葡萄球菌的快速檢測(cè)方法研究分析 生物技術(shù)專業(yè)

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1、 葡萄球菌的快速檢測(cè)方法研究 摘 要 金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) 在 1884年首次被發(fā)現(xiàn)，Rosenbach 在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出葡萄球菌，并在同年記錄了它能引起食物中毒。1930年，研究人員又明確指出金黃色葡萄球菌引起食物中毒與其產(chǎn)生的腸毒素有關(guān)，據(jù)估計(jì)，進(jìn)食者攝入約100ng 的腸毒素 A 即可出現(xiàn)中毒癥狀。典型的金黃色葡萄球菌呈球型，直徑為 0.8μm 左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀，無(wú)芽胞、鞭毛，大多數(shù)也無(wú)莢膜，屬于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。目前，隨著國(guó)際食品貿(mào)易不斷發(fā)展，食品中致病微生物檢測(cè)方法的研究也在不斷向前發(fā)展，除了傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法之外，近年

2、來(lái)，人們采用免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行了食品中致病微生物快速檢測(cè)方法的研究。對(duì)于金黃色葡萄球菌也不例外，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要采用細(xì)菌分離培養(yǎng)及生化鑒別，免疫學(xué)方法( 如: 酶聯(lián)免疫、免疫轉(zhuǎn)印、乳膠凝集等方法) 因其快速、操作簡(jiǎn)便，逐步應(yīng)用于食品衛(wèi)生檢測(cè)。但新的分子生物學(xué)技術(shù)已顯示出其在食品衛(wèi)生檢測(cè)方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本文主要針對(duì)這四種快速檢測(cè)方法展開一系列地研究。 關(guān)鍵詞：食品；金黃色葡萄球菌；快速檢測(cè)方法 ? Methods of the rapid detection of Staphylococcus aureus ABSTRACT

3、 Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) was first discovered in 1884，Rosenbach in the solid culture medium Staphylococcus， and in the same yearrecorded it can cause food poisoning. In 1930， the researchers pointed out thatdue to Staphylococcus aureus enterotoxin food poisoning and its produci

4、ng，according to estimates， food intake of about 100ng enterotoxin A can appearpoisoning symptoms. Typical S.aureus is ball shape， diameter of about 0.8 μ m， microscope arranged thyrsoid， non spore forming， flagella， most non capsule， belonging to the gram positive bacteria. At present， with the cont

5、inuous development of international food trade， pathogenic microorganism detection methods in food is also in constant development， in addition， traditional training methods in recent years， people adopt advanced technology in immunology， biochemistry and molecular biology were studied for the rapid

6、 detection of pathogenic microorganism in food. There is no exception for Staphylococcus aureus， traditional detection methods of bacterial isolation culture and identification of the biochemical， immunological methods (such as: ELISA， Western blot， latex agglutination method etc.) because of its fa

7、st， simple operation， and gradually applied to the detection of food hygiene. But the new techniques of molecular biology has shown its unique advantages in the aspects of food hygiene detection. This paper mainly launches a series of studies on the four kinds of rapid detection methods. Key Words:

8、 food，Staphylococcus aureus， rapid detection method 目 錄 摘 要 1 第1章 緒論 2 1.1 研究背景 2 1.2 研究意義 3 1.3 研究?jī)?nèi)容 3 1.4 研究方法 3 第2章 金黃色葡萄球菌簡(jiǎn)介 5 2.1金黃色葡萄球菌生物學(xué)特征 5 2.2金黃色葡萄球菌的致病性 5 2.3金黃色葡萄球菌的流行病學(xué) 5 2.4金黃色葡萄球菌的耐藥性分析 6 第3章 食品中金黃色葡萄球菌常用的檢測(cè)方法 7 3.1傳統(tǒng)的檢測(cè)方法 7 3.2免疫學(xué)檢測(cè)方法 7 3.3以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢

9、測(cè)方法 7 3.4商業(yè)化快速檢測(cè)方法 8 第4章 金黃色葡萄球菌四種檢測(cè)方法的案例及分析 9 4.1傳統(tǒng)的檢測(cè)方法案例分析 9 4.2免疫學(xué)檢測(cè)方法案例分析 9 4.3以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法案例分析 9 4.3.1 材料與方法 9 4.3.2 結(jié)果與分析 13 4.3.3 討論 15 4.4商業(yè)化快速檢測(cè)方法案例分析 16 4.4.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備 16 4.4.2試驗(yàn)及分析方法 17 第5章 結(jié)論 20 謝 辭 21 參考文獻(xiàn) 22 第1章 緒論 1.1 研究背景 金黃色葡萄球菌是一類廣泛存在于自然界的空氣、水、土壤以及人類和動(dòng)物的排

10、泄物中的革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件的要求不高。在非芽孢菌中，金黃色葡萄球菌對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力最強(qiáng)。金黃色葡萄球菌因?yàn)槠浞置诘亩舅睾颓忠u性酶而引起食物中毒，如殺白細(xì)胞素、腸毒素、溶血毒素、血漿凝固酶和脫氧核糖核酸酶都是其分泌的毒素和侵襲性酶。食品在生產(chǎn)銷售的過(guò)程中，由于其加工前自身帶菌，加工過(guò)程中被污染，包裝密封不嚴(yán)格，生產(chǎn)或銷售人員帶菌以及在運(yùn)輸過(guò)程中都可能受到該菌的污染。人一旦食用了被金黃色葡萄球菌污染的食物后極易引起食物中毒，會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等急性胃腸炎癥狀，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致死亡。在我國(guó)的細(xì)菌性食物中毒事件中，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占四分之一，居于第四位。在美國(guó)，每年也有超

11、過(guò)十八萬(wàn)的人由于食用了被金黃色葡萄球菌污染的食物而中毒，其中約百分之一需要住院，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在歐盟國(guó)家，1993~1998 年之間由于金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性疾病的 4.5%。有關(guān)日本的調(diào)查結(jié)果顯示，大約三分之一的食品存在被金黃色葡萄球菌污染的可能。根據(jù)美國(guó) CDC 的調(diào)查報(bào) 告顯示，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的三分之一，僅次于大腸埃希氏菌，位居第二位。而加拿大的金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的 45%。由此可見，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒已呈現(xiàn)出全球的分布狀態(tài)，已經(jīng)成為世界公共衛(wèi)生的一個(gè)重要問(wèn)題。 隨著人們生活水平的提高，對(duì)食品安全問(wèn)

12、題的關(guān)注也日益增加，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者也致力于食品中致病菌的快速檢測(cè)的研究。目前，金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)平板方法的改進(jìn)，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的核酸探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)以及以免疫學(xué)理論為基礎(chǔ)的免疫磁珠技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)、乳膠凝集技術(shù)、免疫熒光技術(shù)(IFA)。 傳統(tǒng)檢測(cè)方法的改進(jìn)方法雖然成本較低，有較強(qiáng)的敏感性，但是檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，操作比較繁瑣。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)和以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法雖然檢測(cè)時(shí)間短，但是檢測(cè)費(fèi)用較高，靈敏性也相對(duì)較低，同時(shí)，某些檢測(cè)方法對(duì)試驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)人員的操作要求較高，不能得到普及。因此，如何建立一種快速

13、、操作簡(jiǎn)便、靈敏性高且經(jīng)濟(jì)的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外微生物研 究工作者的重要課題。 隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的普及，計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)在近幾十年內(nèi)也得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域涉及工業(yè)生產(chǎn)、氣象觀察、醫(yī)療診斷以及國(guó)防等多個(gè)方面。也推動(dòng)了其在生物、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域煩的發(fā)展應(yīng)用，如計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)在農(nóng)業(yè)中主要應(yīng)用于農(nóng)副產(chǎn)品的分級(jí)和品質(zhì)檢驗(yàn)、監(jiān)測(cè)農(nóng)作物的生長(zhǎng)狀況、以及農(nóng)作物病蟲害的防治等方面。也有研究學(xué)者將其用于檢測(cè)微生物，如Saurabh Kumar、Gauri S. Mittal把熒光染色技術(shù)和計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)相結(jié)合，用于檢測(cè)病原菌。孫鐘雷 等人將顯微圖像處理技術(shù)應(yīng)用于啤酒中酵母

14、菌總數(shù)的檢測(cè)。在微生物的自動(dòng)分類識(shí)別中，相對(duì)于人工肉眼識(shí)別，計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)可以減少誤差，能夠快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)食品中的微生物。 2009年10月1日21時(shí)30分，烏海市某酒店多位客人在該酒店就餐后陸續(xù)出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛癥狀，在烏海市人民醫(yī)院接受治療，懷疑食物中毒。接到報(bào)告后，烏海市疾控中心組織專業(yè)人員會(huì)同市衛(wèi)生監(jiān)督所監(jiān)督人員，立即對(duì)此事件進(jìn)行了調(diào)查處理，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。 根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室結(jié)果分析，依據(jù)GBl4938—1994《食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)及技術(shù)處理總則》，可以判定這是一起食用被金黃色葡萄球菌污染的食物引起的細(xì)菌性食物中毒。 乾佳酒店婚宴菜品中鴨胸、夫妻肺片、

15、雞胗、肘花4種菜品為熟肉制品，屬于我國(guó)最容易引發(fā)葡萄球菌食物中毒的食品之一。金黃色葡萄球菌食物中毒流行病學(xué)特點(diǎn)為發(fā)病急，潛伏期一般為2-4 h。本次食物中毒13名患者中有4人發(fā)病潛伏期為2～4 h，6人發(fā)病潛伏期為10—12 h。金黃色葡萄球菌食物中毒的臨床表現(xiàn)為惡心、劇烈的反復(fù)嘔吐、腹痛、腹瀉等胃腸道癥狀。本次食物中毒13名患者的臨床表現(xiàn)與之基本相符。從中毒食品中經(jīng)培養(yǎng)檢出金黃色葡萄球菌(且前，烏海市疾控中心沒有能力開展菌株的腸毒素檢測(cè))。由于參加9月30日晚夜坐而未參加lo月1日中午婚宴的人員共5人，均未發(fā)病，因此可以確定中毒餐次為中餐。鴨胸、夫妻肺片、雞胗、肘花4種菜品檢出金黃色葡萄球菌

16、，因此可確定中毒食品。 1.2 研究意義 隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)食品質(zhì)量安全的要求日益增強(qiáng)，由于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在諸多的不足，因此，研究一些操作方便、檢測(cè)效率高、經(jīng)濟(jì)成本低、高準(zhǔn)確度并且便于基層企業(yè)單位應(yīng)用的微生物快速檢測(cè)方法就顯得尤為必要，這對(duì)整個(gè)食品行業(yè)來(lái)說(shuō)可以實(shí)現(xiàn)微生物的及時(shí)檢測(cè)，降低出廠后由于食品中微生物指標(biāo)不合格帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，減少其經(jīng)濟(jì)損失，具有重要的社會(huì)意義。作為條件致病菌的金黃色葡萄球菌由于廣泛存在于自然界中，因此食品受其污染的可能性很高，一旦食品受其污染后，在適宜的條件下會(huì)迅速增殖，并產(chǎn)生多種致病毒素，人一旦食用了這種被污染的食物，極易引起食物中毒。而目前由于

17、金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事例也屢見不鮮。通過(guò)上述對(duì)金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法的分析可知，目前的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法中沒有一種檢測(cè)方法同時(shí)具備檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)成本低、檢測(cè)準(zhǔn)確性高且檢測(cè)限低的條件。因此，研究尋找一種金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法對(duì)食品的衛(wèi)生控制具有重大的實(shí)際性意義。 1.3 研究?jī)?nèi)容 本文共分為四個(gè)部分 第一部分為緒論。提出該課題的研究背景、研究意義，對(duì)本文的研究?jī)?nèi)容做了大致地介紹。 第二部分為金黃色葡萄球菌簡(jiǎn)介，主要包括如下內(nèi)容，即金黃色葡萄球菌生物學(xué)特征、金黃色葡萄球菌的致病性以及金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)。 第三章為食品中金黃色葡萄球菌常用的檢測(cè)方法，主要包括以

18、下四種檢測(cè)方法，分別為傳統(tǒng)的檢測(cè)方法、免疫學(xué)檢測(cè)方法、以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法、商業(yè)化快速檢測(cè)方法。 第四部分為金黃色葡萄球菌四種檢測(cè)方法的案例及分析。對(duì)金黃色葡萄球菌四種檢測(cè)方法的案例進(jìn)行了介紹，并且做出分析。 1.4 研究方法 本文主要采用的研究方法為文獻(xiàn)資料法和對(duì)比分析法。 文獻(xiàn)資料法。本文查閱了大量相關(guān)的文獻(xiàn)，并且從中提煉出比較有用的觀點(diǎn)。 對(duì)比分析法。對(duì)食品中金黃色葡萄球菌常用的四種檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比分析。 第2章 金黃色葡萄球菌簡(jiǎn)介 2.1金黃色葡萄球菌生物學(xué)特征 金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬的一種，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌。直徑為 0.8~1.5μm

19、，金黃色葡萄球菌無(wú)鞭毛、芽胞，少部分有莢膜，不能運(yùn)動(dòng)。為需氧或兼性厭氧菌。最適宜的生長(zhǎng)溫度為 37℃，PH 值為 7.4。金黃色葡萄球菌具有高度的耐鹽性，在高鹽培養(yǎng)基中可以良好的生長(zhǎng)。金黃色葡萄球菌還可以分解乳糖、麥芽糖、蔗糖、核糖、松二糖、甘露糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。其可以分解甘露醇，還可以產(chǎn)生溶血物質(zhì)，因此在血平板上培養(yǎng)會(huì)產(chǎn)生溶血環(huán)。其產(chǎn)生的血漿凝固酶可以使血漿產(chǎn)生凝固，這也是金黃色葡萄球菌區(qū)別于其他葡萄球菌的的主要性質(zhì)。還可以還原硝酸鹽，產(chǎn)生脂酶和卵磷脂酶，因此在 Baird-Parker 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌可以在菌落周圍產(chǎn)生沉淀環(huán)和透明圈。金黃色葡萄球菌在一般的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中就可以良好的生

20、長(zhǎng)，但是只有當(dāng)生長(zhǎng)條件如營(yíng)養(yǎng)成分、溫度水分活度、pH 等條件適宜的情況下才會(huì)產(chǎn)生腸毒素，而腸毒素的產(chǎn)生是導(dǎo)致食物中毒的原因。金黃色葡萄球菌抵抗外屆不良環(huán)境的能力很強(qiáng)，在 80℃條件下加熱達(dá)到 30min 才能使其死亡。 2.2金黃色葡萄球菌的致病性 金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生多種毒素，這也是金黃色葡萄球菌導(dǎo)致食物中毒的原因，其分泌的毒素經(jīng)過(guò)血清學(xué)鑒定包括 14 種，其中 SEA 和 SED 是細(xì)菌性食物中毒中最常見的腸毒素，其次是 SEB、SEC。當(dāng)人體攝入幾微克的腸毒素就可以導(dǎo)致食物中毒。同時(shí)金黃色葡萄球菌還能產(chǎn)生α、β、γ、δ四種溶血毒素、這些溶血毒素可以導(dǎo)致血小板和溶酶體損傷，殺白細(xì)胞素

21、、血漿凝固酶、表皮剝落毒素、毒性休克綜合征毒素-1 等多種致病性毒素。有的毒素可以導(dǎo)致人的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的損壞，有的可以導(dǎo)致血液中的纖維蛋白沉積，這些均可以導(dǎo)致人體治病。此外，在人類的化膿感染致病菌中，金黃色葡萄球菌是最常見的致病菌。金黃色葡萄球菌甚至還可以引起人類的化膿感染，肺炎、心包炎等多種疾病。 2.3金黃色葡萄球菌的流行病學(xué) 在自然界的空氣、水、土壤以及人類和動(dòng)物的排泄物中均廣泛的存在著金黃色葡萄球菌，在健康人的鼻腔、咽喉，頭發(fā)上也有發(fā)現(xiàn)，因此，食品如果在生產(chǎn)銷售環(huán)節(jié)中由于生產(chǎn)者操作不當(dāng)均有可能導(dǎo)致金黃色葡萄球菌污染。由于春夏季的氣溫和濕度都很高，金黃色葡萄球菌在這種環(huán)境下可以

22、大量繁殖，容易導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的季節(jié)性分布。容易受金黃色葡萄球菌污染的食物種類繁多，其中以肉類制品、蛋類制品以及乳類食品為主。含乳的冷凍制品次之。 由于金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的食物中毒事件受到全球的關(guān)注，經(jīng)過(guò) ICMSF（國(guó)際食品微生物規(guī)格委員會(huì)）的危害度評(píng)估，金黃色葡萄球菌被列為中度直接局部傳播性病原菌。日本對(duì)金黃色葡萄球菌的危害性評(píng)估結(jié)果與 ICMSF 的評(píng)估結(jié)果相同。 2.4金黃色葡萄球菌的耐藥性分析 近年來(lái)，隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢出率有增高的趨勢(shì)。上海地區(qū)1985~1986年，MR-SA分離率為24%，1993~1994年分離率為60%，2001~200

23、5年平均分離率為89%。廣州地區(qū)2000年分離率為50.8%，2003年分離率達(dá)70.8%。任南等監(jiān)測(cè)全國(guó)城市79家醫(yī)院顯示，MRSA分離率為79.93%。江華等收集并分析了本院2009~2010年101株金黃色葡萄球菌的耐藥情況，為臨床合理使用抗菌藥物提供參考。此次本院分離出的101株金黃色葡萄球菌中MRSA占20.79%，提示本院細(xì)菌耐藥情況控制得相對(duì)較好。101株金黃色葡萄球菌中，青霉素和氨芐西林的耐藥率分別為80.2%和77.23%，表現(xiàn)出高耐性。對(duì)利奈唑胺100%敏感。MRSA與MSSA對(duì)氯霉素、氯潔霉素、頭孢唑林、環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、亞胺培南、左氧氟沙星、苯唑西林、青霉素、

24、利福平、甲氧芐啶/磺胺甲基異噁唑、四環(huán)素、氨芐西林和阿莫西林/克拉維酸的耐藥率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。金黃色葡萄球菌除對(duì)青霉素和氨芐西林表現(xiàn)出高耐藥性外，體外抗菌活性均較好，尤其是利奈唑胺耐藥率為0，可作為臨床用藥參考依據(jù)。 第3章 食品中金黃色葡萄球菌常用的檢測(cè)方法 3.1傳統(tǒng)的檢測(cè)方法 食品中金黃色葡萄球菌的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法多采用平板計(jì)數(shù)法，我國(guó)食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)是以 GB4789.10-2010 為依據(jù)。該標(biāo)準(zhǔn)分為兩個(gè)部分，一是定性檢

25、測(cè)，二是定量檢測(cè)。定性檢測(cè)是將待檢樣品于無(wú)菌環(huán)境中接種到 7.5%氯化鈉肉湯或者 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯，在適宜溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后再將混合培養(yǎng)物劃線接種到血平板或者和 Baird-Parker 平板上，培養(yǎng)后觀察其特征，最后通過(guò)鏡檢和血漿凝固酶試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。而定量檢測(cè)采用的是將樣品直接做10 倍系列稀釋液，然后選擇適宜稀釋度的樣品接種到 Baird-Parker 平板上，在適宜的環(huán)境中培養(yǎng)一定時(shí)間，然后進(jìn)行典型菌落的計(jì)數(shù)。另外一種定量檢測(cè)方法是將稀釋好的三個(gè)梯度的稀釋液分別接種于 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯中，每個(gè)梯度平行做 3 管，培養(yǎng)一定時(shí)間后在轉(zhuǎn)接到 Baird-Parker 平板

26、上進(jìn)行再培養(yǎng)，然后對(duì)典型菌落進(jìn)行確認(rèn)，通過(guò)查 MPN 表進(jìn)行金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)。金黃色葡萄球菌的腸毒素可以通過(guò) ELISA 檢測(cè)試劑盒對(duì) A、B、C、D、E型腸毒素進(jìn)行檢測(cè)。 國(guó)標(biāo)法檢測(cè)金黃色葡萄球菌準(zhǔn)確，操作人員無(wú)需進(jìn)行特殊的培訓(xùn)，但是也因?yàn)樵摲ǖ臋z測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，整個(gè)過(guò)程需要 4-5 天，這就限制了其在食品工業(yè)生產(chǎn)實(shí)時(shí)檢測(cè)中的應(yīng)用。因此，尋找一種快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確性高的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法就成了時(shí)下研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者在致病微生物的快速檢測(cè)上取得了可喜的成果。 3.2免疫學(xué)檢測(cè)方法 盡管免疫學(xué)方法目前運(yùn)用的較為廣泛，但對(duì)于一些新近出現(xiàn)的腸毒素，如：SEG、SEH、SE

27、I、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN 和 SEO 等，目前還沒有商業(yè)化的檢測(cè)系統(tǒng)。這樣一來(lái)，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的方法就發(fā)揮著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 3.3以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法 隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，在病原微生物檢測(cè)和研究方面，PCR 技術(shù)成了除上述方法之外的很好選擇。PCR 技術(shù)具有快速，特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)限低以及可以成為自動(dòng)化的趨勢(shì)等優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)方法相比，PCR 的這些優(yōu)點(diǎn)不斷地鼓舞著人們?nèi)ナ褂煤脱芯?。PCR 在食品微生物診斷和食源性疾病鑒定應(yīng)用上有許多文獻(xiàn)報(bào)道?；?PCR 的基本原理，許多學(xué)者充分發(fā)揮創(chuàng)造性思維，對(duì) PCR 技術(shù)進(jìn)行研究和改進(jìn)，使 PCR 技術(shù)得到了

28、進(jìn)一步完善。例如，在一個(gè)反應(yīng)管中使用多套引物，針對(duì)多個(gè) DNA 模板或同一模板的不同區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的過(guò)程稱之為多重PCR，可以滿足同時(shí)分析不同 DNA 序列的需要，尤其是在致病菌的檢測(cè)和科學(xué)研究時(shí)，在一個(gè)反應(yīng)管中能夠同時(shí)檢測(cè)多種目標(biāo) DNA，不僅能夠節(jié)省實(shí)驗(yàn)樣品，而且能使以往繁瑣的操作變得省時(shí)省力。PCR技術(shù)的另一個(gè)飛躍是熒光 PCR，這項(xiàng)技術(shù)由美國(guó)Applied Biosystems 公司于 1995 年推出，不僅實(shí)現(xiàn)了PCR 從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī) PCR 相比，特異性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高，并能有效解決 PCR 污染問(wèn)題，目前已得到較為廣泛的應(yīng)用。熒光 PCR 技術(shù)是指在普通 PCR

29、 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累檢測(cè)整個(gè) PCR 反應(yīng)進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量的一種方法。熒光 PCR技術(shù)在常規(guī) PCR 基礎(chǔ)上，添加了一條標(biāo)記有兩個(gè)熒光基團(tuán)的探針。一個(gè)標(biāo)記在探針的 5’端，稱為熒光報(bào)告基團(tuán)（ R） ；另一個(gè)標(biāo)記在探針的 3’端，稱為熒光抑制基團(tuán)（ Q） 。兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，即 5’端熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光可被 3’端的熒光抑制基團(tuán)吸收或抑制。當(dāng)二者距離較遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用消失，報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)增強(qiáng)，這就是熒光共振能量遷移（ FRET，F(xiàn)luorescent Resonance Energy Transfer） 原理。 熒光信號(hào)與 PCR 產(chǎn)物同

30、比增長(zhǎng)，隨 PCR 產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)，熒光 PCR 方法就是利用此原理，在 PCR 反應(yīng)過(guò)程中連續(xù)不斷地檢測(cè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的變化。熒光 PCR 檢測(cè)體系常用的熒光探針基本分為三種類型：TaqMan 探針、分子信標(biāo)（ molecular beacon）和熒光雜交探針。熒光 PCR 集擴(kuò)增和檢測(cè)于一體，直接閉管測(cè)定，無(wú)須分離和沖洗，操作簡(jiǎn)便快速，容易自動(dòng)化，杜絕了產(chǎn)物污染源，并采用實(shí)時(shí)檢測(cè)，大大提高了定量的準(zhǔn)確性。 PCR 技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌所選用的靶基因主要有：腸毒素基因（ sea，seb，sec，sed，see，seg，seh，sei，sej） ；耐熱核酸酶基因（ nuc） ；凝固酶

31、基因（ coa）；抗性 基 因 （ mecA，femA，ermA，ermB，ermC，ereA，ereB，aacA－aphD，tetK，tetM，vatA，vatB，vatC 等） ；16SrRNA 基因；影響生物被膜形成基因，如 icaADBC等。用于食品中檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靶基因主要是腸毒素基因和耐熱核酸酶基因（ nuc） ，耐熱核酸酶基因具有特異性好的特點(diǎn)，自從 PCR 技術(shù)誕生，人們就一直應(yīng)用 nuc 基因來(lái)檢測(cè)金黃色葡萄球菌。文獻(xiàn)報(bào)道 1991 年 PCR 技術(shù)開始用于金黃色葡萄球菌檢測(cè)，當(dāng)時(shí) Wilson 首次根據(jù) entB、entC1 和 nuc 基因序列檢測(cè)金黃色葡萄球菌。1

32、992 年，Brakstad 根據(jù) nuc 基 因 檢 測(cè) 金黃 色 葡 萄 球 菌。1993 年，Chesneau 報(bào)道了利用耐熱核酸酶基因特異性檢測(cè)金黃色葡萄球菌。1996 年，Piotr 等人根據(jù) nuc 基因和 mecA 基因，應(yīng)用多重 PCR 快速檢測(cè)抗甲氧西林的金黃色葡萄球菌。1997 年，Saruta 等應(yīng)用巢式PCR 對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速檢測(cè)和分型。 2000 年以后，多重 PCR 檢測(cè)技術(shù)和實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù)在金黃色葡萄球菌檢測(cè)中發(fā)揮著重要的作用，如:Tamarapu 發(fā)展了多重 PCR 檢測(cè)乳制品中的金黃色葡萄球菌；Chen 等應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)奶中的金黃

33、色葡萄球菌；Fischer 等應(yīng)用定量實(shí)時(shí) PCR 和免疫方法相結(jié)合檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素。由此可見，利用多重 PCR 和實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)是檢測(cè)金黃色葡萄球菌的發(fā)展趨勢(shì)。 3.4商業(yè)化快速檢測(cè)方法 隨著研究的深入，許多快速檢測(cè)方法已經(jīng)商品化，這些新的快速檢測(cè)系統(tǒng)縮短了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的時(shí)間，而且能夠較快得到檢測(cè)結(jié)果，操作相對(duì)簡(jiǎn)單。利用生理生化的特性制造的試劑盒，如法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的 RPF 試劑盒和 API 檢測(cè)系統(tǒng)等。利用免疫分析法和免疫熒光法制造的檢測(cè)試劑盒，如Staphylococcus VIA( TECRA) 、Staphylococcus ET VIA( TECRA ) 、

34、Staphylase ( Oxoid ) 、VIDAS － ST ET( bioMerieux Vitek) 和 Transia Tube SET test( GENE－TRAK) 等。利用免疫膠乳微粒凝集實(shí)驗(yàn)發(fā)展起來(lái)的快速檢測(cè)試劑盒，如 SET－RPLA( Unipath Ltd.) 、Staph－Rapid Test( Roche，Basel) 、Staphylex( Unipath Ltd.) 、Slidex Staph kit ( bioMerieux Vitek ) 、StaphylococcusLatex ( HardyDiagnostics ) 、Monostaph ( Bion

35、or A / S.) 、Rida － Screen ( R － Biopharm GmbH Darmstadt.) 、DRYSPOT Staphytect Plus ( Oxoid ) 、 Staphytect( Oxoid) 、Slide Agglutination test( Becton Dickinson) 。基于 DNA 檢測(cè)的試劑盒也已誕生，如：Accuprobe S.aureus( GenProbe Inc.) 、GENE － TRAK Colorimetric( GENE － TRAK ) 和 TAQMAN ( PE AppliedBiosystems) 。這些方法操作簡(jiǎn)單但

36、檢測(cè)成本十分昂貴，我國(guó)極少擁有自己的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，因此研究開發(fā)具有我國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的快速自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)是國(guó)內(nèi)科學(xué)工作者的研究重點(diǎn)。 第4章 金黃色葡萄球菌四種檢測(cè)方法的案例及分析 4.1傳統(tǒng)的檢測(cè)方法案例分析 傳統(tǒng)和標(biāo)準(zhǔn)的食品微生物學(xué)分析( GB 4789.10－2010)金黃色葡萄球菌主要依賴于前增菌培養(yǎng)、分離培養(yǎng)、菌落形態(tài)觀察和一系列的生化鑒定以及血清型鑒定等步驟。如將食物樣品首先接種于 7.5%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，進(jìn)行增菌培養(yǎng) 24h，然后轉(zhuǎn)種于血平板和 Baird－Parker 平板上劃線分離培養(yǎng) 24h，再挑取 Baird－Parker 黑色的菌落進(jìn)行革蘭氏染

37、色鏡檢及血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)。血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)用新鮮兔血漿，放入小試管中，加入培養(yǎng) 24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物，振蕩搖勻，放在溫箱或水浴內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察 6h，如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為呈陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)以已知陽(yáng)性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對(duì)照。進(jìn)行腸毒素的檢測(cè)，全程需時(shí)大概 4～8d，方法繁瑣。 4.2免疫學(xué)檢測(cè)方法案例分析 金黃色葡萄球菌自身具有多種蛋白質(zhì)抗原，其中腸毒素（ 如 SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE） 和 SPA 經(jīng)常用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。以抗體為基礎(chǔ)的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法大致有 5～6種，如：酶聯(lián)免疫

38、吸附法、反向被動(dòng)膠乳凝集法、放射免疫測(cè)量法、反向血凝實(shí)驗(yàn)、顯微玻片凝膠雙擴(kuò)散法等，后幾種方法較為費(fèi)時(shí)、麻煩、靈敏度也較差，而且要求有專門的技術(shù)和工具，在使用中不易掌握和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。隨著科學(xué)的進(jìn)步，檢測(cè)手段也日益先進(jìn)，腸毒素的檢測(cè)方法日益趨于快速、簡(jiǎn)便和高靈敏。研究發(fā)現(xiàn)，改變反向膠乳凝集法中的離心重力加速度 g的作用及時(shí)間，可以很好地減少檢測(cè)時(shí)間，從原來(lái)的20～28h，減少到 4 ～6h；如果在這種方法中使用磁性顆粒和磁力來(lái)加速膠乳顆粒的沉降，將是一種很有發(fā)展前途的方法。酶聯(lián)免疫吸附法是目前新近推出的比較實(shí)用的檢測(cè)方法之一。酶聯(lián)免疫吸附法是將酶分子與抗體分子聯(lián)合結(jié)成酶標(biāo)記分子，當(dāng)與固相免疫吸附劑中

39、相應(yīng)的抗原或抗體、或抗原抗體結(jié)合物相遇時(shí)形成酶抗原－抗體結(jié)合物，加入酶底物，結(jié)合物中的酶水解底物，使無(wú)色的底物溶液生成有色的反應(yīng)產(chǎn)物。根據(jù)顏色的深淺，即可測(cè)出溶液中的抗原（或抗體） 的量。酶聯(lián)免疫吸附法又分為直接法和間接法兩種，由澳大利亞進(jìn)口的酶聯(lián)法試劑盒（TECRA） 屬間接法，用已知的抗原吸附在固相載體上，與待檢的腸毒素標(biāo)本中的抗原作用，再加入酶標(biāo)記抗同種動(dòng)物抗體的免疫球蛋白（抗抗體） ，使之與特異抗原抗體復(fù)合物中的抗體作用，加入酶底物，產(chǎn)生的顏色反應(yīng)與標(biāo)本中的腸毒素抗原量成正比。 4.3以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法案例分析 4.3.1 材料與方法 1.材料 （1） 菌種及其來(lái)

40、源 菌種接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37攝氏度，振蕩過(guò)夜培養(yǎng)至菌懸液濃度達(dá)到109CFU/ml。 供試菌種及其來(lái)源 編號(hào)No. 菌種Bacteria 來(lái)源Source 1 表皮葡萄球菌 Staphylococcus epidermids- ATCC26069 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 2 木糖葡萄球菌 Staphylococcus xylosus -ATCC29971 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 3 白色葡萄球菌 Staphylococcus albus -1.184 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心CMCC 4 中間葡萄球

41、菌 Staphylococcus intermedius- 1109 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心CMCC 5 大腸桿菌 Escherichia coli -ATCC25922 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 6 大腸桿菌 E.coli -ATCC35401 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 7 傷寒桿菌 Salmonella typhimurium -ATCC14028 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 8 傷寒桿菌 Salmonella typhimurium -5007-1 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心CMCC 9 痢

42、疾志賀氏菌 Shigella dysenteriae-1.1869 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心CMCC 10 弗氏志賀氏菌 Shigella flexneri -1.1868 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心CMCC 11 鮑氏志賀氏菌 Shigella boydii -ATCC9209 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 12 宋內(nèi)氏志賀氏菌 Shigella sonnei -ATCC9290 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 13 甲型溶血性鏈球菌 Streptococcus hemolytis-α-32205 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中

43、心CMCC 14 乙型溶血性鏈球菌 Streptococcus hemolytis-β-32204 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心CMCC 15 單核增生李斯特氏菌 Listeria monocytogenes A-TCC35152 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 16 單核增生李斯特氏菌 Listeria monocytogenes A-TCC35152 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 17 蠟樣芽孢桿菌 Bacillus cereus- ATCC11778 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 18 枯草芽孢桿菌 Bacillus s

44、ubtilis -ATCC6051 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 19 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 Yersinia enterocolitica -52001 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心CMCC 20 副溶血性弧菌 Vibrio parahaemolyticus-20001 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心CMCC 21 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus -ATCC6538 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 22 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus -ATCC6538 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中

45、心CGMCC 23 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus -1.800 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心CMCC 24 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus -1.1476 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心CMCC 25 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 26003-21 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心CMCC 26 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus -ATCC25923 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 27 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aur

46、eus -ATCC13565 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 28 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus -ATCC14458 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 29 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus -ATCC8095 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC 30 另有52株金黃色葡萄球菌 Fifty-two strains of Staphylococcus aureus 本實(shí)驗(yàn)室保存 Laboratory for Microorganism Detection Agriculura

47、l University of Hebei （2）培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、Baird-Parker培養(yǎng)基，購(gòu)自北京市陸橋技術(shù)有限公司Petrifilm RSA. Count Plate 購(gòu)自美國(guó)3M 公司；Baird-parker+RPF Agar 購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。 （3） 乳制品 全脂乳、脫脂乳和奶酪均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小? （4） 儀器及試劑10X PCR buffer、 dNTPs、 TaKaRa Taq 、DNA Marker DL2000，購(gòu)自大連寶生物工程公司；引物（正向引物，反向引物）由大連寶生物工程公司合成；溶葡萄球菌酶購(gòu)自上海高科技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇、

48、石油醚 氯仿、氨水、糖原均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。 PCR儀為Whatman T Gradient基因擴(kuò)增儀，電泳儀為北京市六一廠生產(chǎn)DXY-33A型電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)為華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司UVIpro凝膠成像系統(tǒng)。 2.方法 （1）乳制品人工污染 在人工污染金黃色葡萄球菌前 全脂乳 脫脂乳和奶酪均按國(guó)標(biāo)法檢測(cè)證實(shí)不含有金黃色葡萄球菌 1 將金黃色葡萄球菌人工污染到全脂乳和脫脂乳中 使樣品中金黃色葡萄球菌的濃度依次為 100、101、102、103、104、105、106、107、108CFU/ml 直接提取人工污染脫脂乳和全脂乳中金黃色葡萄球菌的 DNA。（2） 奶酪人工污染金黃色葡萄

49、球菌的方法為：取 20 g 奶酪在研缽中磨碎 加入 40攝氏度2%檸檬酸鈉 90 ml 混勻制成均質(zhì)液，然后對(duì)奶酪均質(zhì)液人工污染的濃度依次為 100、101、102、103、104、105、106、107、108CFU/ml 直接提取奶酪均質(zhì)液中金黃色葡萄球菌的 DNA。 （2）DNA 提取 步驟如下 ： 1）將 1 ml 無(wú)水乙醇 1 ml 氨水和 1 ml 石油醚分別加入到 5 ml 人工污染金黃色葡萄球菌的全脂乳 脫脂乳和奶酪均質(zhì)液中，混勻。 2） 混合物以 12 000X g，離心 10 min。棄去上清液，沉淀用 300 μl 10 mmol·L-1TE（pH 7.8）溶解后，

50、加入 5 μl 10 mg·ml-1溶葡萄球菌酶 37 攝氏度溫育 1 h，期間不斷劇烈振蕩。然后加入 50 μl 10%的 SDS 煮沸 5min。 3）將等體積的氯仿加入上述混合液中，充分振蕩混勻， 17 000 Xg 離心 10 min 棄沉淀，保留上清液。 4）將上清液移入一新的離心管中，用 0.1 倍體積 2.5 mol·L-1乙酸銨 （pH 5.4 ），2.5 倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇和 5 μl 10 mg·ml-1糖原沉淀 DNA 混合物 17 000g 離心 20 min。 DNA 沉淀干燥后用 100 μl 滅菌雙蒸水溶解，備用。 （3）PCR 引物序列引自文獻(xiàn)[1， 4]

51、 由大連寶生物公司合成 正向引物 5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′ 目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 279 bp 反向引物 5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′ PCR 反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系 50 μl 包括 5 μl10×PCR buffer，4 μl dNTPs 混合物 0.5 μl 40 μmol 正向引物 0.5 μl 40 μmol 反向引物 0.25 μl （5 U·μl-1）Taq，模板 2 μl ，水 37.75 μl。PCR 擴(kuò)增程序 ：PCR 反 應(yīng)采用冷啟動(dòng) 。94 攝氏度預(yù)變性 4 min，再按 94攝氏度1min→52攝氏度 0.

52、5 min→72攝氏度 1.5 min 進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)，最后72攝氏度延伸 3.5 min。電泳檢測(cè)：取 5 μl PCR 產(chǎn)物在 2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并成像。 PCR 產(chǎn)物鑒定：大連寶生物工程公司對(duì) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 DNA 測(cè)序。 （4）PCR 方法與其它快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌方法比較 1）本研究利用 PCR 直接檢測(cè)乳品中金黃色葡萄球菌方法與兩種快速檢測(cè)致病性金黃色葡萄球 菌的培養(yǎng)基及 GB 4789.10–94 方法進(jìn)行比較，確定PCR 直接檢測(cè)乳品中金黃色葡萄球菌方法的特異性、符合率、靈敏度。2）所采用的兩種快速檢測(cè)致病性 金黃色葡萄球菌的培

53、養(yǎng)基分別為：Petrifilm RSA.CountPlate 是由美國(guó) 3M 公司生產(chǎn)的薄膜型快速檢測(cè)金黃色葡萄葡萄球菌的計(jì)數(shù)平板；Baird-parker+RPF Agar 是由法國(guó)梅里埃公司研制生產(chǎn)的 Baird-parker 瓊脂加兔血漿纖維蛋白原的金黃色葡萄球菌檢測(cè)計(jì)數(shù)平板。這兩種快速檢測(cè)培養(yǎng)基的接種方法均按生產(chǎn)商所提供的使用說(shuō)明進(jìn)行操作。共檢測(cè)乳品 35 件，其中鮮牛奶20 件、 UHT 滅菌乳 5 件、奶粉 5 件、奶酪 5 件。將 4種檢測(cè)方法作對(duì)比，確定 PCR 直接檢測(cè)乳品中金黃色葡萄球菌方法的符合率、敏感性。計(jì)算公式分別為： 敏感性=真陽(yáng)性數(shù)/ （真陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù)）

54、符合率= （真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù)） /被檢總數(shù) 4.3.2 結(jié)果與分析 1. 引物特異性 從所有供試菌株中提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)引物特異性(圖1)。由圖1可知，只有金黃色葡萄球菌才可特異擴(kuò)增出靶基因，其余菌種均未擴(kuò)增出任何產(chǎn)物。因此該引物特異性強(qiáng)，可用于PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌。 金黃色葡萄球菌和非金黃色葡萄球菌 PCR 反應(yīng)結(jié)果 2.PCR 檢測(cè)乳品中人工污染的金黃色葡萄球菌 由圖 2 可知，除了含 100CFU/ml 金黃色葡萄球菌的全脂乳、脫脂乳、奶酪均質(zhì)液樣品外，其它人工污染的樣品（含 101~108CFU/ml 金黃色葡萄球菌）均成功檢測(cè)出了金黃色葡萄球菌。由于奶

55、酪中脂肪含量比較高，采用本方法雖可移除大部分的抑制因子，但可能仍有少量抑制因子存在，影響了 PCR 擴(kuò)增，所以圖 2-C 的電泳帶不甚清晰 由表 2 可知，全脂乳和脫脂乳的檢出限為 10CFU/ml 奶酪均質(zhì)液的檢出限為 10 CFU/ml 。因?yàn)楸驹囼?yàn)將 20 g 奶酪經(jīng)研磨后與 90 ml 的 2%檸檬酸鈉溶 液混合成 110 ml 的奶酪均質(zhì)液，進(jìn)行人工污染，然后進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。因此，經(jīng)換算奶酪中金黃色葡萄球菌的檢出限為 55 CFU/g （10 CFU/ml 110 ml/20 g）。 人工污染后乳及乳制品中 PCR 檢測(cè)金黃色葡萄球菌的檢出限 樣品 Samples 菌的

56、濃度 Concentration (CFU/ml) 108 107 106 105 104 103 102 101 100 全脂乳 Whole milk + + + + + + + + — 脫脂乳 Skim milk + + + + + + + + — 奶酪均質(zhì)液 Cheese + + + + + + + + — 人工污染的全脂乳（A）、脫脂乳（B）、奶酪均質(zhì)液(C)中金黃色葡萄球菌 PCR 檢測(cè)結(jié)果 3. PCR產(chǎn)物鑒定 大連寶生物工程公司對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序。通過(guò)序列測(cè)定可知，PCR擴(kuò)

57、增產(chǎn)物DNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道的靶基因序列的同源性達(dá)99.6%，從而證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增產(chǎn)物(數(shù)據(jù)略)。 4. PCR方法與其它檢測(cè)金黃色葡萄球菌方法比較 為了驗(yàn)證本檢測(cè)方法對(duì)實(shí)際乳品檢測(cè)的效果，本研究檢測(cè)了從超市購(gòu)買的UHT滅菌乳、奶粉、奶酪和鮮牛奶等樣品，共計(jì)35件。該檢測(cè)方法同時(shí)與GB 4789.10-94方法及兩種快速檢測(cè)致病性金黃色葡萄球菌測(cè)試片比較。檢測(cè)結(jié)果(表3)表明，PCR方法的敏感性為100%，符合率為94.3%；Petrfilm RSACount Plate方法的敏感性為100%，符合率為97.1%；Baird-parker+RPF Agar方法的敏感性為10

58、0%，符合率為97.1%。 PCR方法與Petrfilm RSA. Count Plate方法和Baird-parker+RPF Agar方法的敏感性相同，檢出率均高于這兩種方法，但符合率略低于這兩種方法，分析其原因可能是因?yàn)镻CR方法靈敏度高，且有時(shí)不能區(qū)分樣品中的死菌與活菌所致。 PCR方法敏感性、特異性、符合率 樣品Samples 總數(shù) Total PCR Petrfilm RSA. Count Plate Baird-Parker + RPF Agar 國(guó)標(biāo)法 Cultivation method + — + — + — + — 鮮牛奶Mil

59、k 20 20 0 20 0 20 0 20 0 UHT乳 UHT milk 5 1 4 0 5 0 5 0 5 奶粉 Powdered milk 5 0 5 0 5 0 5 0 5 奶酪 Cheese 5 1 4 1 4 1 4 0 5 合計(jì) Total 35 22 13 21 14 21 14 20 15 檢出率 Detection rate (% ) 62.9 60 60 57.1 敏感性 Sensitivity (%) 100 100 10

60、0 符合率 Accordance rate (%) 94.3 97.1 97.1 Petrfilm RSA. Count plate 及 Baird-parker+RPFAgar 都在樣品接種后 28~ 30 h 觀察結(jié)果，不必再做證實(shí)試驗(yàn)，而 Baird-parker Agar 檢測(cè)，須在接種后 48 h觀察平板，并挑取可疑菌落轉(zhuǎn)到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，再經(jīng)18 ~24 h 后做血漿凝固酶或耐熱 DNA 酶試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)，前后須 80 h。美國(guó) 3M 公司生產(chǎn)的 Petrifilm RSA. Count Plate 培養(yǎng)基和法國(guó)梅利埃公司生產(chǎn)的Baird-

61、Parker +RPF Agar 培養(yǎng)基檢測(cè)乳品中的金黃色葡萄球菌，與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法相比，時(shí)間可縮短一半，但檢測(cè)時(shí)間仍然較長(zhǎng)。而 PCR 方法從對(duì)樣品的處理到檢測(cè)結(jié)束約需 6 h ，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，該方法對(duì)于檢測(cè)乳及乳制品中金黃色葡萄球菌是一種快速、有效 的方法。該方法省略了樣品前增菌的過(guò)程，比目前采用的先增菌再進(jìn)行 PCR 檢測(cè)的方法，檢測(cè)時(shí)間可縮短12~24 h。更加符合快速檢測(cè)的要求。 4.3.3 討論 食品的成分極為復(fù)雜，有些成分為 PCR 反應(yīng)抑制因子，可導(dǎo)致 PCR 檢測(cè)靈敏度的下降，食品中的脂肪成分被認(rèn)為是降低 PCR 檢測(cè)靈敏度的主要因素之一。Wilson 等利用 PC

62、R 從脫脂乳中檢測(cè)出105CFU/ml 的金黃色葡萄球菌，靈敏度較低，可能是由于提取的 DNA 中含有 PCR 反應(yīng)抑制因子或是 PCR反應(yīng)條件沒有優(yōu)化到最佳所致。Mclauchlin 等報(bào)道從奶酪中提取的 DNA 中含有 PCR 反應(yīng)抑制因子，影響 PCR 檢測(cè)。Lantzetal 等利用多重 PCR 技術(shù)檢測(cè)豬 肉樣品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，該方法對(duì)樣品進(jìn)行增菌后，使檢測(cè)靈敏度達(dá)到 102CFU/ml 。Jinneman等利用多重 PCR 擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)原料奶、牛肉等樣品中 E coli O157:H7的 DNA 也是利用增菌來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度，雖然增菌提高了檢測(cè)靈敏度，但也延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間

63、，一般可延長(zhǎng) 12~24 h。 本研究無(wú)需增菌，直接從污染金黃色葡萄球菌的乳品中提取 DNA，利用 PCR 技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌的 nuc 基因進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)該菌。該方法可直接從人工污染的全脂奶、脫脂奶和奶酪中檢測(cè)出金黃色葡萄球菌，全脂奶檢出限為 10 CFU/ml 、脫脂奶檢出限亦為 10 CFU/ml 、奶酪的最低檢出限 55 CFU/g，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在 6 h 內(nèi)完成，比目前普遍采用的先增菌再進(jìn)行 PCR 檢測(cè)的方法縮短了 12~ 24 h。其檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于導(dǎo)致食物中毒所需的金黃色葡萄球菌數(shù)。該方法對(duì)于檢測(cè)乳及乳制品中金黃色葡萄球菌是一種快速、有效的方法，而且還可以用來(lái)監(jiān)測(cè) HAC

64、CP 的危害分析關(guān)鍵控制點(diǎn)，以監(jiān)控在牛奶的收集過(guò)程以及產(chǎn)品加工后金黃色葡萄球菌的污染情況。但在對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)中還無(wú)法區(qū)分樣品中的死菌與活菌，且需要專門的儀器設(shè)備和專業(yè)人員操作，此外在推廣 PCR 方法時(shí)還應(yīng)盡量完善 PCR 檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)，便于其推廣使用。 4.4商業(yè)化快速檢測(cè)方法案例分析 一種新的快速檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用性主要是通過(guò)與傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法進(jìn)行對(duì)比而得出。本章通過(guò)將金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)法與傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法（國(guó)標(biāo)法）進(jìn)行對(duì)比，確定該快速檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏性、與傳統(tǒng)檢測(cè)方法的相關(guān)性，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。 4.4.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備 1.試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌來(lái)

65、自于吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院的菌種保藏處。使用時(shí)將其用營(yíng)養(yǎng)瓊脂傳代培養(yǎng)兩次后，接種于 LB 培養(yǎng)基中于 37℃、120rmp 條件下振蕩培養(yǎng) 18h-24h 后用無(wú)菌生理鹽水中做 10 倍系列稀釋，得到濃度為 101~108cfu/ml 的金黃色葡萄球菌菌懸液。以上操作于無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。 2. 試驗(yàn)儀器 試驗(yàn)儀器表 儀器名稱 型號(hào) 生產(chǎn)公司 WKJ-II 型微生物快速檢測(cè)儀 本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā) 手提式壓力蒸汽消毒器 YXQ-280MD 嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司 垂直流超凈工作臺(tái) ZHJH-C1214B 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司 全溫立式振蕩培養(yǎng)箱 HZQF 型

66、 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司 臺(tái)式高速離心機(jī) TGL-16G 上海安亭科學(xué)儀器廠 紫外-可見分光光度計(jì) TU-1810 型 北京普西通用有限公司 電子天平 GB 303 METTLER TOLEDO Instr（上海） Ltd 可調(diào)式移液器 —— 熱電（上海）儀器有限公司 冰箱 TQT-115 廣東科龍電器股份有限公司 水浴鍋 DK-98-II 蘇州江東精密儀器有限公司 酸度計(jì) PB-10 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司 試驗(yàn)用器具還包括玻璃棒、培養(yǎng)皿、棉花、紗布、載玻片、酒精燈、接種環(huán)、 移液槍頭、燒杯、試管、注射器、漏斗、錐形瓶、量筒、報(bào)紙、麻繩、擦鏡紙、 濾紙等。 3. 試驗(yàn)主要試劑及配制方法 液體 LB 培養(yǎng)基：需要時(shí)取 25.0g 溶于 1000ml 蒸餾水中，加熱溶化后調(diào)節(jié)至PH7.4±0.1，然后分裝于錐形瓶或者試管中于 121℃條件高壓滅菌 15min 備用。 1%亞碲酸鉀溶液：將 1g 亞碲酸鉀粉末溶于 100ml 水中，然后用孔徑為 0.45μm 的混脂低吸附水系膜過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌后備用。 卵黃亞碲