于組合實(shí)驗(yàn)的平 行數(shù)據(jù)組內(nèi)。 11、平行格式包括內(nèi)在和外部的整個(gè)系統(tǒng) 誤差的分析因素。 12、在每個(gè)系統(tǒng)模塊中采集到該系統(tǒng)所有 變量的四維數(shù)據(jù)時(shí)，才能稱(chēng)為完成生 物系統(tǒng)平行基因分析。 生物芯片技術(shù)的 12條原則只是一個(gè)基本 框架。其術(shù)語(yǔ)的詳細(xì)定義和有關(guān)理論可 參見(jiàn) h
11、ttp://cmgm.stanford.edu/schena/ 芯片制備 原位合成法（ in situ synthesis):又 可分為 原位光控合成法和原位標(biāo)準(zhǔn)試劑合成法。適用 于寡核苷酸，使用光引導(dǎo)化學(xué)原位合成技術(shù)。 是目前制造高密度寡核苷酸最為成功的方法。 合成后交聯(lián)（ post-synthetic attachment): 利用 手工或自動(dòng)點(diǎn)樣裝置將預(yù)先制備好的寡核 苷酸或 cDNA樣品點(diǎn)在經(jīng)特殊處理過(guò)的玻片或其 他材料上。主要用于診斷、檢測(cè)病原體及其他 特殊要求的中、低密度芯片的制備。 兩種制備方法比較 原位合成： 測(cè)序、查明點(diǎn)突變 高密度、根據(jù)已知的 DNA編制程
12、序 制作復(fù)雜、價(jià)格昂貴、不能測(cè)定未知 DNA序列 合成后交聯(lián)： 比較分析 制備方式直接和簡(jiǎn)單，點(diǎn)樣的樣品可事先純化， 交聯(lián)方式多樣，可設(shè)計(jì)和制備符合自己需要的芯片。 中、低密度，樣品浪費(fèi)較多且制備前需儲(chǔ)存大量樣品。 雜交 是芯片技術(shù)中除方陣構(gòu)建外最重要的一步 液相中探針與 DNA片段按堿基配對(duì)規(guī)則形成 雙鏈反應(yīng)。 選擇雜交條件時(shí)，必須滿(mǎn)足檢測(cè)時(shí)的靈敏 度和特異性。使能檢測(cè)到低豐度基因，且能 保證每條探針都能與互補(bǔ)模板雜交。 合適長(zhǎng)度的 DNA有利于與探針雜交。 溫度、非特異性本底等均會(huì)影響雜交結(jié)果。 最好在封閉循環(huán)條件下雜交，雜交爐。 樣本制備 制備
13、高質(zhì)量樣本是困難的但又是極其重要的。 制備細(xì)胞、組織或整個(gè)器官樣本應(yīng)特別小心。 溫度、激素和營(yíng)養(yǎng)環(huán)境、遺傳背景、組織成分 等輕微改變都會(huì)使基因表達(dá)的結(jié)果發(fā)生明顯變 化。 用于基因類(lèi)型分析的樣本是 DNA， 用于表達(dá)研 究的樣本是 cDNA。 樣本制備后應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，通常為酶標(biāo)記、熒光 標(biāo)記和核素標(biāo)記。 結(jié)果分析 芯片與標(biāo)記的靶 DNA或 RNA雜交后，或與標(biāo)記的 靶抗原或抗體結(jié)合后，可采用下列方法分析處 理數(shù)據(jù)： 共聚焦掃描儀：應(yīng)用最廣，重復(fù)性好但靈敏度 較低。 質(zhì)譜法：快速、精確，可準(zhǔn)確判斷是否存在基 因突變和精確判斷突變基因的序列位置。探針 合成較復(fù)雜。 化學(xué)發(fā)光、
14、光導(dǎo)纖維、二極管方陣檢測(cè)、直接 電荷變化檢測(cè)等。 芯片掃讀裝置 根據(jù)采用的光電偶合器件，分為光電倍 增管型和 CCD型。 根據(jù)激光光源，可分為激光型和非激光 型。 應(yīng)用最為廣泛的是激光光源的共聚焦掃 描裝置，分辨率、靈敏度極高，有良好 的定位功能，可定量，應(yīng)用廣泛。 圖象分析 復(fù)雜的雜交圖譜一般需由圖象分析軟件 來(lái)完成。 分析軟件的功能：鑒定每個(gè)點(diǎn)陣、最大 限度消除本底熒光的干擾、解析多種顏 色圖象、可標(biāo)記或排除假陽(yáng)性、識(shí)別和 分析對(duì)照實(shí)驗(yàn)是否成功、可將信號(hào)標(biāo)準(zhǔn) 化等。 圖象處理軟件必須具備提取基因庫(kù)和數(shù) 據(jù)庫(kù)的能力。 質(zhì)量控制 實(shí)驗(yàn)對(duì)照： 體外轉(zhuǎn)錄從 c
15、DNA合成 mRNA， 參入標(biāo)本中作為對(duì)照 。 此 mRNA不與點(diǎn)陣的核酸雜交 。 將不同濃度的不同基因參入標(biāo)本中 ， 可作為標(biāo)本 間標(biāo)準(zhǔn)化的參照 。 用兩種不同吸收光譜的熒光素同時(shí)分析兩個(gè)標(biāo)本 ， 如果兩種熒光強(qiáng)度一致 ， 可排除標(biāo)本間變異因素 。 用單一堿基錯(cuò)配的寡核苷酸做對(duì)照可排除交叉雜 交 。 結(jié)果有效性的證實(shí) 在表達(dá)矩陣上，有時(shí)難于區(qū)分極其相似的序列，如 基因族成員，亞類(lèi)或異類(lèi)的存在。 比較兩種不同 DNA序列表達(dá)水平時(shí)，有些參數(shù)如核 苷酸的成分、二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在和矩陣上 DNA的長(zhǎng)度 都會(huì)影響雜交。 證實(shí)矩陣分析的結(jié)果可用 RT-PCR(區(qū)別基因族成員 ,
16、 比較不同 DNA種系表達(dá) ,證實(shí)基因變異或突變和精確 測(cè)定 DNA表達(dá)水平 )、 Northern Blot(證實(shí)某一基因 的相對(duì)表達(dá)水平 )、 Western Blot(RNA表達(dá)是否達(dá) 到細(xì)胞中的蛋白水平 )、質(zhì)譜儀 (證實(shí)矩陣結(jié)果是否 在蛋白水平 )等。 生物芯片技術(shù)的應(yīng)用 基因表達(dá)分析：腫瘤 基因突變檢測(cè)：遺傳性疾病 測(cè)序、基因圖繪制和多態(tài)性分析：測(cè)序 微生物菌種鑒定：毒力基因、抗藥基因 藥物研究：新藥篩選、指導(dǎo)合理用藥 克隆選擇及文庫(kù)篩選 生物芯片技術(shù)的發(fā)展 發(fā)展趨勢(shì) 微型化： DNA矩陣越來(lái)越小。 集成化：矩陣上的基因組越來(lái)越大 。 多
17、樣化：測(cè)定范圍越來(lái)越廣。 微量化：測(cè)定所需樣本越來(lái)越少。 全自動(dòng)化：樣品制備到結(jié)果顯示全部分析過(guò)程。 定量化： 如激光捕獲技術(shù)，顯微解剖技術(shù)等可 精確測(cè)定一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)基因的表達(dá)。 DNA矩陣數(shù)據(jù)信息庫(kù)的完善。 生物芯片技術(shù)的發(fā)展 技術(shù) 毛細(xì)管電泳芯片技術(shù) PCR芯片技術(shù) (PCR-Chip) 縮微芯片實(shí)驗(yàn)室 (lab-on-a-chip) 微珠芯片技術(shù) (beadArray) 抗體和蛋白質(zhì)陣列技術(shù) (Antibody and protein-array technology) 自我定制芯片技術(shù)（ make your own chip) 血?dú)夥治鲂酒?
18、 毛細(xì)管電泳芯片技術(shù) Mathies最早報(bào)道毛細(xì)管電泳芯片測(cè)序結(jié)果， 在 10分鐘內(nèi)完成了對(duì) 433個(gè)堿基序列的測(cè)定。 賓夕法尼亞大學(xué) Wilding等成功地利用毛細(xì)管 電泳芯片分離了用于診斷杜鑫 -貝克肌萎縮的 多條 DNA片段。 瑞士 Ciba-Geigy公司和加拿大 Alberta大學(xué)合 作利用玻璃毛細(xì)管電泳芯片完成了對(duì)寡核苷酸 的分離。 縮微芯片實(shí)驗(yàn)室 在一張芯片上完成樣品 (如血液、組織等 )制備、 化學(xué)反應(yīng)、檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。 1998年程京博士首次應(yīng)用 LOC實(shí)現(xiàn)了從樣品制備到 反應(yīng)結(jié)果顯示的全部過(guò)程，成果地從混有大腸桿 菌的血清中分離出了細(xì)菌。 含有加熱
19、器、微泵微閥、微流量控制器、電子化 學(xué)和電子發(fā)光探測(cè)器的芯片已經(jīng)問(wèn)世。也已出現(xiàn) 樣品制備、化學(xué)反應(yīng)和分析檢測(cè)部分結(jié)合的芯片。 LOC與衛(wèi)星傳輸和網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)結(jié)合，將實(shí)現(xiàn)高 通量、一體化和移動(dòng)性的 “ 未來(lái)型掌上實(shí)驗(yàn)室 ” 的構(gòu)想。 抗體和蛋白質(zhì)陣列技術(shù) 蛋白質(zhì)組學(xué) (protiomics)的興起，促 進(jìn)了抗體和蛋白質(zhì)陣列技術(shù)的發(fā)展。 Pareick Brown使用特異性抗體微矩陣， 測(cè)定了細(xì)胞和體液樣本中數(shù)千種不同的蛋 白質(zhì)。 Leuking等采用蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)，測(cè)定 了 10pg的微量蛋白質(zhì)，并證實(shí)假陽(yáng)性極低。 乳腺癌基因芯片 Stanford 乳腺癌微矩陣 (P
20、erou et al.1999) 每種基因的數(shù)據(jù)以行表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)用 列表示。 顏色強(qiáng)度表示對(duì)照和實(shí)驗(yàn) cDNA的比率。 比率相同時(shí)為 1。 結(jié)果為紅色表示 mRNA增加，綠色表示減 少，灰白色表示缺乏。 兩種基因的相似性用 Pearson相關(guān)公式或 Euclidian測(cè)距公式計(jì)算。 DNA微矩陣分析軟組織肉瘤表達(dá) Kavine Maillard et al(1999) cDNAs進(jìn)行 DNA表達(dá)矩陣， PCR產(chǎn)物包 被在經(jīng)賴(lài)氨酸處理的玻片上，用 Cys3-和 Cys5-標(biāo)記的 cDNA進(jìn)行雜交， 洗滌后用 Scanarray3000掃描儀測(cè)定 矩陣，表達(dá)數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在 ACeD
21、B數(shù)據(jù)庫(kù) 中，根據(jù)數(shù)據(jù)表達(dá)類(lèi)型區(qū)分不同的 基因。 微矩陣分析 DNA和蛋白表達(dá) Holger Eickhoff et al.(1999) 根據(jù)已有的序列數(shù)據(jù)，組合 800000人類(lèi) EST序 列，已重矩陣了 38000克隆用于 RNA表達(dá)分析， 克隆經(jīng) PCR擴(kuò)增后共價(jià)結(jié)合于玻片上，每張玻 片固定 19200個(gè)基因片段，標(biāo)記人組織 RNAs與 被選的 38000人基因片段的矩陣進(jìn)行雜交，比 較健康與疾病組織的圖象，用軟件分析點(diǎn)識(shí)別 和點(diǎn)定量。 使用寡聚核苷酸鑒定新的 cDNA克隆，和進(jìn)入表 達(dá)載體，使相應(yīng)蛋白能直接表達(dá)，矩陣后可分 析蛋白 -蛋白和蛋白 -DNA的關(guān)系。 生物芯片相
22、關(guān)儀器 點(diǎn)陣儀：制備芯片。點(diǎn)樣針?lè)譃閷?shí)心和 空心兩種，點(diǎn)樣方式有非接觸噴點(diǎn)和接 觸點(diǎn)樣兩種。 雜交儀：全自動(dòng)完成調(diào)節(jié)、加探針、漂 洗和熱循環(huán)的雜交過(guò)程。 掃描儀：激光共聚焦或 CCD直接成像分析 結(jié)果。 Q Bot 超高解析基因篩選暨排列分析儀。 基因菌落篩選 (Colony Picking)： 3500/h 基因排列打點(diǎn) (Gridding)： 100000/h 基因復(fù)制 (Replication)： 9696,96384 基因重新排列 (Re-Arraying)： 正確的基因置復(fù)制 盤(pán) 基因微矩陣排列 (Micro-Arraying)： 20000/片
23、 全自動(dòng)液體分注系統(tǒng) (Liquid Handling):96針， 注液量 1200l， 適合 PCR產(chǎn)物。 分析軟件：分析、質(zhì)控、上網(wǎng)。 環(huán)境控制：紫外線(xiàn)照射、空氣濾網(wǎng)、陽(yáng)極處理鋁 板 Q Pix 半敞開(kāi)式基因篩選暨排列分析儀 (經(jīng)濟(jì)型 ) 基因菌落篩選 (Colony Picking)： 3500/h 基因排列打點(diǎn) (Gridding)： 100000/h 基因復(fù)制 (Replication)： 9696,96384 基因重新排列 (Re-Arraying)： 正確的基因置復(fù)制 盤(pán) 基因微矩陣排列 (Micro-Arraying)： 20000/片 分析軟件：分
24、析、質(zhì)控、上網(wǎng) 環(huán)境控制：紫外線(xiàn)照射、空氣濾網(wǎng)、陽(yáng)極處理鋁板 Q Array 第三代半敞開(kāi)式基因微矩陣排列儀。 基因微矩陣排列 (Microarrying)： 同時(shí)處 理 84片玻片，每一打點(diǎn)玻片分 4個(gè)區(qū)域，可 安排不同的矩陣排列?？蛇x 16或 24針座。 儀器容量：玻片 84片，玻片架 6個(gè)， 384孔 板 5盤(pán)。 分析軟件：分析、質(zhì)控、上網(wǎng)。 環(huán)境控制：紫外線(xiàn)照射、空氣濾網(wǎng)、陽(yáng)極 處理鋁板。 自動(dòng)液體處理系統(tǒng)。 雜交儀 Affymetrix 640雜交 儀： 溫度范圍： 0100C 探針用量： l 流速： 10ml/min 樣本區(qū)： 2.46.4cm 掃描儀 GenearrayTM掃描儀： 激光：氬離子 ,488nm 適用染料：熒光素、 藻紅素 單掃描時(shí)間： <4分鐘 分辨率： 3、 6、 9或 24微米 Summary(1) 流 程 系 統(tǒng) 組織芯片 組織芯片 點(diǎn)樣儀 石蠟包埋機(jī) 組織脫水機(jī) 細(xì)胞芯片 微流控系統(tǒng)
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