綜合性實(shí)驗(yàn) 蛋白質(zhì)的分離提取、sds聚丙烯酰胺凝膠電泳及westen印跡

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1、蛋白質(zhì)的分離提取、蛋白質(zhì)的分離提取、SDS-聚丙烯聚丙烯酰胺凝膠電泳及酰胺凝膠電泳及Western印跡印跡蛋白質(zhì)的分離提取蛋白質(zhì)的分離提取蛋白質(zhì)分子在水溶液中因其表面帶有一定數(shù)量的電荷及形成水化膜使其成為穩(wěn)定的膠體顆粒。在某些物理或化學(xué)因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒由于失去電荷和水化膜而沉淀。中性鹽、重金屬鹽、三氯乙酸和乙醇等都是常用的沉淀蛋白質(zhì)的試劑。、蛋白質(zhì)的鹽析、蛋白質(zhì)的鹽析大量中性鹽類如硫酸銨(NH4)2SO4、硫酸鈉(Na2SO4)和氯化鈉(NaCl)等加入到蛋白質(zhì)溶液后，可引起蛋白質(zhì)顆粒因失去水化膜和電荷而沉淀。各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小顆粒大小和電荷數(shù)量電荷數(shù)量不同，用不同濃度中性鹽可使各

2、種蛋白質(zhì)分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中沉淀。當(dāng)硫酸銨濃度達(dá)到飽和時(shí)血清中的白蛋白便沉淀下來(lái)。鹽析沉淀蛋白質(zhì)時(shí)能保持蛋白質(zhì)不變性，加水稀釋降低鹽濃度，能使沉淀的蛋白質(zhì)重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用鹽析法鹽析法可達(dá)到分離提純蛋白質(zhì)的目的。、重金屬鹽和三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)、重金屬鹽和三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)重金屬離子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag+等可與蛋白質(zhì)分子上的羧基羧基結(jié)合生成不溶性蛋白質(zhì)金屬鹽不溶性蛋白質(zhì)金屬鹽而沉淀。三氯乙酸屬生物堿試劑，能與蛋白質(zhì)分子上的氨基結(jié)合而沉淀。它們均可引起蛋白質(zhì)分子的變性和失去生物學(xué)活性。PrNH3+COO-OH-PrNH2COO-Ag

3、+PrNH2COOAgPrNH3+COO-CCl3COOHPrNH3+-OOCCCl3COOH、乙醇沉淀蛋白質(zhì)乙醇沉淀蛋白質(zhì)某些可與水混合的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇和丙酮等，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，降低其在溶液中的穩(wěn)定性。當(dāng)加入少量中性鹽如NaCl等或溶液pH接近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)膠粒上的電荷被中和，加入上述有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)沉淀。反應(yīng)在04下進(jìn)行，并應(yīng)立即分離沉淀物，否則蛋白質(zhì)會(huì)變性。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量分子量一一 目的與要求目的與要求 1.學(xué)習(xí)電泳原理和技術(shù) 2.學(xué)習(xí)和掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質(zhì)技術(shù) 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，可帶正

4、電荷也可帶負(fù)電荷。帶電荷的蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中向相反的電極移動(dòng)，稱為電泳。血清中各種蛋白質(zhì)在PH 8.6的緩沖液中都帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。移動(dòng)的速度主要決定于帶電荷的多少和分子的大小。電荷多、分子小，移動(dòng)就快；反之就慢。因此，利用電泳時(shí)各種蛋白質(zhì)分子移動(dòng)的速度不同，可將血清蛋白質(zhì)分成白蛋白、1、2、球蛋白等幾條區(qū)帶。二二 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理n離子型去污劑SDS（十二烷基硫酸鈉）可與蛋白質(zhì)相作用，破壞蛋白質(zhì)分子的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性，失去原有的空間構(gòu)象，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物蛋白質(zhì)復(fù)合物，使各種蛋白質(zhì)分子相互間只保持著分子大小的差異，彼此間原有的電荷差異被消除或大大降低。當(dāng)SD

5、S被引入聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)并進(jìn)行電泳時(shí)，樣品中蛋白持原有的電荷差異已不起作用，蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中的遷移速度僅僅取決人于各自分子的大小。n將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)其分子量的對(duì)數(shù)作圖時(shí)，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。此時(shí)，將未知分子量的蛋白質(zhì)樣品，在相同的條件下進(jìn)行電泳，就可根據(jù)此蛋白質(zhì)的電泳遷移率，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得它的分子量。電泳技術(shù)分類電泳技術(shù)分類幾種常見(jiàn)電泳的比較幾種常見(jiàn)電泳的比較類型類型優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)紙電泳紙電泳設(shè)備操作簡(jiǎn)單設(shè)備操作簡(jiǎn)單分辨率差，電滲分辨率差，電滲現(xiàn)象現(xiàn)象醋酸纖維薄膜電醋酸纖維薄膜電泳泳設(shè)備操作簡(jiǎn)單，樣設(shè)備操作簡(jiǎn)單，樣品用量少品用量少分辨率差分辨率差瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝

6、膠電泳快速，分辨率高快速，分辨率高電滲現(xiàn)象嚴(yán)重電滲現(xiàn)象嚴(yán)重聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳可調(diào)節(jié)凝膠孔徑，可調(diào)節(jié)凝膠孔徑，樣品用量少分辨率樣品用量少分辨率高，無(wú)電滲現(xiàn)象高，無(wú)電滲現(xiàn)象高濃度凝膠難剝高濃度凝膠難剝離離聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；(3)對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無(wú)吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度

7、，通過(guò)改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。凝膠濃度凝膠濃度(T)(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)表3.4 分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)蛋 白 質(zhì) 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA)104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。目

8、前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完全相同。圖1 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖(A為正面,B為剖面)(1)樣品膠pH6.7 (2)濃縮膠pH6.7 (3)分離膠pH8.9 (4)電極緩沖液pH8.3圖2 夾心垂直板電泳槽示意圖 圖3 凝膠模示意圖返回不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、p

9、H值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。（1 1）樣品濃縮效應(yīng)）樣品濃縮效應(yīng)(a)凝膠孔徑不連續(xù)性：(b)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性；在pH6.7的凝膠緩沖體系中前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-)尾隨離子(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度)當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過(guò)蛋白質(zhì)；（c)電位梯度的不連續(xù)性：(2)(2)分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)(3)(3)電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)A.樣品的濃縮效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣

10、品濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括原理包括：緩沖液成分及緩沖液成分及pHpH的不連續(xù)性的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性 緩沖緩沖液液濃縮膠濃縮膠樣品樣品分離膠分離膠A.樣品的濃縮效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)(緩沖液緩沖液pH8.3)pH8.3)蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)從“”極向極向“”極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。膠，速度變慢，堆積濃縮。緩緩沖液沖液樣品樣品濃縮膠濃縮膠分離膠

11、分離膠A.樣品的濃縮效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)(緩沖液緩沖液pH8.3)pH8.3)蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)從“”極向極向“”極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。膠，速度變慢，堆積濃縮。緩緩沖液沖液樣品樣品濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠A.樣品的濃縮效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積樣品進(jìn)入濃縮

12、膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)(緩沖液緩沖液pH8.3)pH8.3)蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)從“”極向極向“”極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。膠，速度變慢，堆積濃縮。緩緩沖液沖液濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠A.樣品的濃縮效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)(緩沖液緩沖液pH8.3)pH8.3)蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)從“”極向極向“”極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。膠，速度變慢，堆積濃縮

13、。緩緩沖液沖液濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠B.B.電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠后蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠后 pHpH增大增大(pH 8.9)(pH 8.9)，GlyGly解離解離度增大，不存在快、慢離子度增大，不存在快、慢離子之分，蛋白質(zhì)樣品在均一電之分，蛋白質(zhì)樣品在均一電場(chǎng)強(qiáng)度和場(chǎng)強(qiáng)度和pHpH條件下泳動(dòng)。條件下泳動(dòng)。由于各種蛋白質(zhì)由于各種蛋白質(zhì)pI不同，所不同，所載有效電荷不同，因此質(zhì)點(diǎn)載有效電荷不同，因此質(zhì)點(diǎn)的的 有效遷移率不同，形成不有效遷移率不同，形成不同區(qū)帶。同區(qū)帶。緩緩沖液沖液濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠C.C.分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)分離膠的孔徑小，各分分離膠的孔徑小，各分子由于大小和

14、形狀不同，子由于大小和形狀不同，所受阻力不同，表現(xiàn)出所受阻力不同，表現(xiàn)出不同的不同的 泳動(dòng)速度，即分泳動(dòng)速度，即分子篩作用。分子量小，子篩作用。分子量小，形狀為球形的泳動(dòng)速度形狀為球形的泳動(dòng)速度最快。最快。緩緩沖液沖液濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,簡(jiǎn)稱SDS)，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無(wú)關(guān)。因此可以利用SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分

15、子量。三三 操作步驟操作步驟 貯液及凝膠溶液的配制貯液及凝膠溶液的配制貯液及凝膠溶液的配制方法如下表。貯液及凝膠溶液的配制方法如下表。貯液及凝膠溶液的配制貯液及凝膠溶液的配制貯 液20mL凝膠溶液混合比 5%凝膠 10%凝膠I Acr 30g凝膠貯液 Bis 0.8g 加蒸餾水到100ml凝膠緩沖液 SDS 0.2g 加0.2mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖液至 100mlTEMED 蒸餾水100g/L過(guò)硫酸銨 過(guò)硫酸銨1g 加蒸餾水至10ml3.33ml10ml35 l4.57ml以上溶液混合后抽氣10min0.1ml6.67ml10ml35 l1.23ml0.1ml 操作方法操作方法1.安

16、裝夾心式垂直板電泳槽 (1)裝上貯槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。(2)將長(zhǎng)、短玻璃板分別插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。(3)將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對(duì)上貯槽。(4)將下貯槽的銷孔對(duì)準(zhǔn)已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽，雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽。(5)豎直電泳槽，在長(zhǎng)玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂(糖)中應(yīng)避免有氣泡。SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)1.安裝膜具裝封膠條，注意封膠條平面朝下，不能有裂口蓋上凹玻璃將凹玻璃沖外裝進(jìn)槽里將楔子插進(jìn)，將底部插緊 2.制備凝膠板制備凝膠板 將混合后的分離膠溶液

17、，用細(xì)長(zhǎng)頭的滴管加至長(zhǎng)、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1 cm。用1 mL注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水(約34 mm)，用于隔絕空氣，使膠面平整。約30-60 min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。將上、下貯槽的蒸餾水倒去，將混合均勻后的濃縮膠溶液，用細(xì)長(zhǎng)頭的滴管加到長(zhǎng)、短玻璃板的窄縫內(nèi)(即分離膠上方)，距短玻璃上緣0.5 cm處，輕輕加入樣品槽模板.在上、下貯槽中加入蒸餾水，但不能超過(guò)短玻璃板上緣。靜置電泳槽，10 min左右，上膠即可聚合，再放置10-20 min，加入電極緩沖液，使液面沒(méi)過(guò)短玻璃板約0.5 cm，輕輕取出樣品槽模

18、板，即可加樣。n 配制凝膠溶液配制凝膠溶液n灌膠，加到頂部，來(lái)回傾斜去氣泡灌膠，加到頂部，來(lái)回傾斜去氣泡插入梳子膠凝后用夾子將玻璃夾出用夾子夾緊玻璃將封膠條輕輕撕掉旋轉(zhuǎn)180度，凹玻璃向里將玻璃放進(jìn)槽內(nèi)加緩沖液樣品制備樣品制備n一般是蛋白質(zhì)溶解在含10g/L SDS、10g/L巰基乙醇的0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液中，在100加熱25min。蛋白質(zhì)的最后濃度一般為0.051g/L。n也可以將上述溶液在37保溫2h而不是100加熱。一般說(shuō)來(lái)，兩種處理的效果都一樣。但如蛋白質(zhì)樣品中混有少量蛋白水解酶，37處理就會(huì)引起樣品水解，使測(cè)定失敗，而100加熱3min一般都能使蛋白酶失活，得

19、到滿意的結(jié)果。也有少數(shù)例外的情況，需要采用特殊的樣品處理方法。樣品的處理及加樣樣品的處理及加樣 將樣品按0.51 mg/mL加樣品溶解液，溶解后，將其轉(zhuǎn)移到帶塞的小離心管中，輕輕蓋上蓋子(不要塞緊，以免加熱時(shí)迸出)，在100沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。用微量進(jìn)樣器取10 l上述混合液，通過(guò)緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。加 樣5.電泳電泳 將電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接，接通冷卻水，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，開(kāi)始時(shí)電流為10 mA，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電流調(diào)至20-30 mA，當(dāng)溴酚藍(lán)染料距硅膠框1 cm時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電源及冷卻水。6.染色與脫色染色與脫色電泳結(jié)束后

20、，取下凝膠模，卸下硅膠框，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開(kāi)短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記，在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記。加入染色液染色1-2 h，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對(duì)遷移率。剝 膠7.結(jié)果處理量出加樣端距細(xì)銅絲間的距離(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率mR:相對(duì)遷移率mR=蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)樣品溶解液：0.01mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1%SDS，1%巰基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚藍(lán)。用來(lái)溶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及待測(cè)蛋白質(zhì)樣品。配制方法如下：S

21、DS 100mg 巰基乙醇 0.1ml 甘油 1ml 溴酚藍(lán) 2mg 0.2mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖液 0.5ml 加蒸餾水至總體積 10ml電極緩沖液：0.1%SDS，0.1mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖液。配制方法：取1gSDS，加入500ml 0.2mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖液，用蒸餾水定容至1000ml。染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250，加入50%甲醇水溶液454ml和冰乙酸46ml。脫色液：75ml冰乙酸，875ml蒸餾水與50ml甲醇混合。蛋白質(zhì)印跡分析技術(shù)蛋白質(zhì)印跡分析技術(shù)(Western Blotting)(Western Blotting)一、目的要求一

22、、目的要求 應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡分析技術(shù)，分析經(jīng)SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上的細(xì)胞特定蛋白成分。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理n SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)電轉(zhuǎn)移固定在固相支持物（如：硝酸纖維素薄膜）上，固相支持物以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)。n然后，以固相支持物上的蛋白質(zhì)作為抗原，與相應(yīng)的抗體，即第一抗體起免疫反應(yīng)，再與酶、同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的以第一抗體為抗原的第二抗體起反應(yīng)，采用底物顯色或放射自顯影等方法即可觀察分析電泳分離的特異蛋白質(zhì)成分。標(biāo)記的二抗一抗蛋白膜免疫印跡實(shí)驗(yàn)包括免疫印跡實(shí)驗(yàn)包括5個(gè)步驟：個(gè)步驟：1、固定固定：蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE

23、），并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（Nitrocellulose，簡(jiǎn)稱NC）簿膜上。2、封閉封閉：用牛血清白蛋白或脫脂奶粉封閉膜，主要目的是為了減少特異抗體對(duì)膜上其它部位的非特異性吸附。3、第一抗體結(jié)合第一抗體結(jié)合：是特異性的。4、第二抗體結(jié)合第二抗體結(jié)合：對(duì)于第一抗體是特異性的并作為指示物。5、被適當(dāng)保溫后的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)條帶，產(chǎn)生可見(jiàn)的、不溶解狀態(tài)的顏色反應(yīng)。Western blot三、操作步驟三、操作步驟先從玻璃板內(nèi)取出凝膠，將凝膠在電轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡一下（先把Whatman 3MM濾紙及硝酸纖維素薄膜在電轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡10分鐘），按照下圖所示夾心方法把Whatman 3MM濾紙、凝膠、硝酸纖維素

24、薄膜、石墨板依順序放好，操作時(shí)注意驅(qū)趕氣泡。電轉(zhuǎn)移條件為常溫1Am/cm2 恒流約1.5 hr。15層濾紙凝膠15層濾紙NC膜石墨板石墨板（1）蛋白質(zhì)電泳常用SDS-PAGE：?jiǎn)我粊喕M成的蛋白質(zhì)非變性PAGE：多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì)Tris-Tricine膠中電泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因?yàn)槭稚系挠椭瑫?huì)阻斷轉(zhuǎn)印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致以適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜1530min，如果是PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。方向正確：凝膠在陰極，膜在陽(yáng)極。排去濾紙

25、、膠和膜間的氣泡。電轉(zhuǎn)時(shí)間：100V 1-2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活 選擇轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率。膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置。（2）轉(zhuǎn)膜）轉(zhuǎn)膜（3）封閉）封閉用5脫脂奶粉或3BSA （含（含0.1Tween20 TBS或或PBS配制）配制）時(shí)間：室溫2h或4C過(guò)夜（4）顯色或顯影）顯色或顯影顯色 辣根過(guò)氧化物酶：底物為DAB 堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBT化學(xué)發(fā)光顯影化學(xué)發(fā)光顯影 最常用。辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品）注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含Tween20的的TBS或或PBS洗滌一次洗滌一次 曝

26、光的時(shí)間和顯影的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定曝光的時(shí)間和顯影的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用Stripping Buffer洗滌后（洗滌Buffer:62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2SDS和100mm的 2ME）用不同的一抗進(jìn)行雜交，檢測(cè)其它蛋白的表達(dá)情況。一張膜可以重復(fù)使用34次。堿性磷酸酶顯色的膜不能再進(jìn)行雜交堿性磷酸酶顯色的膜不能再進(jìn)行雜交（5）膜的再利用）膜的再利用（四）免疫學(xué)檢測(cè)（四）免疫學(xué)檢測(cè) 1、將轉(zhuǎn)移好的硝酸纖維素薄膜于ddH20中浸洗數(shù)次，取1毫升10倍濃度的麗春紅S溶液，加9毫升的ddH2O混勻，于一相當(dāng)于膜大小的染色皿中，小心將薄膜轉(zhuǎn)移于染色皿內(nèi)，

27、其內(nèi)輕搖動(dòng)染色液，染色3-10 min。然后倒棄染色液，加入少許ddH2O漂洗數(shù)次，用鉛筆標(biāo)出分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶與陽(yáng)性對(duì)照條帶。2、用ddH2O漂洗后，將硝酸纖維素薄膜置于封閉緩沖液，室溫封閉:37反應(yīng)約0.5 hr，以封閉未吸附蛋白的部位。3、取出膜，將硝酸纖維素薄膜與用封閉緩沖液適當(dāng)稀釋的第一抗體37反應(yīng)約0.5 hr，其間不停地在搖床上晃動(dòng)。4、取出膜，將硝酸纖維素薄膜在清洗緩沖液中晃動(dòng)清洗30分鐘，每5 min換一次清洗緩沖液，5、取出膜，將硝酸纖維素薄膜與用封閉緩沖液適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)記第二抗體37反應(yīng)約0.5 hr，其間不停地在搖床上晃動(dòng)。6、用50mM Tris-HCl pH6.8清洗3次。7、加入DAB溶液，顯色510min，出現(xiàn)棕色帶者為陽(yáng)性，用自來(lái)水沖洗以終止酶的反應(yīng)。保存硝酸纖維素薄膜或拍照作記錄。四、結(jié)果四、結(jié)果如果所檢測(cè)特異性蛋白存在，則會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)條帶。五、應(yīng)用意義五、應(yīng)用意義Western blotting是用于分離蛋白質(zhì)的一種成熟的方法，它廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)特征和結(jié)構(gòu)的研究。