SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝膠電泳詳解.ppt

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SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE,一、什么是SDS？,十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一種陰離子去污劑。它在水溶液中以單體 （monomer）和分子團(tuán)（micellae）的混合形 式存在。,SDS的作用,破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械臉?gòu)象，保證蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。,二、SDS-PAGE的基本原理,（一）蛋白質(zhì)分子的解聚 樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。,1、SDS 陰離子去污劑 變性劑 助溶性試劑 斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵 分子去折疊 破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu),,2、強(qiáng)還原劑 巰基乙醇（β-mercaptoethanal） 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。,SDS和還原劑的作用： （1）分子被解聚或組成它們的多肽鍵 （2）氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù) 電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。 （3）蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超 過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除 了不同分子之間原有的電荷差異。,蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點(diǎn) （1）形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒 （2）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的。 （3）長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比。,膠束在SDS-PAGE系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15KD—200KD之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系,3、影響SDS電泳的關(guān)鍵因素 （1） 溶液中SDS單體濃度（1mmol/L) 大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1：1.4 （2） 樣品緩沖液的離子強(qiáng)度（不0.26) 低離子強(qiáng)度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。,（3） 二硫鍵是否完全被還原 當(dāng)二硫鍵被徹底還原后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對(duì)遷移率和分子量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系。,（二）緩沖系統(tǒng)的選擇 一般情況下，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對(duì)蛋白質(zhì)的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的。,電泳緩沖液的種類： 1、磷酸緩沖液 2、Tris-醋酸鈉緩沖系統(tǒng) 3、咪唑緩沖液系統(tǒng)： 比磷酸緩沖系統(tǒng)的導(dǎo)電性低，電泳速 度要比后者快一倍。 4、尿素系統(tǒng)： 適用分子量低于15KD的蛋白樣品。 5、Tris-甘氨酸系統(tǒng)： 使用最多的緩沖液 6、Tris-硼酸鹽緩沖液： 測(cè)定糖蛋白的分子量,（三）凝膠濃度的選擇 由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，只取決于分子解聚后SDS-蛋白質(zhì)膠束的大小，因此凝膠濃度的選擇會(huì)直接影響分辨率。 不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度.,,,（四）分子量測(cè)定 1、相對(duì)遷移率（Rf） Rf即用每個(gè)帶的遷移距離除以溴酚藍(lán)前沿的遷移距離得到的。 測(cè)量位置應(yīng)在蛋白帶的中央。 蛋白帶遷移距離 Rf= ———————— 溴酚藍(lán)遷移距離,蛋白帶遷移距離 固定前的凝膠長(zhǎng)度 Rf= ————————— X ————————— 干燥后的凝膠長(zhǎng)度 溴酚藍(lán)遷移距離,2、作圖 以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，Rf為橫坐標(biāo)繪圖,3、通過(guò)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的Rf值，便可在標(biāo) 準(zhǔn)曲線上讀出他的分子量,三、去污劑的選擇 無(wú)離子去污劑：Lubro W；Brij35， Tween Triton 陽(yáng)離子去污劑：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC） 陰離子去污劑：SDS deoxycholate,四、方法 1、分類 （1）根據(jù)對(duì)樣品的處理方式的不同 還原SDS電泳 非還原SDS電泳 帶有烷基化作用的還原SDS電泳,,（2）根據(jù)緩沖系統(tǒng)和凝膠孔徑的不同 連續(xù)電泳 不連續(xù)電泳 （3）根據(jù)電泳的形式 圓盤電泳 垂直電泳 平板電泳 水平電泳,,,,2、操作 （1） 制備分離膠 （2） 制備積層膠(堆積膠）,,,,,,,,分離膠聚合之后,,,,,,,,,,,,,,,（3） 加樣品 樣品的處理 在蛋白溶液中加入過(guò)量的SDS后，可引起以下的反應(yīng)： 蛋白質(zhì)本身的電荷被屏蔽 氫鍵斷裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折疊(二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞),并形成橢球形,①還原SDS處理 當(dāng)加入還原試劑DTT或β-二巰基乙醇后，蛋白質(zhì)被完全去折疊，只根據(jù)分子量分離。,②帶有烷基化作用的還原SDS處理 烷基化作用可以很好地并經(jīng)久牢固地保護(hù)SH基團(tuán)，而得到窄的電泳帶。,③非還原的SDS處理 許多樣品，如生理體液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分鐘，并不需要加還原劑，此時(shí)二硫鍵不能被斷裂，蛋白并沒(méi)有完全被去折疊。,（4） 電泳 （5） 固定,（6） 染色 考馬斯亮藍(lán)（coomassie brilliant blue） ①R-250 三苯基甲烷，紅藍(lán)色，每個(gè)分子含有兩個(gè)SO3H基團(tuán)，偏酸性，和氨基黑一樣也是結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)上。,,,②G-250 二甲花青亮藍(lán)，藍(lán)綠色。,銀染色 銀染的機(jī)制是將蛋白帶上的硝酸銀（銀離子）還原成金屬銀，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。,（7） 照相，凝膠干燥 （8） 定量測(cè)定,3、電泳過(guò)程中的不正?，F(xiàn)象 （1）“微笑”現(xiàn)象 指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形，說(shuō)明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好。,（2）“皺眉”現(xiàn)象 由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。,（3）“拖尾”現(xiàn)象 樣品溶解不佳引起。,（4）“紋理”現(xiàn)象 由于樣品中的不溶顆粒引起的。,（5）偏斜現(xiàn)象 電極放置不平行引起或加樣位置偏斜而引起,（6）帶太寬 加樣量太多或加樣孔泄漏引起,Molecular mass versus molecular weight Molecular mass (symbol m) is expressed in Daltons (Da). One Dalton is defined as 1/12 the mass of carbon 12. Most macromolecules are large enough to use the kiloDalton (kDa) to describe molecular mass. Molecular weight is not the same as molecular mass. It is also known as relative molecular mass (symbol Mr, where r is a subscript). Molecular weight is defined as the ratio of the mass of a macromolecule to 1/12 the mass of a carbon 12 atom. It is a dimensionless quantity. When the literature gives a mass in Da or kDa it refers to molecular mass. It is incorrect to express molecular weight (relative molecular mass) in Daltons. Nevertheless you will find the term molecular weight used with Daltons or kiloDaltons in some literature, often using the abbreviation MW for molecular weight.,